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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 본 연구실에서 우리나라 토양에서 분리한 PBSA 분해균 Burkholderia cepacia PBSA-7, Bacillus licheniformis PBSA-8 및 Burkholderia sp. PBSA9 (주와 김 2009)로부터 PBSA 분해효소 lipase를 암호화 하는 유전자(lip A)를 검출하여 염기서열을 분석하고, 다른 세균들의 lipase 유전자들과의 유전적 상동성을 비교 분석함으로써 우리나라 토양 세균의 PBSA 분해효소 유전자에 대한 정보를 제공하고자 한다.
- PBSA를 포함한 지방족 폴리에스테르의 분해는 미생물이 분비하는 분해효소에 의한 생분해 또는 화학적 가수분해에 의하여 이루어진다. 이에 본 연구에서는 본 실험실에서 선발한(주와 김 2009) PBSA 분해균의 genomic DNA를 주형으로 하여 PBSA 분해효소를 암호화하는 유전자로 보고된(Tokiwa and Jarerat 2003) lipase 유전자(lip A)를 암호화하는 부위를 증폭하기 위해 PCR을 수행하였다.
제안 방법
- 증균 배양액 1 mL를 1.5 mL microtube에 넣고 원심분리(13,000 rpm, 10분)하여 상층액을 제거한 후 남은 pellet을 수거하여 DNeasy & tissue kit (Qiagen, USA) 로 PBSA 분해균의 genomic DNA를 추출하였다.
- 증폭된 PBSA 분해효소를 암호화하는 유전자(lip A)는 gel extraction kit (Qiagen)로 정제한 후 TOPO TA cloning kit (Invitrogen)로 E. coli DH5α에 형질전환하였다.
- 반응액은 genomic DNA 100 ng, primer (25 pmol) 0.2 μL, dNTP mixture 2.0 μL, 10X PCR buffer 2.5 μL, DMSO 0.5 μL 및 Viva taq DNA polymerase (Vivagen, Korea)에 멸균증류수로 최종부피 25 μL를 만들어 사용 하였다.
- 추출한 genomic DNA로부터 PBSA 분해효소 유전자 (lip A)의 증폭에 사용한 PCR primer는 PDG-FF (5′-TTA CAC GCC CGC CAG CTT CAG-3′), PDG-MR (5′-GTC GAC AAC GTG CTG AAC AAG GC-3′), Blip-F (5′-ATG CGT CGT CAT TCA TTT TT-3′) 및 Blip-R (5′-TTA TTT CCC GCT GAA GGT CA-3′)으로 lipase gene을 타겟으로 하였다.
- GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystem, USA) 에서 pre-denaturation, (95oC, 5분), denaturation (95oC, 45초), annealing (62oC, 45초), extension (72oC, 2분)을 35회 실시한 후 extension (72oC, 10분)함으로써 PCR을 수행 하였다. Bacillus의 PBSA 분해효소 유전자는 55oC에서 30초 동안 annealing시켰다.
- Bacillus의 PBSA 분해효소 유전자는 55oC에서 30초 동안 annealing시켰다. 증폭된 DNA는 1% agarose gel (Takara, Japan)에서 전기영동(100 V, 50 min)을 하였다.
- 유전자의 삽입 여부는 ampicillin (50 μg mL-1, Sigma), X-gal (40 mg mL-1, Bioneer) 및 IPTG (100 mg mL-1, Bioneer)가 포함된 LB 평판배지에서 생장한 흰색 콜로니를 선발하여 Miniprep kit (Qiagen)로 분리된 plasmid DNA를 통해 확인하였다. 정제된 DNA를 제한효소 EcoR I로 37�C에서 4시간 처리하여 전기영동 상에서 최종 확인하여 (주) 마크로젠에서 염기서열을 분석한 후 GenBank의 Pseudomonas와 Bacillus lipases를 암호화하는 유전자들과 비교∙분석하였다. T-Coffee program (Poirot et al.
- 정제된 DNA를 제한효소 EcoR I로 37�C에서 4시간 처리하여 전기영동 상에서 최종 확인하여 (주) 마크로젠에서 염기서열을 분석한 후 GenBank의 Pseudomonas와 Bacillus lipases를 암호화하는 유전자들과 비교∙분석하였다. T-Coffee program (Poirot et al. 2003)을 사용하여 본 연구에서 증폭한 lipases 유전자 및 Pseudomonas와 Bacillus lipases 유전자들과의 염기서열을 아미노산으로 치환∙정렬하고 NCBI의 BLAST 2 SEQUENCES를 통해 유전자들 간의 유전적 상동성을 조사하였다.
- 우리나라 토양으로부터 분리된(주와 김 2009) poly (butylene succinate-co-butylene adipate; PBSA) 분해균 Burkholderia cepacia PBSA-7, Bacillus licheniformis PBSA8 및 Burkholderia sp. PBSA-9에서 PBSA 분해효소를 암호화하는 유전자를 분석하였다. PCR을 수행하여 B.
- 유전자의 삽입 여부는 ampicillin (50 μg mL-1, Sigma), X-gal (40 mg mL-1, Bioneer) 및 IPTG (100 mg mL-1, Bioneer)가 포함된 LB 평판배지에서 생장한 흰색 콜로니를 선발하여 Miniprep kit (Qiagen)로 분리된 plasmid DNA를 통해 확인하였다.
- 2, 3 및 4에 제시하였다. 본 연구에서 PCR로 증폭한 PBSA 분해효소 유전자를 기초로 분석된 아미노산 서열 내에서 Chihara-Siomi et al. (1992)이 보고하였던 Pseudomonas lipases의 lipase box인 Gly-X1-Ser-X2-Gly를 확인하였다.
성능/효과
- licheniformis PBSA-8은 약 600 bp의 크기를 가지는 절편이었다. 이로부터 본 연구에 사용된 세 균주는 모두 PBSA 분해효소로서 lipase를 보유하는 것이 확인되었다.
- B. cepacia PBSA-7의 PBSA 분해효소 유전자는 Jaeger 와 Arpigny (1999)에 의해 분류된 lipase subfamily I-1에 속하는 lipases와 36~40%, subfamily I-2 lipases와는 82~92%의 높은 상동성을 나타내었다. 특히 Burkholderia cepacia lipase와는 92%로 가장 높은 유전적 상동성을 나타내었으나 subfamily I-1 lipases에 속하는 Pseudomonas fluorescens lipase와는 상동성을 거의 보이지 않는 것으로 나타났다.
- Burkholderia sp. PBSA-9의 PBSA 분해효소 유전자도 subfamily I-1 lipases와 35~37%, subfamily I-2 lipases와는 83~94%의 높은 상동성을 보였다. 그러나 subfamily I-1 lipases에 속하는 lipase 중 Pseudomonas fluorescens lipase와는 유전적 상동성을 보이지 않았으며, 이는 B.
- PBSA-9의 PBSA 분해효소 유전자도 subfamily I-1 lipases와 35~37%, subfamily I-2 lipases와는 83~94%의 높은 상동성을 보였다. 그러나 subfamily I-1 lipases에 속하는 lipase 중 Pseudomonas fluorescens lipase와는 유전적 상동성을 보이지 않았으며, 이는 B. cepacia PBSA-7의 PBSA 분해효소 유전자와 매우 유사한 결과이다. 이에 B.
- 이로부터 우리나라 토양에서 분리된 PBSA 분해균 Burkholderia cepacia, Bacilllus licheniformis와 Burkholderia sp.는 PBSA 분해효소 암호화 유전자로써 염기서열 내에 lipase box를 보유하고 있는 lip A 유전자를 가지고 있으며, 이들 유전자는 기존에 알려진 lipases와 64% 이상의 높은 유전적 상동성을 보이며, 높게는 80% 이상의 유전적 상동성을 보이는 것으로 분석되었다.
- cepacia PBSA-7과 Burkholderia sp. PBSA-9는 약 1.5 Kb, B. licheniformis PBSA-8은 약 600 bp의 lipase 유전자(lip A) 절편을 가지는 것을 확인하였다. 세 균주 모두에서 유전자의 염기서열 내 lipase box인 Gly-X1-SerX2-Gly와 Ala-X1-Ser-X2-Gly가 존재하였다.
- 세 균주 모두에서 유전자의 염기서열 내 lipase box인 Gly-X1-SerX2-Gly와 Ala-X1-Ser-X2-Gly가 존재하였다. B. cepacia PBSA-7의 PBSA 분해효소 유전자는 family I-1 lipases와 36~40%, family I-2 lipases와는 82~92%의 높은 유전적 상동성을 보였다. 또한 B.
- cepacia PBSA-7의 PBSA 분해효소 유전자는 family I-1 lipases와 36~40%, family I-2 lipases와는 82~92%의 높은 유전적 상동성을 보였다. 또한 B. licheniformis PBSA-8의 PBSA 분해효소 유전자는 subfamily 1-4 lipases와 64~65%의 유전적 상동성을 나타내었으나, subfamily 1-5에 속하는 lipase들과는 거의 유전적 상동성이 없는 것으로 나타났다. Burkholderia sp.
- Burkholderia sp. PBSA-9의 PBSA 분해효소 유전자도 family I-1 lipases와 35~37%, family I-2 lipases와는 83~94%로 높은 유전적 상동성을 보여 B. cepacia PBSA-7의 PBSA 분해효소 유전자와 유사한 결과를 보 였다.
- cepacia PBSA-7의 PBSA 분해효소 유전자는 Jaeger 와 Arpigny (1999)에 의해 분류된 lipase subfamily I-1에 속하는 lipases와 36~40%, subfamily I-2 lipases와는 82~92%의 높은 상동성을 나타내었다. 특히 Burkholderia cepacia lipase와는 92%로 가장 높은 유전적 상동성을 나타내었으나 subfamily I-1 lipases에 속하는 Pseudomonas fluorescens lipase와는 상동성을 거의 보이지 않는 것으로 나타났다.
- B. licheniformis PBSA-8의 PBSA 분해효소 유전자의 경우에는 subfamily I-4 lipases와 64~65%의 비교적 높은 유전적 상동성을 보였으나, subfamily I-5에 속하는 lipases와는 상동성이 거의 없는 것으로 나타났다. 이에본 연구에서 분석한 B.
- licheniformis PBSA-8의 PBSA 분해효소 유전자의 경우에는 subfamily I-4 lipases와 64~65%의 비교적 높은 유전적 상동성을 보였으나, subfamily I-5에 속하는 lipases와는 상동성이 거의 없는 것으로 나타났다. 이에본 연구에서 분석한 B. lichenifofrmis PBSA-8의 PBSA 분해효소 유전자는 subfamily 1-4 lipases와 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났다.
- cepacia PBSA-7과 Burkholderia sp. PBSA-9 PBSA 분해효소 유전자 사이의 유전적 상동성을 비교하여 둘 사이에도 73%의 높은 유전적 상동성이 있음을 확인하였다.
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