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문제 정의
- 이러한 TBT 노출에 따른 정소의 기능 저하가 단순히 Leydig 세포 내 스테로이드 합성효소의 활성 억제로 인한 것인지 아니면 다른 기전에 의한 것인지 명확히 밝혀져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 Leydig 세포 또한 TBT에 의해 지방세포로의 분화가 유도될 것이며, 이에 따른 세포자연사가 진행될 것이라고 가정하고, 이를 증명하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 흰쥐에 TBT를 투여한 후 정소 내 세포자연사를 확인하고 분리된 간질세포에서 지방세포 유도 유전자와 세포자연사 관련 유전자의 발현을 조사함으로써 TBT 노출에 따른 정소 내 간질세포의 지방세포 분화 유도와 세포자연사에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
- 그러나 이러한 TBT가 체내 다른 세포에서와 마찬가지로 정소 내 간질세포도 지방세포로 분화 유도시킬 수 있는지, 또한 이러한 지방세포로의 분화가 간질세포의 세포자연사와 연관이 있는지 그 기전에 대해 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 생쥐 정소 내 간질세포를 대상으로 TBT에 의한 지방세포 분화가 일어나는지, 아울러 TBT가 간질세포의 세포자연사에는 어떤 영향을 미치는지를 조사하였다.
- 그러나 아직 TBT에 의한 정소 내 세포자연사가 어떤 기전으로 유도되는지 명확히 밝혀져 있지 않다. 이에 본 연구에서는 TBT 투여 후 정소로부터 분리된 간질세포에서 세포자연사 관련 유전자 발현을 조사하였다. TNF-RSF1A는 TNFα 수용체(TNFR1) 유전자로 항세포자연사 단백질인 BCL2-associated athanogene 4(BAG4/SODD)와 전환 단백질인 TRADD 및 TRAF2와 상호작용하면서 세포자연사를 조절하는 것으로 알려져 있다(Hsu et al.
- 따라서 본 연구에서는 Leydig 세포 또한 TBT에 의해 지방세포로의 분화가 유도될 것이며, 이에 따른 세포자연사가 진행될 것이라고 가정하고, 이를 증명하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 흰쥐에 TBT를 투여한 후 정소 내 세포자연사를 확인하고 분리된 간질세포에서 지방세포 유도 유전자와 세포자연사 관련 유전자의 발현을 조사함으로써 TBT 노출에 따른 정소 내 간질세포의 지방세포 분화 유도와 세포자연사에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- PBS로 2번 세척한 후 DAPI로 2차 염색을 시행하였다. PBS로 2번 세척한 후 형광 mounting 용액으로 봉입한 후 형광 현미경하에서 세포자연사가 일어난 세포를 조사하였다.
- Detection of the apoptotic cells in the testes after TBT exposure. Paraffin sections of rat testes were stained by using TUNEL assay kit and counterstained with DAPI after TBT exposure for 7 days. Apoptotic cells stained by TUNEL show as green.
- TBT 투여 후 8일째에 체중을 측정한 다음, 흰쥐를 희생시켜 정소와 정소 주변의 지방세포를 얻어 각각의 무게를 측정하였다. 생식선지수(gonad somatic index)는 정소 무게를 체중으로 나눈 값에 100을 곱하여 산출하였다.
- TBT 투여 후 간질세포 내 지방세포 분화 관련 유전자 발현의 증가로 인하여 간질세포가 지방세포로 분화하였는지를 확인하기 위하여 중성지질을 염색하는 BODIPY로 정소 절편을 염색하고 관찰하였다. BODIPY 염색 결과, sesame oil만을 투여한 대조군에서는 BODIPY에 의해 염색된 세포들을 관찰할 수 없었으나, TBT를 투여한 군에서는 세정관 사이에 존재하는 간질세포들이 염색된 것을 확인할 수 있었다.
- TBT 투여 후 정소에서 세포자연사가 일어난 세포들을 확인하기 위하여 TUNEL 방법으로 정소 절편을 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다. TUNEL 염색 결과, sesame oil만 투여한 대조군에서는 염색된 세포들을 찾아볼 수 없었으나(Fig.
- TBT 투여 후 정소에서 지방세포 분화가 일어났는지를 확인하기 위하여 BODIPY로 정소 절편을 염색하였다. BODIPY에 의해 염색된 세포 내 지방은 형광 현미경하에서 빨간색 형광을 나타낸다(Fig.
- 샘타코 바이오코리아에서 공급받은 3주령 된 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 서울여자대학교 동물 사육실에서 적응시킨 후 그룹 당 5마리씩 총 세 개의 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다. TBT(Tributyltin acetate; Aldrich Chemical company. Inc, USA)를 sesame oil에 녹여 사용하였으며, 투여된 양은 체중당 1 ㎎(1 ㎎/㎏)과 10 ㎎(10 ㎎/㎏) 농도로 7일간 매일 경구 투여하였다. 대조군으로 sesame oil(Sigma, USA) 만을 7일간 투여하였다.
- TBT가 정소 내 간질세포의 세포자연사와 연관이 있나 알아보기 위해 분리된 간질세포에서 세포자연사 관련 유전자 발현을 real-time PCR 방법으로 확인하였다. TNFRSF1A와 TNFSF10 유전자의 발현이 대조군에 비해 TBT 투여군에서 농도 의존적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- TBT에 의한 간질세포의 지방세포로의 분화를 확인하기 위해 BODIPY(Invitrogen, USA) 염색을 수행하였다. 정소의 냉동 절편을 4% paraformaldehyde(Sigma, USA)로 5분간 고정시키고, PBS로 세척 후 5분간 방치하였다.
- , USA)을 이용하여 측정하였다. Total RNA 3㎍을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 즉, Total RNA 3 ㎍과 Oligo dT 2.
- Inc, USA)를 sesame oil에 녹여 사용하였으며, 투여된 양은 체중당 1 ㎎(1 ㎎/㎏)과 10 ㎎(10 ㎎/㎏) 농도로 7일간 매일 경구 투여하였다. 대조군으로 sesame oil(Sigma, USA) 만을 7일간 투여하였다.
- 1). 또한 TBT가 부정소 지방의 무게에 어떤 영향을 미쳤는지 알아보기 위하여 투여 후 8일째에 흰쥐를 희생시켜 정소와 부정소 지방을 얻어 무게를 측정하였다. 부정소 지방의 무게는 대조군과 비교해서 TBT를 투여한 군에서 투여된 TBT 농도 의존적으로 증가하였다(Fig.
- 먼저 TBT에 대한 전반적인 독성을 평가하기 위하여 TBT 투여에 따른 체중 변화를 조사하였다. TBT 투여 후 7일간 체중의 변화를 조사한 결과, TBT을 투여한 실험군에서 약간의 체중에 증가를 보였으나, sesame oil만 투여한 대조군과 비교해서 유의한 차이는 보이지 않았다.
- PBS로 3번 세척한 후 DAPI(Invitrogen, USA)로 5분간 염색시켰다. 증류수로 세척 후 형광 mounting 용액(fluorescent mounting media, Dako, Denmark)으로 봉입한 후 형광 현미경(Axioskop2+, Carl Zeiss, USA) 하에서 지방세포를 확인하였다.
- Tube에 남아 있는 75% ethanol을 제거하고 DEPC(TaKaRa, Japan) 물을 넣어준 상태로 약 1분간 섞은 후 냉동 보관하였다. 추출한 total RNA의 양은 Nanodrop(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)을 이용하여 측정하였다. Total RNA 3㎍을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 반응시킨 시료에 10X RT buffer 7 ㎕, dNTP 2 ㎕, mixture 1 ㎕와 DEPC 물 10 ㎕ 넣은 다음, 37℃에서 1시간 반응 후 72℃에서 15분 반응시켰다. 합성된 cDNA를 template DNA로 하여 각 특정 primer와 SYBR GreenⅠ(Roche, Switzerland)을 넣고 Light Cycler 480(Roche, Switzerland)으로 특정 유전자의 발현량을 분석하였다. 대조유전자로는 18s 유전자를 사용하였고, 18s를 기준으로 다른 유전자의 상대적인 발현량을 계산하였다.
대상 데이터
- 각 실험군 당 다섯 마리의 흰쥐를 사용하였으며, 무게와 모든 유전자의 발현 정도는 Mean±SEM로 표시하였다.
- 합성된 cDNA를 template DNA로 하여 각 특정 primer와 SYBR GreenⅠ(Roche, Switzerland)을 넣고 Light Cycler 480(Roche, Switzerland)으로 특정 유전자의 발현량을 분석하였다. 대조유전자로는 18s 유전자를 사용하였고, 18s를 기준으로 다른 유전자의 상대적인 발현량을 계산하였다. 유전자 특이적 primer 서열은 다음과 같다.
- 샘타코 바이오코리아에서 공급받은 3주령 된 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 서울여자대학교 동물 사육실에서 적응시킨 후 그룹 당 5마리씩 총 세 개의 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다. TBT(Tributyltin acetate; Aldrich Chemical company.
데이터처리
- 각 실험군 당 다섯 마리의 흰쥐를 사용하였으며, 무게와 모든 유전자의 발현 정도는 Mean±SEM로 표시하였다. 통계학적 유의성 검정은 student t-test와 one-way ANOVA, Tukey test 방법을 사용하였으며, 대조군과 실험군을 비교하여 p 값이 0.05보다 작은 경우를 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
- TBT 투여 후 정소 내 세포자연사를 확인하기 위하여 terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP-digoxigenin nick end-labeling(TUNEL) 방법을 사용하였다. 정소의 파라핀 절편을 xylene에 3분간 넣어 두었다가 100% 알코올 용액에 3분간 넣어 둔 다음 95% 알코올, 80% 알코올에 각각 3분씩 차례로 반응시키고 PBS로 2번 세척해 주었다.
- TBT에 의해 정소에서 세포자연사가 증가한다는 것은 이미 잘 알려진 사실이나, 본 실험에서도 정소 내 세포자연사가 간질세포에서 일어나는지를 확인하기 위해 TUNEL 방법으로 정소 절편을 염색하였다. TUNEL 염색 결과, 세정관 사이에 존재하는 간질세포에서 염색되는 것을 관찰할 수 있었고, 염색된 세포의 수는 투여된 TBT 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다.
성능/효과
- (A) The epidydimal fat weights were significantly increased in 10 ㎎/㎏ TBT treated rats compared to sesame oil treated rats. (B) The gonadsomatic index (GSI) of the rats treated with 10 ㎎/㎏ TBT was significantly decreased compared to the weights of testes in the control rats treated with sesame oil. Data are represented as Mean±SEM.
- 4). BODIPY 염색 결과, sesame oil만을 투여한 대조군에서는 BODIPY에 의해 염색된 세포들을 관찰할 수 없었으나(Fig. 4a, 4c), TBT 10 ㎎을 투여한 군에서는 세정관 사이사이 간질세포들에서 빨간색 형광으로 염색된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4b, 4d).
- TBT 투여 후 간질세포 내 지방세포 분화 관련 유전자 발현의 증가로 인하여 간질세포가 지방세포로 분화하였는지를 확인하기 위하여 중성지질을 염색하는 BODIPY로 정소 절편을 염색하고 관찰하였다. BODIPY 염색 결과, sesame oil만을 투여한 대조군에서는 BODIPY에 의해 염색된 세포들을 관찰할 수 없었으나, TBT를 투여한 군에서는 세정관 사이에 존재하는 간질세포들이 염색된 것을 확인할 수 있었다. 최근에 흰쥐와 쏨뱅이를 대상으로 TBT를 노출시킨 후 정소 내 Sertoli 세포를 관찰한 결과, 지질 소적이 증가하였다는 보고가 있었다(Ki- shta et al.
- 먼저 TBT에 대한 전반적인 독성을 평가하기 위하여 TBT 투여에 따른 체중 변화를 조사하였다. TBT 투여 후 7일간 체중의 변화를 조사한 결과, TBT을 투여한 실험군에서 약간의 체중에 증가를 보였으나, sesame oil만 투여한 대조군과 비교해서 유의한 차이는 보이지 않았다. 반면, 부정소 주위에 붙어있는 지방의 무게는 10 ㎎ TBT를 투여한 군에서 유의하게 증가하였다.
- TBT 투여에 따른 체중의 변화를 알아보기 TBT를 투여하기 전에 체중을 측정하였고, 이후 7일간 매일 측정한 결과, TBT을 투여한 실험군에서 약간의 체중에 증가를 보였으나, sesame oil만 투여한 대조군과 비교해서 유의한 차이는 보이지 않았다(Fig. 1). 또한 TBT가 부정소 지방의 무게에 어떤 영향을 미쳤는지 알아보기 위하여 투여 후 8일째에 흰쥐를 희생시켜 정소와 부정소 지방을 얻어 무게를 측정하였다.
- TBT가 정소 내 간질세포의 세포자연사와 연관이 있나 알아보기 위해 분리된 간질세포에서 세포자연사 관련 유전자 발현을 real-time PCR 방법으로 확인하였다. TNFRSF1A와 TNFSF10 유전자의 발현이 대조군에 비해 TBT 투여군에서 농도 의존적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
- TBT 투여 후 정소에서 세포자연사가 일어난 세포들을 확인하기 위하여 TUNEL 방법으로 정소 절편을 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다. TUNEL 염색 결과, sesame oil만 투여한 대조군에서는 염색된 세포들을 찾아볼 수 없었으나(Fig. 5a), TBT을 투여한 실험군에서는 간질세포들에서 염색된 것을 확인할 수 있었다. 아울러 염색된 세포의 수는 투여된 TBT 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다(Fig.
- TBT에 의해 정소에서 세포자연사가 증가한다는 것은 이미 잘 알려진 사실이나, 본 실험에서도 정소 내 세포자연사가 간질세포에서 일어나는지를 확인하기 위해 TUNEL 방법으로 정소 절편을 염색하였다. TUNEL 염색 결과, 세정관 사이에 존재하는 간질세포에서 염색되는 것을 관찰할 수 있었고, 염색된 세포의 수는 투여된 TBT 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다. 최근 생쥐를 대상으로 한 실험에서 TBT를 노출시킬 경우 정소 내 생식세포와 Leydig 세포의 세포자연사가 증가하는 것으로 보고하고 있다(Kim et al.
- 2A). 반면, 정소의 무게는 대조군에 비해 TBT 투여한 군에서 농도 의존적으로 감소하고 있는 것을 확인할 수 있었고, 체중에 따른 상대적인 생식소의 무게를 나타내는 생식선지수(GSI) 또한 대조군에 비해 TBT 처리군에서 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 2B).
- 즉, TRAIL은 사멸 수용체인 DR4(TRAILRI)와 DR5(TRAILRII)와 결합하면서 caspase-8를 활성화시키고, procaspase-3, -6, -7으로 이어지는 신호전달 과정을 통해 세포자연사를 유도한다. 본 연구 결과, TNFRSF1A와 TNFSF10 유전자 모두 TBT 투여에 의해 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 투여된 TBT가 간질세포에서 TNF 수용체와 TRAIL을 증가시킴으로써 세포자연사를 유도할 수 있음을 의미한다.
- 본 연구 결과들을 종합해 볼 때, 수컷 흰쥐에 투여된 TBT는 정소의 간질세포 내 지방세포 분화 유도 유전자, PPARγ, aP2, Perilipin 및 CD36 mRNA의 발현을 증가시키면서 간질세포의 지방세포로의 분화를 촉진시켰고, 아울러 세포자연사 유도 유전자인 TNF 수용체와 TRAIL의 발현을 증가시키면서 세포자연사를 유발시키는 것으로 나타났다.
- 5a), TBT을 투여한 실험군에서는 간질세포들에서 염색된 것을 확인할 수 있었다. 아울러 염색된 세포의 수는 투여된 TBT 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다(Fig. 5b).
- , 2009). 이러한 결과는 TBT가 Sertoli 세포에서 지방세포 분화를 유도하는 것처럼 간질세포에서도 지방세포 분화를 유도할 수 있을 것으로 사료된다. 즉, 본 실험에서 흰쥐에 투여된 TBT가 정소 내 간질세포에 작용하여 지방세포 분화 관련 단백질의 발현을 촉진시키고, 이로 인하여 간질세포 내 지질 생성이 증가한 것으로 보인다.
- 본 연구 결과, TNFRSF1A와 TNFSF10 유전자 모두 TBT 투여에 의해 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 투여된 TBT가 간질세포에서 TNF 수용체와 TRAIL을 증가시킴으로써 세포자연사를 유도할 수 있음을 의미한다.
- 이를 근거로 TBT 투여 후 정소 내 간질세포에서 지방세포 분화 유전자 발현을 real-time PCR 방법으로 분석한 결과, PPAR γ뿐 아니라 aP2, Perilipin, CD36 등 지방세포 분화 관련 유전자들의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 이상의 연구 결과들을 종합해 볼 때, 투여된 TBT가 정소 내 간질세포에 작용하여 PPARγ의 발현을 촉진시키고, 이로 인하여 지방세포 분화 관련 단백질인 aP2, Perilipin 및 CD36 mRNA 발현이 증가한 것으로 사료된다.
- 정소에서 분리된 간질세포에서 지방세포 분화 유전자 발현을 real-time PCR 방법으로 확인해 본 결과, TBT 투여군에서 지방세포 분화 관련 단백질인 PPARγ, aP2, Perilipin, CD36의 mRNA 발현이 TBT 농도 의존적으로 유의한 증가를 보였다(Fig. 3).
- 이러한 결과는 TBT가 Sertoli 세포에서 지방세포 분화를 유도하는 것처럼 간질세포에서도 지방세포 분화를 유도할 수 있을 것으로 사료된다. 즉, 본 실험에서 흰쥐에 투여된 TBT가 정소 내 간질세포에 작용하여 지방세포 분화 관련 단백질의 발현을 촉진시키고, 이로 인하여 간질세포 내 지질 생성이 증가한 것으로 보인다. 더욱이 TBT에 의해 정소 내 세포들이 지방세포로 분화하는 것은 간질세포의 섬유화(fibrosis)와 연관이 있는 것으로 보이며(Zhang et al.
- 한편, TBT 투여 후 정소의 무게는 감소하는 경향을 보였으며, 생식선지수(GSI)를 계산해 본 결과에서도 대조군에 비해 TBT 처리군에서 생식선지수가 유의하게 감소하는 것을 알 수 있었다. 이러한 정소 무게의 감소는 TBT 투여에 따른 정자 수의 감소가 주원인으로 생각되며, 기존에 발표된 논문에서 생쥐를 TBT에 노출시킬 경우 정자 형성 이상과 함께 정자 수가 감소하는 것으로 보고된 바 있다(Chen et al.
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