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문제 정의
- 다음으로 본 연구에서는 투여된 TBT가 흉선 내 세포자연사를 증가시키는 원인을 알아보고자 세포자연사 관련 유전자의 발현양을 조사하였다. TNFα와 TNFR1의 발현이 TBT 투여 후 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 이상의 본 실험결과와 기존에 발표된 연구결과들을 종합하여 볼 때, TBT는 흉선의 크기와 구조를 변화시키고, 아울러 흉선 내 세포자연사를 일으키면서 흉선의 기능을 억제시키는 것으로 판단할 수 있다. 이러한 TBT 투여에 따른 흉선 내 구조의 변화와 세포자연사의 증가가 어떤 기전으로 유발되는지를 알아보고자 T 세포 분화와 발달에 중요한 역할을 하는 흉선 내 상피세포의 기능을 조사하였다. 먼저, 기존에 알려진 바와 같이 TBT가 흉선 조직 내에서도 지방세포 분화를 유도하는지를 확인하기 위하여 지방세포 유도 관련 유전자와 흉선 상피세포 표지 유전자의 발현을 조사하였다.
- 이를 증명하기 위하여 본 연구에서는 흰쥐에 TBT를 투여한 후 흉선의 구조를 조사하고, 아울러 흉선에서 지방세포 유도 관련 유전자와 세포자연사 관련 유전자의 발현을 조사함으로써 TBT 노출에 따른 흉선의 기능 저하 기전을 밝히고자 하였다.
- , 2010). 이에 본 연구에서도 기존에 밝혀진 연구결과와 같이 TBT가 흉선에서도 지방세포 분화를 유도하면서 흉선 기능을 억제할 것이라고 가정하고, 흰쥐 흉선을 대상으로 TBT 투여 후 흉선 내에서 지방세포 분화가 일어나는지, 이에 따른 흉선의 기능이 감소하는지를 조사하였다.
- , 1991). 이에 본 연구에서도 투여된 TBT에 의해 흉선 내세포자연사가 증가하는지를 확인하였다. 흉선 절편을 이용하여 TUNEL 분석을 수행한 결과, 투여된 TBT 농도가 높을수록 흉선 내 세포자연사가 증가하는 것을 확인할 수 있었고, Annexin V 염색 후 유세포 분석기로 분석한 결과에서도 TBT 농도 의존적으로 세포자연사가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
가설 설정
- 이상의 보고된 결과들을 종합해 볼 때, TBT에 의한 면역 기능의 저하 원인을 TBT가 흉선 상피세포에 작용하여 지방 세포로의 전환을 유도하고, 이로 인하여 흉선기능이 떨어지기 때문에 일어나는 것으로 가정하였다. 이를 증명하기 위하여 본 연구에서는 흰쥐에 TBT를 투여한 후 흉선의 구조를 조사하고, 아울러 흉선에서 지방세포 유도 관련 유전자와 세포자연사 관련 유전자의 발현을 조사함으로써 TBT 노출에 따른 흉선의 기능 저하 기전을 밝히고자 하였다.
제안 방법
- 흉선 절편 위에 TUNEL reaction mixture(In Situ Cell Death Detection Kit, Roche, Switzerland)를 30 ㎕ 떨어뜨리고 37℃에서 1시간 반응시켰다. DAPI로 2차 염색을 시행하였고 증류수로 2번 세척한 후 봉입제로 봉입한 후 형광현미경(Axioskop2+, Carl Zeiss, Germany) 하에서 세포자연사가 일어난 세포를 확인하였다.
- T 세포 수가 1×106개가 되도록 취하여 1X binding buffer 500 ㎕에 AnnexinⅤ(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit, Sigma, USA) 5 ㎕와 Propidium Iodide(PI) 10 ㎕를 넣은 다음, 10분 동안 상온에서 배양한 후 유세포 분석기(CYTOMICS FC500, Beckman Coulter, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 대조군으로는 sesame oil만을 7일간 투여하였다. TBT 투여 후 8일째에 체중을 측정한 다음, 흰쥐를 희생시켜 흉선을 얻어 무게를 측정하고 T 세포수를 계수하였다. 생식선지수(gonad somatic index)는 흉선 무게를 체중으로 나눈 값에 100을 곱하여 산출하였다.
- TBT 투여 후 흉선의 구조 변화 , Carl Zeiss, Germany) 하에서 세포자연사가 일어난 세포를 확인하였다.
- 샘타코 바이오코리아에서 공급받은 3주령 된 Sprague-Dawley계 암컷 흰쥐를 서울여자대학교 동물 사육실에서 적응시킨 후 그룹 당 6마리씩 총 4개의 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다. TBT(Tributyltin acetate; Sigma, USA)를 sesame oil(Sigma, USA)에 녹여 사용하였으며, 투여된 양은 1 ㎎(1 ㎎/㎏), 10 ㎎(10 ㎎/㎏), 25 ㎎(25 ㎎/㎏) 농도로 7일간 경구 투여하였다. 대조군으로는 sesame oil만을 7일간 투여하였다.
- The body and thymic weights and the number of thymocytes after TBT treatment. Three week-old female rats were orally administrated with TBT 1, 10, and 25 ㎎/㎏ or sesame oil for 7 days daily. (A) The body weight was decreased in 25 ㎎/㎏ TBT treated rats, but showing no significant difference compared to sesame oil treated controls.
- , USA)을 이용하여 측정하였다. 각 조직으로 부터 준비된 RNA를 이용하여 reverse transcription PCR 방법으로 cDNA를 합성한 다음, 합성된 cDNA를 template DNA로 하여 각 특정 primer와 SYp GreenⅠ(Roche, Switzerland)을 넣고 Light Cycler 480(Roche, Switzerland)으로 특정 유전자의 발현양을 분석하였다. 대조유전자로는 18s 유전자를 사용하였고, 18s를 기준으로 다른 유전자의 상대적인 발현양을 계산하였다.
- TBT(Tributyltin acetate; Sigma, USA)를 sesame oil(Sigma, USA)에 녹여 사용하였으며, 투여된 양은 1 ㎎(1 ㎎/㎏), 10 ㎎(10 ㎎/㎏), 25 ㎎(25 ㎎/㎏) 농도로 7일간 경구 투여하였다. 대조군으로는 sesame oil만을 7일간 투여하였다. TBT 투여 후 8일째에 체중을 측정한 다음, 흰쥐를 희생시켜 흉선을 얻어 무게를 측정하고 T 세포수를 계수하였다.
- 먼저 TBT 투여에 따른 섭식과 체중의 변화를 평가하기 위하여 TBT 투여 후 매일 체중을 측정하였다. 흰쥐의 체중은 TBT 투여와 상관없이 정상적인 증가 양상을 보였다.
- 흉선 내 구조를 조사하기 위하여 흉선 절편을 hematoxylineosin으로 염색하였다. 먼저 흉선 절편을 xylene에 3분간 넣어두었다가 100%, 95%, 80% ethanol에 순서대로 3분씩 처리하였다. 증류수로 5분간 세척한 다음 hematoxylin에 1분 30초간 담가 염색하였다.
- 이러한 TBT 투여에 따른 흉선 내 구조의 변화와 세포자연사의 증가가 어떤 기전으로 유발되는지를 알아보고자 T 세포 분화와 발달에 중요한 역할을 하는 흉선 내 상피세포의 기능을 조사하였다. 먼저, 기존에 알려진 바와 같이 TBT가 흉선 조직 내에서도 지방세포 분화를 유도하는지를 확인하기 위하여 지방세포 유도 관련 유전자와 흉선 상피세포 표지 유전자의 발현을 조사하였다. 본 연구결과에서 지방세포 유도 관련 유전자로 알려진 PPARγ, aP2, CD36, PEPCK 모두 TBT 투여 후 유의하게 발현양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 염색된 조직은 95%과 100% ethanol에 5분간 처리한 후 xylene에 10분간 넣어두었다. 봉입제로 염색된 절편을 봉입한 후 광학현미경 하에서 관찰하였다.
- 2A). 이러한 흉선 크기의 변화가 흉선 내 구조에는 어떤 변화를 유발시켰는지를 확인하기 위하여 흉선 내부를 관찰하였다. 흉선 내 구조 변화를 알아보기 위하여 H&E 염색한 결과, 대조군에 비해 TBT를 투여한 군에서 흉선 수질과 피질의 경계가 뚜렷하지 않게 흩뜨려져 있음을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 시험관에 남아있는 75% ethanol을 제거하고 DEPC(TaKaRa, Japan) 용액 20 ㎕를 넣어준 상태로 약 1분간 섞은 후 냉동 보관하였다. 추출한 total RNA의 양은 Nano-drop(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)을 이용하여 측정하였다. 각 조직으로 부터 준비된 RNA를 이용하여 reverse transcription PCR 방법으로 cDNA를 합성한 다음, 합성된 cDNA를 template DNA로 하여 각 특정 primer와 SYp GreenⅠ(Roche, Switzerland)을 넣고 Light Cycler 480(Roche, Switzerland)으로 특정 유전자의 발현양을 분석하였다.
- 한편, TBT 투여에 따른 흉선 내 지방세포화 촉진이 흉선 상피세포의 기능을 감소시킬 수 있을 것으로 판단하고, 흉선 상피세포 표지 유전자인 EVA, KGF, AIRE, IL-7의 발현을 분석하였다. EVA(Epithelial V-like antigen)는 흉선 상피세포에서 발현되는 단백질로 흉선 내 T 세포의 발달 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Maria et al.
- 먼저 흉선 내 T 세포는 흉선 조직을 yellow mesh 위에서 갈아서 획득하였다. 획득한 T 세포는 RPMI+5% FBS 용액으로 세척한 후 trypan blue(Sigma, USA)로 염색하였고, 혈구계를 사용하여 T 세포의 생존율과 세포 수를 계수하였다. T 세포 수가 1×106개가 되도록 취하여 1X binding buffer 500 ㎕에 AnnexinⅤ(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit, Sigma, USA) 5 ㎕와 Propidium Iodide(PI) 10 ㎕를 넣은 다음, 10분 동안 상온에서 배양한 후 유세포 분석기(CYTOMICS FC500, Beckman Coulter, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 획득한 흉선에 Tri regent(RNA isoplus, TaKaRa, Japan) 300 ㎕를 첨가하고 조직분쇄기를 이용하여 분쇄하였다. 분쇄된 조직은 상온에서 5분간 방치하고 원심분리한 후(14,000rpm, 4℃, 20분) 상등액을 새 시험관에 옮겼다.
- 흉선 내 구조를 조사하기 위하여 흉선 절편을 hematoxylineosin으로 염색하였다. 먼저 흉선 절편을 xylene에 3분간 넣어두었다가 100%, 95%, 80% ethanol에 순서대로 3분씩 처리하였다.
- 이후 100% paraffin 용액에서 2시간 동안 포매한 후 파라핀 블록을 만들었다. 흉선 파라핀 블록은 박편절단기(RM2235, Leica, Germany)를 이용하여 두께 8 ㎛의 연속된 절편으로 만들었다.
- 획득된 흉선을 4% paraformaldehyde solution에서 15분 동안 고정시켰다. 흉선의 탈수를 위해 70%, 80%, 90%, 100% ethanol 용액에 순서대로 30분간 처리한 후 xylene에서 45분 동안 넣어 투명화 과정을 거치고, paraffin과 xylene을 1:1로 섞은 용액에 2시간 동안 처리하였다. 이후 100% paraffin 용액에서 2시간 동안 포매한 후 파라핀 블록을 만들었다.
대상 데이터
- 각 조직으로 부터 준비된 RNA를 이용하여 reverse transcription PCR 방법으로 cDNA를 합성한 다음, 합성된 cDNA를 template DNA로 하여 각 특정 primer와 SYp GreenⅠ(Roche, Switzerland)을 넣고 Light Cycler 480(Roche, Switzerland)으로 특정 유전자의 발현양을 분석하였다. 대조유전자로는 18s 유전자를 사용하였고, 18s를 기준으로 다른 유전자의 상대적인 발현양을 계산하였다. 유전자 특이적 primer 서열은 다음과 같다.
- 샘타코 바이오코리아에서 공급받은 3주령 된 Sprague-Dawley계 암컷 흰쥐를 서울여자대학교 동물 사육실에서 적응시킨 후 그룹 당 6마리씩 총 4개의 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다. TBT(Tributyltin acetate; Sigma, USA)를 sesame oil(Sigma, USA)에 녹여 사용하였으며, 투여된 양은 1 ㎎(1 ㎎/㎏), 10 ㎎(10 ㎎/㎏), 25 ㎎(25 ㎎/㎏) 농도로 7일간 경구 투여하였다.
데이터처리
- 각 실험군 당 6마리의 흰쥐를 사용하였으며, 무게와 모든 유전자의 발현 정도는 평균±표준오차로 표시하였다.
- 각 실험군 당 6마리의 흰쥐를 사용하였으며, 무게와 모든 유전자의 발현 정도는 평균±표준오차로 표시하였다. 통계학적 유의성 검정은 student t-test와 one-way ANOVA, Tukey test 방법을 사용하였으며, 대조군과 실험군을 비교하여 p값이 0.05보다 작은 경우를 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
- TBT 투여 후 흉선 내 세포자연사를 확인하기 위하여 terminaldeoxynucleotidyl-transferase (TdT)-mediated dUTPdigoxigeninnick end-labeling(TUNEL) 방법을 사용하였다. 흉선 절편은 xylene과 ethanol을 사용하여 파라핀을 제거한 후 PBS로 세척하였다.
성능/효과
- TBT 투여 후 흉선 내에서 세포자연사가 일어난 세포를 확인하기 위하여 TUNEL 방법으로 염색한 후 확인한 결과, 대조군에서는 세포자연사가 일어난 세포들(녹색으로 염색됨)을 거의 찾아볼 수 없었으나(Fig. 3a), TBT를 투여한 실험군에서는 투여된 TBT 농도 의존적으로 세포자연사가 일어난 세포 수가 증가하였고(Fig. 3b,c), 특히 TBT 25 ㎎/㎏ 을 투여한 실험군의 흉선에서 다량의 세포자연사가 일어나고 있음을 확인하였다(Fig. 3d).
- 흰쥐의 체중은 TBT 투여와 상관없이 정상적인 증가 양상을 보였다. 25㎎/㎏ TBT를 투여한 실험군에서 체중 증가 폭이 다른 군에 비하여 낮았으나, sesame oil만 투여한 대조군과 비교해서 유의한 차이는 보이지 않았다. 그러나 흉선의 무게는 TBT 투여 후 유의하게 감소하였으며, 체중에 따른 흉선의 무게 (somatic index) 또한 투여된 TBT 농도가 높을수록 감소하는 결과를 보였다.
- TBT 투여에 따른 체중의 변화를 알아보기 위해 7일간 체중을 측정한 결과, TBT 25 ㎎/㎏을 투여한 실험군에서 체중이 감소하는 경향을 보였으나, sesame oil만을 투여한 대조군과 비교해서 유의한 차이는 보이지 않았다(Fig. 1A). 또한 TBT 투여가 흉선 무게에 어떤 영향을 미쳤는지 알아보기 위해 TBT 투여 후 8일째에 흉선 무게를 측정한 결과, 흉선 무게는 높은 농도의 TBT를 투여할수록 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었고(Fig.
- TBT 투여와 흉선 내 세포자연사와의 연관성을 알아보기 위해 세포자연사 관련 유전자 발현을 real-time PCR 방법으로 확인한 결과, 세포자연사 관련 유전자인 TNFα와 TNFR1의 mRNA 발현이 TBT를 투여한 군에서 유의 하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7).
- 본 연구 결과들을 종합해 볼 때, TBT는 흉선 내 지방세포 유도 관련 유전자인 PPARγ, aP2, PEPCK 및 CD36의 발현을 증가시키면서 지방세포화를 촉진하고, 흉선 상피세포의 표지 유전자인 EVA, KGF, AIRE, IL-7의 발현을 감소시킴으로써 T 세포의 분화와 발달을 저해하는 것으로 사료된다. 아울러 TBT는 세포자연사 유도 유전자인 TNFα와 TNFR1의 발현을 증가시켜 흉선 내 T 세포의 세포자연사를 유발시키는 것으로 판단된다. 이러한 결과는 일상생활 속에서 지속적으로 노출되고 있는 TBT가 흉선의 기능을 떨어뜨림으로써 면역력 저하를 유발시킬 수 있음을 제시하고 있다.
- 25㎎/㎏ TBT를 투여한 실험군에서 체중 증가 폭이 다른 군에 비하여 낮았으나, sesame oil만 투여한 대조군과 비교해서 유의한 차이는 보이지 않았다. 그러나 흉선의 무게는 TBT 투여 후 유의하게 감소하였으며, 체중에 따른 흉선의 무게 (somatic index) 또한 투여된 TBT 농도가 높을수록 감소하는 결과를 보였다. 아울러 흉선 내 T 세포의 숫자도 TBT 투여 후 유의하게 감소하였다.
- 1A). 또한 TBT 투여가 흉선 무게에 어떤 영향을 미쳤는지 알아보기 위해 TBT 투여 후 8일째에 흉선 무게를 측정한 결과, 흉선 무게는 높은 농도의 TBT를 투여할수록 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었고(Fig. 1B), 체중에 따른 흉선의 무게를 나타내는 somatic index 또한 고농도의 TBT를 투여할수록 유의하게 감소하였다(Fig. 1C). 흉선에서 획득한 T 세포 수 또한 대조군에 비해 TBT를 투여한 군에서 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig.
- 본 연구 결과들을 종합해 볼 때, TBT는 흉선 내 지방세포 유도 관련 유전자인 PPARγ, aP2, PEPCK 및 CD36의 발현을 증가시키면서 지방세포화를 촉진하고, 흉선 상피세포의 표지 유전자인 EVA, KGF, AIRE, IL-7의 발현을 감소시킴으로써 T 세포의 분화와 발달을 저해하는 것으로 사료된다.
- , 2000). 본 연구결과에서 이러한 흉선 상피세포 표지 유전자인 EVA, KGF, AIRE, IL-7의 발현 양은 TBT 투여 후 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 최근 생쥐를 이용한 연구결과에 따르면, 노화에 따른 흉선 퇴화 과정에서 흉선 상피세포 표지 유전자의 발현양이 감소하고, 이로 인하여 흉선의 기능이 떨어지면서 면역력이 감소하는 것으로 보고하고 있다(Youm et al.
- 본 연구결과에서 지방세포 유도 관련 유전자로 알려진 PPARγ, aP2, CD36, PEPCK 모두 TBT 투여 후 유의하게 발현양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- , 2009). 이러한 결과들을 고려해 볼 때, TBT는 흉선 내 상피세포의 지방세포화를 유도하고, 이로 인하여 상피세포의 기능이 상실되면서 흉선의 기능이 억제되는 것으로 사료된다.
- 이러한 연구결과들을 고려해 볼 때, TBT가 흉선 조직 내 PPARγ 유전자의 발현을 촉진시키고, 이로 인하여 지방세포 분화 관련 유전자인 aP2, CD36, PEPCK 유전자 발현이 증가한다는 것은 TBT가 다른 기관에서와 마찬가지로 흉선에서도 지방세포화를 촉진시킬 수 있다는 것을 보여주고 있다.
- 이러한 흉선 무게와 T 세포 수의 감소가 흉선 내부 구조 변화와 어떤 연관성이 있는지를 확인하기 위하여 흉선 절편을 가지고 H&E 염색을 수행한 결과, TBT를 25 ㎎/㎏으로 고농도로 투여한 실험군에서 흉선 내 피질과 수질 사이의 경계가 불분명해짐을 확인할 수 있었다.
- 이상의 본 실험결과와 기존에 발표된 연구결과들을 종합하여 볼 때, TBT는 흉선의 크기와 구조를 변화시키고, 아울러 흉선 내 세포자연사를 일으키면서 흉선의 기능을 억제시키는 것으로 판단할 수 있다. 이러한 TBT 투여에 따른 흉선 내 구조의 변화와 세포자연사의 증가가 어떤 기전으로 유발되는지를 알아보고자 T 세포 분화와 발달에 중요한 역할을 하는 흉선 내 상피세포의 기능을 조사하였다.
- 지방세포 유도 관련 유전자 발현을 real-time PCR 방법으로 확인해 본 결과, TBT 투여군에서 지방세포 분화 관련 유전자인 PPARγ, CD36, PEPCK, aP2의 mRNA 발현이 TBT 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 6).
- 흉선 내 구조 변화를 알아보기 위하여 H&E 염색한 결과, 대조군에 비해 TBT를 투여한 군에서 흉선 수질과 피질의 경계가 뚜렷하지 않게 흩뜨려져 있음을 관찰할 수 있었다(Fig. 2B).
- 흉선 상피세포 표지 유전자 발현을 real-time RCR 방법으로 확인한 결과, TBT 투여군에서 상피세포 표지 유전자인 EVA, KGF, AIRE, IL-7의 mRNA 발현이 TBT 농도에 의존적으로 감소하였다(Fig. 5). 지방세포 유도 관련 유전자 발현을 real-time PCR 방법으로 확인해 본 결과, TBT 투여군에서 지방세포 분화 관련 유전자인 PPARγ, CD36, PEPCK, aP2의 mRNA 발현이 TBT 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다(Fig.
- 이에 본 연구에서도 투여된 TBT에 의해 흉선 내세포자연사가 증가하는지를 확인하였다. 흉선 절편을 이용하여 TUNEL 분석을 수행한 결과, 투여된 TBT 농도가 높을수록 흉선 내 세포자연사가 증가하는 것을 확인할 수 있었고, Annexin V 염색 후 유세포 분석기로 분석한 결과에서도 TBT 농도 의존적으로 세포자연사가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 TBT가 직접적으로 T 세포의 세포자연사를 유발시켜 흉선 기능을 감소시킨다는 기존의 보고와 일치하고 있다(Ken et al.
- 흉선에서 분리한 T 세포를 Annexin-Ⅴ와 PI로 표지하여 유세포 분석기를 이용하여 분석한 결과, TBT 25 ㎎/㎏을 투여한 실험군에서 Annexin-V로 염색된, 즉 세포자연사가 일어난 세포 수는 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 4).
- 1C). 흉선에서 획득한 T 세포 수 또한 대조군에 비해 TBT를 투여한 군에서 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 1D).
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