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문제 정의
- 현재까지 강릉 금진 지역의 해양성 광천수의 항알레르기 관련 질환에 대한 연구보고는 없다. 이에 본 연구 그룹은 강릉 금진 지역의 해양성 광천수의 생리활성을 연구하기 위한 일환으로, 실험동물을 이용하여 접촉성 과민 반응(CHR)에 대한 개선 및 치료 효과에 관하여 조사하였다.
제안 방법
- Cryostat(Leica microsystems, Germany)을 이용하여 6 ㎛ 두께로 잘라낸 조직을 슬라이드에 올려 말린 뒤에 증류수를 이용하여 cell freezing medium을 씻어내고 toluidine blue 염색과 hematoxylin(Merck, Germany)과 0.5% eosin(Sigma, USA)을 이용하여 H&E 염색을 하였다.
- 각 군당 5두씩 실시하였으며, 5% TMA 용액은 acetone과 isopropylmyristate의 4:1(v/v) 혼합액을 용매로 사용하여 제조하였으며, 실험 개시일에 50 ㎕의 5% TMA를 면도기로 제모한 마우스 옆구리에 도포하여 감작하였다.
- 정상군과 대조군은 해양성 광천수 대신 PBS를 도포하였다. 귀 두께는 6일부터 17일까지 시료를 도포하기 바로 전에 Micrometor(Fisher scientific, USA)로 측정하였다.
- 마우스의 혈액에서 혈청을 분리한 후 IgE의 양을 동일하게 ELISA kit을 이용하여 측정하였다. 또한 마우스 림프절 무게는 오른쪽 귀 아래 부분의 경부 림프절을 분리하여 전자저울로 무게를 측정하였다.
- 상층액을 걷어 내고 ELISA kit(BD Bioscience, Germany)를 이용해서 cytokines 의 양을 측정하였다. 마우스의 혈액에서 혈청을 분리한 후 IgE의 양을 동일하게 ELISA kit을 이용하여 측정하였다. 또한 마우스 림프절 무게는 오른쪽 귀 아래 부분의 경부 림프절을 분리하여 전자저울로 무게를 측정하였다.
- 본 연구에서 hematoxylin-eosin으로 염색하여 조직의 형태를 관찰하였다. Fig.
- 마우스의 귀는 2 ㎖의 PBS를 이용해서 균질화하고 25,000×g에서 20분간 원심분리하였다. 상층액을 걷어 내고 ELISA kit(BD Bioscience, Germany)를 이용해서 cytokines 의 양을 측정하였다. 마우스의 혈액에서 혈청을 분리한 후 IgE의 양을 동일하게 ELISA kit을 이용하여 측정하였다.
- 0% 농도로 10 ㎕씩 도포하였다. 정상군과 대조군은 해양성 광천수 대신 PBS를 도포하였다. 귀 두께는 6일부터 17일까지 시료를 도포하기 바로 전에 Micrometor(Fisher scientific, USA)로 측정하였다.
- 각 군당 5두씩 실시하였으며, 5% TMA 용액은 acetone과 isopropylmyristate의 4:1(v/v) 혼합액을 용매로 사용하여 제조하였으며, 실험 개시일에 50 ㎕의 5% TMA를 면도기로 제모한 마우스 옆구리에 도포하여 감작하였다. 첫 감작 5일 후에 10 ㎕의 5% TMA를 양쪽 귀 뒤 쪽에 도포하고 6일부터 17일까지 매일 10 ㎕의 2% TMA를 양쪽귀 뒤쪽에 도포하여 접촉성 과민 반응을 유도하였다. 해양성 광천수 처리군은 5% TMA 도포하고 한 시간 뒤 0.
- 첫 감작 5일 후에 10 ㎕의 5% TMA를 양쪽 귀 뒤 쪽에 도포하고 6일부터 17일까지 매일 10 ㎕의 2% TMA를 양쪽귀 뒤쪽에 도포하여 접촉성 과민 반응을 유도하였다. 해양성 광천수 처리군은 5% TMA 도포하고 한 시간 뒤 0.7%와 2.0% 농도로 10 ㎕씩 도포하였다. 정상군과 대조군은 해양성 광천수 대신 PBS를 도포하였다.
대상 데이터
- 6주령 암컷 Balb/c 마우스를 (주)나라 바이오텍에서 구입하였다. 사육실의 온도는 22±1℃, 습도는 55±5%를 유지하였고, 매일 광주기와 암주기가 12시간이 되도록 조절하였다.
- 감작 17일째 마우스의 오른쪽 귀를 잘라내고 심장에서 혈액을 채취하였다. 마우스의 귀는 2 ㎖의 PBS를 이용해서 균질화하고 25,000×g에서 20분간 원심분리하였다.
- 실험에 사용된 해양성 광천수는 강릉시 옥계면 금진리 해안 인근(해안에서 800 m 지역)의 산 지하 1,100 m 지점에서 취수 하여 0.2 ㎛의 필터로 처리한 후, 처리수를 분무건조기(Spray Dryer, L-8, Japan)로 수분을 제거한 분말을 원래의 해양성 광천수 농도(2.8%)가 되도록 증류수에 재용해한 뒤 원액 농도의 0.7%와 2% 농도로 본 실험에 사용하였다. 본 연구에 사용한 금진 지역 해양성 광천수의 미네랄 성분 조성은 Kim 등(2009)에 의해 보고되었다.
- 본 연구에 사용한 금진 지역 해양성 광천수의 미네랄 성분 조성은 Kim 등(2009)에 의해 보고되었다. 해양성 광천수에 TMA(trimellitic anhydride, 97%)와 acetone, isopropylmyristate는 (주)Sigma -Aldrich Korea에서 구입하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었고, 실험군 간의 통계분석은 Student's t-test로 각 군 간의 평균치에 대한 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- TMA 유도 CHR 모델 마우스는 Schneider 등의 방법을 이용하였다(Schneider 등 2009). 각 군당 5두씩 실시하였으며, 5% TMA 용액은 acetone과 isopropylmyristate의 4:1(v/v) 혼합액을 용매로 사용하여 제조하였으며, 실험 개시일에 50 ㎕의 5% TMA를 면도기로 제모한 마우스 옆구리에 도포하여 감작하였다.
성능/효과
- 4(a)～(d)와 같이 정상군에 비해 대조군에서 조직이 약 3배 정도 두꺼워 진 것을 관찰할 수 있었으며, 조직의 형태가 와해되어 있는 것을 관찰할 수 있다. 0.7% 또는 2% 해양성 광천수 처리군에서는 대조군에 비해 조직의 두께가 감소한 것을 확인할 수 있으며, 조직 형태도 농도 의존적으로 정상군에 가까운 것을 확인할 수 있었다. 또한 toluidine blue 를 이용하여 비만세포 등과 같은 과립구를 염색한 결과, 보라색으로 염색되는 과립구의 수가 해양성 광천수 처리군에서 상당량 감소한 것을 확인할 수 있다(Fig.
- Hematoxylin과 eosin 그리고 toluidine blue를 이용한 조직 염색에서 TMA에 의해 뚜렷한 조직의 부종이 관찰되었으며, 조직 내 과립구의 유입이 관찰되었다. 그러나 해양성 광천수의 처리 시 부종이 현저히 감소하였으며, 조직 내 과립구의 유입도 감소하였다.
- Pro-inflammatory cytokines 중 IL-6와 TNF-α도 감소하는 경향을 보였으며, 염증의 후기 반응과 관련이 있는 cytokine인 IL-4 역시 감소 효과를 보였다(Fig. 3).
- 강릉 금진 지구 해양성 광천수의 접촉성 과민 반응에 대한 접촉성 과민 반응 억제 효과를 동물 모델을 이용한 피부 도포실험으로 조사하여 본 결과, TMA에 의해 유도된 혈관 팽창에 의한 말초혈 유출과 염증반응의 대표적 증상인 부종을 억제하였다. 또한, TMA 유도 CHR에서 해양성 광천수의 처리에 의해 경부 림프절의 무게가 감소하였으며, 이는 TMA 유도에 의한 접촉성 과민 반응에서 증가된 면역반응이 해양성 광천수의 처리에 의해 일부 감소한다는 것을 시사한다.
- 귀의 두께뿐만 아니라 혈관 확장에 의한 말초혈 유출을 동반하는 염증반응에서, 대조군은 귀의 색이 붉게 나타나는 반면, 0.7% 및 2%의 시료 처리군에서는 정상군 정도는 아니지만 대조군에 비해 귀의 붉은 색이 감소하였다(Fig. 1(b)).
- Hematoxylin과 eosin 그리고 toluidine blue를 이용한 조직 염색에서 TMA에 의해 뚜렷한 조직의 부종이 관찰되었으며, 조직 내 과립구의 유입이 관찰되었다. 그러나 해양성 광천수의 처리 시 부종이 현저히 감소하였으며, 조직 내 과립구의 유입도 감소하였다. 모든 시험에서 해양성 광천수 0.
- 따라서, 해양성 광천수의 피부 도포 처리로 림프절에서 면역작용의 억제에 의한 CHR을 억제하는 것을 예측할 수 있다. 향후, 해양성 광천수의 예방 효과와 음용에 의한 개선 효과를 알아보기 위해서는 TMA 처리 전 도포 및 경구 투여 시의 조건에서도 조사할 필요성이 있다.
- 7% 또는 2% 해양성 광천수 처리군에서는 대조군에 비해 조직의 두께가 감소한 것을 확인할 수 있으며, 조직 형태도 농도 의존적으로 정상군에 가까운 것을 확인할 수 있었다. 또한 toluidine blue 를 이용하여 비만세포 등과 같은 과립구를 염색한 결과, 보라색으로 염색되는 과립구의 수가 해양성 광천수 처리군에서 상당량 감소한 것을 확인할 수 있다(Fig. 4(e)～(h)).
- 또한 조직 내 cytokine은 해양성 광천수를 처리한 군에서 IL-6의 뚜렷한 감소를 보였으며, 그 외 pro-inflammatory cytokine 또는 Th2 형 cytokine인 TNF-α 또는 IL-4도 역시 감소 현상을 보였다.
- 이러한 결과를 종합하여 볼 때, 해양성 광천수는 pro-inflammatory cytokine인 IL-6 등의 생산을 억제하여 염증을 감소시키고, 과민성 면역반응을 억제하여 림프절의 무게를 감소시킨다. 또한 혈중 IgE의 농도를 억제하고, 접촉성 과민 반응에 의한 국부조직의 비만세포 등 과립구의 유입을 억제하는 것을 보아 해양성 광천수가 접촉성 과민 반응에 억제 효과를 가질 수 있는 것을 시사하였다. 해양성 광천수의 인체에 흡수하기 쉬운 농도로 함유되어 있는 Ca, Mg 등과 그 외에도 다량 포함되어 있는 Se, V 등의 성분이 접촉성 과민 반응 억제 효과를 보이는지는 향후 밝혀야할 과제이며, 이들 면역학적인 기전도 추후 밝혀야 할 것이다.
- 강릉 금진 지구 해양성 광천수의 접촉성 과민 반응에 대한 접촉성 과민 반응 억제 효과를 동물 모델을 이용한 피부 도포실험으로 조사하여 본 결과, TMA에 의해 유도된 혈관 팽창에 의한 말초혈 유출과 염증반응의 대표적 증상인 부종을 억제하였다. 또한, TMA 유도 CHR에서 해양성 광천수의 처리에 의해 경부 림프절의 무게가 감소하였으며, 이는 TMA 유도에 의한 접촉성 과민 반응에서 증가된 면역반응이 해양성 광천수의 처리에 의해 일부 감소한다는 것을 시사한다.
- 만성 과민 반응에서 가장 두드러지게 나타나는 현상은 혈중 IgE의 증가이며, TMA에 의해 유도된 CHR에서의 혈중 IgE의 증가를 해양성 광천수가 유의적으로 감소시켰다. 또한 조직 내 cytokine은 해양성 광천수를 처리한 군에서 IL-6의 뚜렷한 감소를 보였으며, 그 외 pro-inflammatory cytokine 또는 Th2 형 cytokine인 TNF-α 또는 IL-4도 역시 감소 현상을 보였다.
- 그러나 해양성 광천수의 처리 시 부종이 현저히 감소하였으며, 조직 내 과립구의 유입도 감소하였다. 모든 시험에서 해양성 광천수 0.7% 처리군과 2% 처리군에서 유사한 억제 효과를 나타내는 것을 볼 때 0.7%의 처리로 충분한 억제 효과를 가지는 것을 알 수 있다.
- 본 연구에서도 Balb/c를 TMA로 처리시에 IgE가 뚜렷하게 증가하였으며, 해양성 광천수 처리에 의해 유의성 있게 IgE가 감소하는 것으로 나타났다. Pro-inflammatory cytokines 중 IL-6와 TNF-α도 감소하는 경향을 보였으며, 염증의 후기 반응과 관련이 있는 cytokine인 IL-4 역시 감소 효과를 보였다(Fig.
- 이들 결과를 Fig. 3의 결과와 종합하여 볼 때, 해양성 광천수 처리에 의한 IL-6, TNF-α 그리고 IL-4 등의 염증반응 관련물질의 억제가 TMA로 유도된 CHR에서 과립구의 유입, 조직의 괴사 등에 대한 억제 효과를 유도하였다고 볼 수 있겠다.
- 이들 결과를 볼 때 접촉성 과민 반응에 의한 해양성 광천수의 염증 억제 효과는 pro-inflammatory cytokines 중 IL-6의 생산 억제가 중요한 작용을 할 수 있으며, TNF-α 또는 IL-4도 일부 관여할 것으로 추측된다.
- 1(b)). 이러한 결과로 볼 때, 0.7%의 처리로도 염증 억제 효과를 가진다는 것을 알 수 있다.
- 이러한 결과를 종합하여 볼 때, 해양성 광천수는 pro-inflammatory cytokine인 IL-6 등의 생산을 억제하여 염증을 감소시키고, 과민성 면역반응을 억제하여 림프절의 무게를 감소시킨다. 또한 혈중 IgE의 농도를 억제하고, 접촉성 과민 반응에 의한 국부조직의 비만세포 등 과립구의 유입을 억제하는 것을 보아 해양성 광천수가 접촉성 과민 반응에 억제 효과를 가질 수 있는 것을 시사하였다.
- 이와 같은 보고를 종합해 볼 때, 해양성 광천수는 주변 토양 및 지질이 다른 지역에 따라 그 성분 함량이 다르며, 따라서 생리적 효능도 다를 수 있다. 현재까지 강릉 금진 지역의 해양성 광천수의 항알레르기 관련 질환에 대한 연구보고는 없다.
- 이들 결과를 볼 때 접촉성 과민 반응에 의한 해양성 광천수의 염증 억제 효과는 pro-inflammatory cytokines 중 IL-6의 생산 억제가 중요한 작용을 할 수 있으며, TNF-α 또는 IL-4도 일부 관여할 것으로 추측된다. 혈청 IgE의 농도와 조직의 IL-6 농도가 0.7%에서 2%와 비슷한 수준 또는 오히려 강한 효과를 나타내는 것을 볼 때 IgE와 IL-6에 의한 CHR 억제는 0.7% 의 농도에서도 충분하다는 것을 시사한다.
후속연구
- 또한 혈중 IgE의 농도를 억제하고, 접촉성 과민 반응에 의한 국부조직의 비만세포 등 과립구의 유입을 억제하는 것을 보아 해양성 광천수가 접촉성 과민 반응에 억제 효과를 가질 수 있는 것을 시사하였다. 해양성 광천수의 인체에 흡수하기 쉬운 농도로 함유되어 있는 Ca, Mg 등과 그 외에도 다량 포함되어 있는 Se, V 등의 성분이 접촉성 과민 반응 억제 효과를 보이는지는 향후 밝혀야할 과제이며, 이들 면역학적인 기전도 추후 밝혀야 할 것이다.
- 따라서, 해양성 광천수의 피부 도포 처리로 림프절에서 면역작용의 억제에 의한 CHR을 억제하는 것을 예측할 수 있다. 향후, 해양성 광천수의 예방 효과와 음용에 의한 개선 효과를 알아보기 위해서는 TMA 처리 전 도포 및 경구 투여 시의 조건에서도 조사할 필요성이 있다.
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