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문제 정의
- 본 연구에서는 미네랄 함량이 풍부한 강릉 금진 지역의 해양성 광천수가 지닌 생리활성을 탐색하기 위한 일환으로 암세포의 성장, 전이 및 신생 혈관 생성에 미치는 영향에 관하여 조사하였다.
제안 방법
- 1% gelatin이 코팅된 96 well plate에 5×103으로 분주하여 24시간 배양시킨 후, 5% FBS만 첨가된 RPMI 1640배지로 6시간 동안 starvation시켰다. 5% VEGF와 5 units/㎖ heparin이 첨가된 RPMI 1640 배지에 해양성 광천수를 각각 농도별로 희석하여 100 ㎕씩 첨가하여 30시간 동안 배양시켰다. 배양이 끝나면 각각의 세포들을 고정시킨 후에 BrdU를 각각의 well에 넣어 anti-BrdU로 반응시켜 Luminometer로 측정하였다.
- In vitro 세포독성 효과를 조사하기 위하여 96 well에서 각 well당 5×103 세포를 24시간 배양 후에 well당 시료 100 ㎕씩을 96 well plate에 분주하였다.
- Mytomycin-C를 positive control로 사용하여 해양성 광천수가 생쥐 백혈병 세포인 L5178Y-R의 증식억제에 미치는 영향을 관찰하였다. Fig.
- 마우스를 경추탈골법으로 희생시킨 후에 비장을 무균적으로 적출하여 10% FBS와 antibiotics(100 U/㎖ of penicillin, 100 ㎍/㎖ of streptomycin)가 함유된 RPMI-1640 배양액으로 씻은 후에 분쇄하여 세포를 유리시켰다. 분리된 세포액은 lysing buffer를 이용하여 적혈구를 제거한 후에 hemocytometer를 이용하여 세포수를 측정하였다.
- 미네랄 분석은 한국과학기술연구원과 강릉과학산업진흥원에서 유도상 플라즈마 질량 분석기(ICP-MS, DRC11, Perkin-Elmer, USA) 및 원자흡광분광광도계(AAS, Analyst800, Perkin-Elmer, USA)를 이용하여 분석을 실시하였다.
- 5% VEGF와 5 units/㎖ heparin이 첨가된 RPMI 1640 배지에 해양성 광천수를 각각 농도별로 희석하여 100 ㎕씩 첨가하여 30시간 동안 배양시켰다. 배양이 끝나면 각각의 세포들을 고정시킨 후에 BrdU를 각각의 well에 넣어 anti-BrdU로 반응시켜 Luminometer로 측정하였다.
- 각 well 당 100 ㎕의 시료를 처리한 후, 37℃, 5% CO2 incubator 내에서 24시간 또는 48시간 배양했다. 배양이 끝난 후, 60% CCK를 well 당 20 ㎕ 씩 첨가하고 microplate reader로 450 ㎚로 측정하여 650 ㎚로 측정한 reference 치를 뺀 값으로 하였다. 1 mM의 mytomycin-C를 독성검사의 positive control로 사용하였다.
- 생쥐로부터 비장을 적출하여, 비장 세포로부터 적혈구를 제거한 후, well 당 세포수가 1×105가 되도록 96 well plate에 100 ㎕씩 plating하였다.
- 주사하였다. 암세포 주사 2주 후에 폐로 전이 된 암세포의 colony 수를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 배지 RPMI 1640, MEM, DMEM, FBS, nonessential amino acids 그리고 antibiotics는 Hyclone사의 제품을 사용하였다. Cell counting kit-8은 DOJINDO(Tokyo, Japan)사, Lysing buffer는 BD Biosciens사의 제품, 그리고 mytomycin-C 및 MTT 시약은 Sigma(ST. Louis, Mo, USA) 제품을 사용하였다.
- 1 그리고 human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) 등의 세포주가 사용되었다. EL-4와 L5178Y-R 세포주는 10% FBS, 100 U/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin이 첨가된 DMEM 및 RPMI 1640 배지에서 각각 배양하였다. colon26-M3.
- 강릉시 옥계면 금진리 해안 인근의 산 지하 1,100 m 지점에서 취수한 해양성 광천수 원수를 1.0 ㎛의 필터로 처리한 후, 처리수를 분무건조장치(Spray Dryer, L-8, Japan)로 수분을 제거한 분말을 원액농도(2.8%)가 되도록 재용해하여 본 실험의 재료로 사용하였다.
- 본 시험에서는 mouse T lymphoma cell line인 EL-4, mouse lymphoma cell line인 L5178Y-R, mouse lung carcinoma cell line인 colon26-M3.1 그리고 human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) 등의 세포주가 사용되었다. EL-4와 L5178Y-R 세포주는 10% FBS, 100 U/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin이 첨가된 DMEM 및 RPMI 1640 배지에서 각각 배양하였다.
- 본 연구에 사용된 배지 RPMI 1640, MEM, DMEM, FBS, nonessential amino acids 그리고 antibiotics는 Hyclone사의 제품을 사용하였다. Cell counting kit-8은 DOJINDO(Tokyo, Japan)사, Lysing buffer는 BD Biosciens사의 제품, 그리고 mytomycin-C 및 MTT 시약은 Sigma(ST.
- 세포는 HUVEC을 사용하였으며, bFGF(basic fibroblast growth factor, 3 ng/㎖), 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640, 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양하며 사용하였다. In vitro 세포독성 효과를 조사하기 위하여 96 well에서 각 well당 5×103 세포를 24시간 배양 후에 well당 시료 100 ㎕씩을 96 well plate에 분주하였다.
- 실험동물은 7～8주령의 암컷 BALB/c mouse를 (주)오리엔트 바이오로부터 구입하여, 고형 사료와 물은 자유급여로 1주 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과의 측정치는 Mean±S.E로 나타내었고, 각 평균치간 차이에 대한 유의성은 GraphPad Prism(version 2.0, San Diego, USA)을 이용하여 one way analysis of variance(ANOVA)와, 사후검정으로는 Tukey test를 실시하였다.
- 0, San Diego, USA)을 이용하여 one way analysis of variance(ANOVA)와, 사후검정으로는 Tukey test를 실시하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 분석하였다.
이론/모형
- 혈관내피세포의 세포증식 확인 실험은 BrdU assay 방법을 이용하여 수행하였으며, BrdU assay는 5-bromo-2'-deoxy-uridine lableing kit(Roche)를 이용하여 수행하였다.
성능/효과
- 3은 해양성 광천수의 처리에 의한 EL-4 세포의 변화를 현미경으로 관찰한 결과이다. 1/4, 1/8, 1/16로 희석한 해양성 광천수를 각각 EL-4 세포에 첨가한 후 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 결과, 사진과 같이 해양성 광천수 농도가 높아짐에 따라 세포 cluster의 형태에 변화가 나타나는 것을 관찰할 수 있으며, 희석배율이 높아짐에 따라 medium 단독군에서 배양한 세포의 모양과 유사한 것을 관찰할 수 있었다.
- Balb/C mouse를 이용하여 in vivo에서 colon26-M3.1 세포를 3×104이 되게 i.v. 주사한 후에 폐로의 암세포 전이 억제력을 측정한 결과 Fig. 6과 같이 해양성 광천수가 원액과 1/3 희석군에서 농도 의존적으로 암세포 전이 억제력을 보였다.
- HUVEC을 bFGF(basic fibroblast growth factor, 3 ng/㎖)와 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640에서 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하여 해양성 광천수를 첨가한 후에 MTT를 이용하여 세포 독성을 측정한 결과, 해양성 광천수 원액에서도 유의적인 세포 독성이 관찰되지 않았으나(Fig. 7), 1/2로 희석한 시료 처리군과 원액 처리군에서는 세포에 약간의 증식억제 효과가 보였다.
- 본 실험에서 인간의 혈관 내피세포에 VEGF를 첨가하여 인위적으로 혈관 내피세포를 증식시켰을 때 해양성 광천수 원액부터 1/10으로 희석한 실험군에서 VEGF의 첨가에 의한 증식을 유의적으로(p<0.001) 억제하였다(Fig. 8).
- 4와 같이 1/32배까지는 농도 의존적으로 세포활성을 억제하는 결과를 보였다. 이러한 결과로 볼 때, 일부 실험적 오차가 있음을 배재할 수 없겠으나, 최소한 1/16배의 희석의 경우까지는 유의한 종양세포 억제효과가 있는 것으로 판단된다.
- 일반 세포의 경우와는 달리 해양성 광천수는 생쥐 백혈병 세포주(EL-4, L5178Y-R)나 대장암 세포주(colon26-M3.1)의 증식을 억제하며, VEGF가 첨가된 인간혈관내피세포(HUVEC) 증식 저해를 유도함으로써 angiogensis를 억제하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, in vivo에서의 colon26-M3.
- 해양성 광천수 원수를 분석한 결과, 일반 천연수에 존재하기 어려운 Se, V 등 희귀 기능성 미네랄이 다량 측정되었으며, Ca과 Mg의 농도가 인체에 흡수하기 쉬운 비율로 존재하였다. 인체에 유해한 중금속인 Hg, Pb, Cd 등은 검출되지 않았다(Table 1).
- 해양성 광천수가 일반 세포의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해, 해양성 광천수를 배지에 희석비율로 mouse 비장 세포에 첨가한 경우 1/2의 희석농도에서는 약간의 저해효과를 가지나 1/4 희석비율에서는 배지와 같은 형태로 세포의 성장에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig. 1). 따라서 해양성 광천수 1/4 이상의 희석 농도에서는 정상 면역세포에 세포독성을 나타내지는 않는다고 볼 수 있겠다.
- 해양성 광천수는 정상세포에서는 1/4로 희석한 조건에서는 세포의 성장에 영향을 미치지 않았으나, C57BL/6 생쥐 유래의 백혈병 세포주인 EL-4 세포에는 1/4에서부터 1/16의 희석 비율로 첨가한 해양성 광천수에서 농도 의존적으로 암세포 증식억제의 유의적인(p<0.01) 효과를 보였다(Fig. 2).
후속연구
- 향후, 해양성 광천수의 항암작용에 대하여, 각각의 미네랄 단독 또는 혼합 처리에 의한 활성 변화에 대한 구체적인 연구를 통해 해양성 광천수의 정확한 항암 작용기전의 파악과 규명이 필요하다고 본다.
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