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문제 정의
- 이 연구는 경남지역 사육 돼지에 대하여 톡소플라즈마병 항체분포를 조사하고 특이항원에 대한 감염실태를 조사하여 본 병에 대한 효과적인 예방대책을 수립하는데 기초자료로 활용하고자 실시하였다.
제안 방법
- 2009년 1월에서 10월까지 경남지역 15개 시·군에서 돼지사육 50농가 300두를 대상으로 톡소플라즈마 감염실태조사를 ELISA법으로 항체검사를 시행하였고, 농장에서 채취한 300건의 혈액과 도축장 출하돼지의 지육 등을 채취하여 PCR법으로 항원검사를 시행한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- PCR에 의하여 증폭된 DNA를 ethidium bromide (10 mg/ml)를 첨가한 1.5% agarose gel에 전기 영동하여 gel 판독기(Bio-Rad, USA) 상에서 DNA를 확인하였다.
- 검사결과의 유효성을 위하여 양성대조혈청(Toxoplasma positive swine sera in buffer with preservative)의 흡광도는 0.3 OD units보다 같거나 크고 음성대조혈청(Toxoplasma negative swine sera in buffer with preservative)의 흡광도가 0.3 OD units 미만인 plate의 성적만을 인정하여 결과를 판독하였다. 검사혈청의 흡광도가 0.
- 근육으로부터 DNA 추출 : 근육에서 DNA 추출은 근육 유제 상층액 300µl를 취하여 DNeasy Mini kit (Quiagen, USA)를 이용하여 추출하였다.
- 반응을 정지 시키기 위해 50µl의 stop solution (1 M phosphoric acid)을 각 well에 분주한 다음 파장 450/620nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 계산하였다.
- 이 혼합액을 thermocycler (Biometra, Germany)에서 95°C에서 5분간 pre-denature시키고 이어서 94°C에서 1분간 denaturation, 60°C에서 1분간 annealing 및 72°C에서 1분간 polymerization 반응을 1cycle 로 하여 35cycles 실시하였고, 최종적으로 72°C에서 5 분간 extension 반응을 하였다.
- 혈액으로부터 DNA 추출 : 혈액에서 DNA 추출은 LeucosepTM tube(Greiner Bio-One, Austria)에 Histopaque (Sigma-Alorich, USA) 3ml을 넣고 그 위에 동량의 혈액을 혼합되지 않도록 주입한 다음 1,300rpm에서 30분간 원심분리하여 buffy coat 층을 피펫으로 수집한 후 PBS로 3회 세척한 다음 시판되는 DNA 추출킷트인 DNeasy Mini kit(Quiagen, USA)를 이용하여 추출하였다. 근육으로부터 DNA 추출 : 근육에서 DNA 추출은 근육 유제 상층액 300µl를 취하여 DNeasy Mini kit (Quiagen, USA)를 이용하여 추출하였다.
대상 데이터
- 2009년 1월에서 10월까지 경남지역 15개 시·군의 돼지 사육 50농가에서 300두의 혈액 시료를 수집하였다.
- 2009년 1월에서 10월까지 경남지역 4개소의 도축장에 출하되는 돼지 근육을 각 300g씩 200건을 채취하였고 각 근육 시료별로 10개 부위에서 0.5g씩 총 5g을 취하여 유발에 넣고 세절한 다음 여기에 PBS 5ml를 주입하여 유제액으로 만들고 냉동 및 해동 과정을 2회 반복한 다음 3,000rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액을 취하여 즉시 항원검사 재료로 사용하였다.
- PCR법을 이용한 T. gondii의 항원검사를 위해 국립수의과학검역원으로부터 T. gondii Total DNA를 분양 받아 양성대조시료로 이용하였으며, 이 실험에서 공시한 총 300두의 혈액과 경남지역의 4개소의 도축장에 출하되는 돼지 지육 200건에 대하여 항원검사를 실시하였으나 모든 시료가 음성으로 판정되었다.
- 경남지역 종돈장 및 돼지 사육 농가 가운데 지역별, 사육규모별로 검사대상 농가를 선정하였고, 사육단계별로 자돈, 비육돈, 후보돈, 모돈의 혈액을 채취하여 항체검사 및 항원검사 재료로 공시하였으며, 또한 도축장에 출하된 돼지의 근육을 항원검사 재료로 공시하였다.
- 경남지역의 돼지 사육농가를 대상으로 ELISA법을 이용하여 T. gondii의 항체검사를 시행하였으며 총 50농가 중 34농가 68%가 양성이었다. 사육형태별 검사 결과로 종돈장 5개소 중 3개소가 양성으로 60.
- 다음으로, PCR법을 이용한 T. gondii의 항원검사를 위해 국립수의과학검역원으로부터 T. gondii Total DNA를 분양받아 양성대조시료로 이용하였으며, 실험에서 공시한 총 300두의 혈액과 경남지역의 4개소의 도축장에 출하되는 돼지 근육 200건에 대하여 항원검사를 실시하였으나 모든 시료에서 음성으로 판정하였다(Fig. 1, Fig. 2).
- 2009년 1월에서 10월까지 경남지역 15개 시·군의 돼지 사육 50농가에서 300두의 혈액 시료를 수집하였다. 돼지 혈액 10ml를 주사기로 채혈한 다음 NH Sodium Heparin (Greiner Bio-One GmbH, Austria)이 들어있는 진공시험관에 혈액 3ml을 분주하여 항원검사 재료로 사용하였으며, 주사기에 남아있는 나머지 혈액에서 혈청을 분리하여 냉동보관하면서 항체검사 재료로 사용하였다
이론/모형
- Primers : Primer는 Stiles 등(1996)이 고안한 B1 gene 으로 염기서열은 sense primer (T-1)로 5′-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3′(21bp)를, antisense primer (T2)로 5′-CAGACGAATCACGGAACTG-3′(19bp)를 사용하였다.
- 톡소플라즈마에 대한 항체분포를 조사하기 위한 ELISA는 Toxoplasma gondii Antibody Test Kit Micro well ELISA Directions For Use In Swine (SafePathTM Laboratories, USA)를 사용하였다.
성능/효과
- 1. 돼지톡소플라즈마 항체검사 결과는 농가별로 50농가 중 34농가(68.0%)가 양성이었으며 개체별로는 300두 중 115두(38.3%)가 양성이었다.
- 2. 사육형태별 검사 결과 종돈장 75두 중 22두(29.3%)가 양성이었으며 양돈장 225두 중 93두(41.3%)가 양성이었으며, 사육단계별로 비육돼지 169두 중 65두가 양성(38.5%)이었으며 어미돼지 70두 중 41두(58.6%)가 양성이었다.
- 3. 계절별 항체보유율은 봄 105두 중 양성 25두(23.8%), 여름 60두 중 양성 20두(33.3%), 가을 75두 중 양성 22두(29.3%), 그리고 겨울에 60두 중 양성 48두(80.0%)로 겨울이 비교적 높았다.
- 4. 사육규모별 항체율은 500두 미만 농가에서 35두 중 양성 16두(45.7%), 2,000두 미만 농가에서 135두 중 양성 61두 (45.2%), 2,000두 이상 농가에서 130두 중 양성 38두 (29.2%)로 나타났다.
- 5. 300두의 돼지 혈액과 도축장 출하 돼지 지육 200건에서 톡소플라즈마 특이 항원은 검출되지 않았다.
- T. gondii의 항체검사 결과 개체별 항체 형성률을 시군별로 보면 고성군과 거창군이 80.0%로 가장 높았으며, 마산시 66.7%, 합천군 60.0%, 진주시 56.0%, 남해군 40.0%, 하동군 38.5%, 함양군 35.0%, 함안군 33.3%, 의령군 30.0%, 산청군 26.7%, 사천시 20.0%, 창녕군 13.3%였으며 김해시와 밀양시는 모든 개체가 음성으로 판정되었다.
- 개체별로는 500두 미만 사육농가 35두 중 양성 16두(45.7%), 500두 이상 2,000두 미만 농가 135두 중 양성 61두(45.2%), 2,000두 이상 대규모 농가에서 130두를 검사하여 양성 38두(29.2%)로 나타났다(Table 6).
- 7%)로 사육규모가 적은 농장일수록 항체률이 높았으며, 2,000두 이상 농장에서는 감염률이 현저히 감소했다. 개체별로는 500두 미만 사육농가의 돼지 35두를 검사하여 양성 16두(45.7%), 2,000두 미만 농가 135두를 검사하여 양성 61두(45.2%), 2,000두 이상 대규모 농가의 돼지 130두 중 양성 38두(29.2%)의 양성률을 보여 개체별 감염율도 대규모 사육농가에 비교하면 소규모 사육농가의 돼지에서 현저히 높은 감염률을 보였는데, 이는 소규모 사육농가일수록 축사의 시설이나 환경이 좋지 않아 쉽게 고양이 등 야생동물이 드나들 수 있는 것으로 보인다.
- 9%였다(Table 1). 개체별로는 종돈장이 75두 중 22두(29.3%)가 양성이었고, 양돈장은 225두 중 93두(41.3%)가 양성이었다(Table 2).
- 6%)가 양성으로 모돈의 양성률이 가장 높았다(Table 3). 계절별 항체보유율은 봄에 채혈한 105두 중 양성 25두(23.8%), 여름 60두중 양성 20두(33.3%), 가을 75두 중 양성 22 두(29.3%) 그리고 겨울 60두 중 양성 48두(80.0%)로 봄과 가을은 낮고 겨울이 매우 높았다(Table 4).
- 돼지의 사육단계별 항체검사 결과 자돈 15두 중 1두(6.7%)가 양성으로 판정되어 양성률이 가장 낮았고, 비육돈에서는 169두 중 65두(38.5%)가 양성이었으며, 후보돈 46두 중 8두(17.4%)가 양성이었고, 모돈은 70두 중 41두(58.6%)가 양성으로 3~4개월령의 비육 시기와 모돈 시기에서 T. gondii에 많이 노출된 것으로 추정되는데, 서 등(2009)이 보고한 사육단계별 항체보유율에서도 3개월령 전후의 비육돈 166두 중 양성 20 두(12.0%), 8개월령 이상의 모돈 202두 중 양성 42두(20.8%)의 결과와 비교할 때 감염률에서는 다소 차이를 보였으나 일령에 따라 항체 보유율이 증가한 결과와 일치하였다.
- 돼지의 사육단계별 항체검사 결과 자돈은 15두 중 1두(6.7%)가 양성으로 양성률이 가장 낮았고, 비육돈은 169두 중 65두(38.5%)가 양성이었으며, 후보돈 46두 중 8두(17.4%)가, 모돈은 70두 중 41두(58.6%)가 양성으로 모돈의 양성률이 가장 높았다(Table 3). 계절별 항체보유율은 봄에 채혈한 105두 중 양성 25두(23.
- 본 실험에서 항체검사를 시행한 결과 경남지역 총 50농가 중 34농가(68%)가 양성이었고 사육형태별 검사결과 종돈장 5개소 중 3개소가 양성으로 양성률 60.0%, 양돈장 45농가 중 31농가가 양성으로 농장단위의 양성률은 68.9%였으며, 개체별로는 종돈장이 75두 중 22두(29.3%)가 양성이었고 양돈장은 225두 중 93두(41.3%)가 양성이었다.
- 톡소플라즈마병(Toxoplasmosis)은 고양이가 종숙주이며 사람과 온혈동물 등이 중간숙주로서 세계적으로 중요한 인수공통기생충병이다. 사람을 포함한 거의 모든 포유류와 조류가 중간숙주 또는 운반숙주 역할을 하며 종숙주인 고양이보다 중간숙주에서 병원성이 더 높은 것으로 알려졌다. 중간숙주 체내에서는 무성생식만이 진행되며 원충이 거의 모든 장기에 침입하여 증식하고 궁극적으로는 낭을 형성하여 주로 중추신경계나 근육 내에서 장기간 생존한다.
- 사육규모별 항체검사 결과 500두 미만을 사육하는 7농가 중 양성 6농가(85.7%)였고, 500두 이상 2,000두 미만을 사육하는 26농가 중 양성 18농가(69.2%), 2,000두 이상 사육하는 대규모 농장 17농가 중 양성 10농가(58.8%)였다(Table 5).
- 사육규모별로 항체검사 결과 500두 미만을 사육하는 7농가 중 양성 6농가(85.7%), 500~2,000두 미만을 사육하는 26농가 중 양성 19농가(73.1%), 2,000두 이상 사육하는 17농가 중 양성 10농가(58.7%)로 사육규모가 적은 농장일수록 항체률이 높았으며, 2,000두 이상 농장에서는 감염률이 현저히 감소했다. 개체별로는 500두 미만 사육농가의 돼지 35두를 검사하여 양성 16두(45.
- gondii의 항체검사를 시행하였으며 총 50농가 중 34농가 68%가 양성이었다. 사육형태별 검사 결과로 종돈장 5개소 중 3개소가 양성으로 60.0%였고, 양돈장 45농가 중 31농가가 양성으로 농장단위의 양성률은 68.9%였다(Table 1). 개체별로는 종돈장이 75두 중 22두(29.
- 항체보유률은 봄에 채혈한 105두 중 양성 25두(23.8%), 여름 60두 중 양성 20두(33.3%), 가을 75두 중 양성 22두(29.3%) 그리고 겨울 60두 중 양성 48두(80.0%)로 봄과 가을은 낮고 겨울이 매우 높았다.
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