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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내에 서식하는 저서성 요각류인 Tigriopus japonicus s.l.에 미치는 fenbendazole과 lincomycin의 장기노출 영향을 조사하였으며, 생태독성 종말점으로 생존율, 성장율, 형태적 기형 등을 측정하여 수서생태계 내에서의 이들 물질의 영향을 파악하였다.
제안 방법
- 실험은 25일간 진행되었으며 온도 20 C, 명암주기 (16 : 8), 노출용기는 폴리스티렌 재질의 일회용 다중 노출용기(6-well plate)를 사용하였으며, 배양액은 인공 해수염(Crystal Sea Marine Mix, Crystal Sea®)을 이용하여 농도 30 psu로 만들어 10 mL를 넣어주었다.
- 사료의 주입량은 유생 10개체에 5 μL로 공급하였으며, copepodite 단계에서는 2배인 10 μL로 공급하였다. 25일간 노출평가에서 각 물질별 농도는 0.3, 1, 10, 30 ppb로 농도 범위로 실험하였다.
- Fenbendazole, lincomycin에 장기 노출시킨 T. japonicus s.l.에서 생존율, 성장율 및 copepodite 출현 일을 조사하였다. 0.
- 8%)에 녹여 제조하였다. T. japonicus s.l.의 생존율이 DMSO에 의해 영향이 미치지 않도록 DMSO 농도가 0.1% 미만이 되도록 하였다. 모든 시험 물질은 미국 Sigma-Aldrich 제품을 사용하였다.
- 각 독성물질의 노출에 따른 생물학적 영향을 조사하기 위해 각각의 실험농도당 부화 후 1~2일째 되는 T. japonicus s.l. 유생을 대상으로 25일 동안 노출 시킨 후 분석하였다. 각각의 개체를 관찰하여 5 분 동안 아무런 움직임이 없는 경우 사망한 것으로 일단 판단한 후 24시간 이후에 사망을 확정하여 생존율을 계산하였다.
- 유생을 대상으로 25일 동안 노출 시킨 후 분석하였다. 각각의 개체를 관찰하여 5 분 동안 아무런 움직임이 없는 경우 사망한 것으로 일단 판단한 후 24시간 이후에 사망을 확정하여 생존율을 계산하였다. 또한 T.
- 형태 기형 관찰을 위해 해부가 필요한 경우엔 해부를 실시하였다. 개체는 lactophenol을 떨어뜨린 H-S 슬라이드 위에서 외부 형태 또는 상세 관찰을 위해 해부핀으로 해부한 후, 각 개체의 부속지를 100~1,000배의 광학현미경(Olympus BX51)으로 관찰 하였다. 두흉부는 제1촉각의 마디수, 구강부분의 강모 변형, 유영지는 각 마디의 형태 및 마디 수, 강모의 위치와 강모 수, 복부는 미지(caudal rami)의 형태와 꼬리털(caudal seta)의 수를 기록하였다.
- 내분 비계 장애물질 노출에 따른 성장율은 T. japonicus s.l.의 배부분의 길이를 측정하였다(Fig. 3).
- 알에서 부화한 24시간 이내의 유생 중 움직임이 활발하고 크기가 일정한 개체를 선별하여, 10마리씩 계수하여 well별로 투입하며 시험구별 또는 시험농도별 반복수는 3 이상으로 하였다. 노출기간 동안 매일 생존여부를 관찰하였으며, 사료로는 Tetramin (Tetra-Werke, Melle, Germany)을 공급하였다. 사료의 주입량은 유생 10개체에 5 μL로 공급하였으며, copepodite 단계에서는 2배인 10 μL로 공급하였다.
- 각각의 개체를 관찰하여 5 분 동안 아무런 움직임이 없는 경우 사망한 것으로 일단 판단한 후 24시간 이후에 사망을 확정하여 생존율을 계산하였다. 또한 T. japonicus s.l.의 성장률은 생물의 길이를 측정하여 산출하였다. 생물 길이의 측정방법은 광학현미경 하에서 측정하였으며, copepodite 시기에 크게 성장하는 배부분(urosome)의 길이를 측정하였다.
- 사진 촬영은 광학현미경에 장착된 Digital Camera를 이용하였다. 또한, 변이가 나타난 개체는 전체 관찰한 개체수의 비율로 환산 하여 백분율을 구하여 변이율을 측정하였다.
- 두흉부는 제1촉각의 마디수, 구강부분의 강모 변형, 유영지는 각 마디의 형태 및 마디 수, 강모의 위치와 강모 수, 복부는 미지(caudal rami)의 형태와 꼬리털(caudal seta)의 수를 기록하였다. 변이가 나타난 개체는 비정상적인 부분을 기형의 정도에 따라 강모의 이형, 결핍, 추가 발생, 비대칭 등으로 기록하였으며, 현미경 사진을 촬영하였다. 사진 촬영은 광학현미경에 장착된 Digital Camera를 이용하였다.
- 의 성장률은 생물의 길이를 측정하여 산출하였다. 생물 길이의 측정방법은 광학현미경 하에서 측정하였으며, copepodite 시기에 크게 성장하는 배부분(urosome)의 길이를 측정하였다.
- 실험은 25일간 진행되었으며 온도 20 C, 명암주기 (16 : 8), 노출용기는 폴리스티렌 재질의 일회용 다중 노출용기(6-well plate)를 사용하였으며, 배양액은 인공 해수염(Crystal Sea Marine Mix, Crystal Sea®)을 이용하여 농도 30 psu로 만들어 10 mL를 넣어주었다. 알에서 부화한 24시간 이내의 유생 중 움직임이 활발하고 크기가 일정한 개체를 선별하여, 10마리씩 계수하여 well별로 투입하며 시험구별 또는 시험농도별 반복수는 3 이상으로 하였다. 노출기간 동안 매일 생존여부를 관찰하였으며, 사료로는 Tetramin (Tetra-Werke, Melle, Germany)을 공급하였다.
- 채집된 시료는 연구실로 옮겨와 충분히 안정시켜 배양하였으며, 배양액으로 사용할 해수는 1차 증류수와 인공 해수염(Crystal Sea Marine Mix, Crystal Sea®)을 이용하여 농도 30 psu로 만들어 사용 하였다.
대상 데이터
- 1% 미만이 되도록 하였다. 모든 시험 물질은 미국 Sigma-Aldrich 제품을 사용하였다. 실험은 25일간 진행되었으며 온도 20 C, 명암주기 (16 : 8), 노출용기는 폴리스티렌 재질의 일회용 다중 노출용기(6-well plate)를 사용하였으며, 배양액은 인공 해수염(Crystal Sea Marine Mix, Crystal Sea®)을 이용하여 농도 30 psu로 만들어 10 mL를 넣어주었다.
- 변이가 나타난 개체는 비정상적인 부분을 기형의 정도에 따라 강모의 이형, 결핍, 추가 발생, 비대칭 등으로 기록하였으며, 현미경 사진을 촬영하였다. 사진 촬영은 광학현미경에 장착된 Digital Camera를 이용하였다. 또한, 변이가 나타난 개체는 전체 관찰한 개체수의 비율로 환산 하여 백분율을 구하여 변이율을 측정하였다.
- 시험 대상 물질인 fenbendazole (Fenbendazole, CAS No. 43210-67-9), lincomycin (Lincomycin, CAS No. 859-18-7)을 유기용매인 DMSO (Dimethy Sulfoxide, 99.8%)에 녹여 제조하였다. T.
- 저서성 요각류 Tigriopus japonicus s.l.는 전라남도 여수시 만성리 해수욕장 부근의 조수 웅덩이에서 채집하였다. 채집은 소형 핸드넷(망목 크기 63 μm)을 사용하였다.
- 채집은 소형 핸드넷(망목 크기 63 μm)을 사용하였다.
데이터처리
- 25일 동안의 생존율과 성장율 결과에 대해서 분산분석(ANOVA, 유의수준 α=0.05)을 실시하였고 (Zar, 1984), 각 실험구와 대조구 간 생존율의 유의한 차이를 분석하기 위해 SPSS version 15.0 (SPSS INC., Chicago, IL, USA)를 이용하여 Fisher’s LSD (Least Significant Difference)로 분석하였다.
이론/모형
- 3, light/dark=16/8 조건에서 항온기 (Sanyo incubator MIR-553) 내에서 배양하였다. 모든 배양 조건은 ISO의 표준시험방법을 참고하였다(ISO 1997).
성능/효과
- 0.3, 1, 10, 30 μg L-1fenbendazole 에 각각 25일간 노출 된 후 T. japonicus s.l.의 생존율은 농도 의존적으로 급격하게 감소되는 것(p⁄ 0.05)을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 3 μg L-1을 제외한 모든 농도에서 생존율이 급격히 줄어들었으며, lincomycin은 1 μg L-1에서 생존율이 줄어들었지만, 그 외의 저, 고농도에서는 크게 영향을 주지 않았다. Copepodite 출현일은 두 물질의 모든 농도에서 현격히 지연되었으며, 특히 상대적으로 높은 농도보다 낮은 농도에 영향이 더 많이 나타났다. 배부분의 길이는 fenbendazole의 경우 농도가 높아질수록 작게 나타났으며, lincomycin은 큰 영향이 나타나지 않았다.
- Fenbendazole에 노출된 T. japonicus s.l.은 0.3 μg L-1에서 7.00±0.00, 1 μg L-1에서 7.46±0.52일에 출현하였으며 0.3 μg L-1에서 통계적 유의성이 나타났다(Fig. 2).
- Fenbendazole은 농도 의존적으로 성장길이가 통계적 유의 수준으로 저해됨을 관찰할 수 있었다(p⁄0.05).
- 그리고, 생존율과 성장율에 관해서는 fenbendazole이 lincomycin보다 민감하게 나타났지만, 형태적 기형의 결과에서는 lincomycin이 더 영향을 주는 것으로 나타났다. Lincomycin에서는 제2~4유영지 모두 에서 기형을 관찰 할 수 있었으며, 마디에서의 기형뿐 아니라, 강모의 결핍, 추가 발생 등도 나타났다. 이는 본 연구를 통해 lincomycin에 대해서는 그 생태독성에 대한 영향을 평가하기 힘들었던 부분을 해결해 줄 수 있을 것이다.
- 또한, Takeda (1948)의 연구에 따르면 이러한 형태 기형은 다음 자손 세대에 영향을 미쳐 기형이 유전된다는 점에서 저농도의 항생제 생태독성 반응이 다음 세대로 전달되는 점을 생각해본다면, 짧은 생활사를 가지고 있는 요각류에 있어서 그 반응은 세대를 거치면서 연쇄적으로 나타날 것으로 예상된다. 그리고, 생존율과 성장율에 관해서는 fenbendazole이 lincomycin보다 민감하게 나타났지만, 형태적 기형의 결과에서는 lincomycin이 더 영향을 주는 것으로 나타났다. Lincomycin에서는 제2~4유영지 모두 에서 기형을 관찰 할 수 있었으며, 마디에서의 기형뿐 아니라, 강모의 결핍, 추가 발생 등도 나타났다.
- 본 연구에서의 대조군이 5.53±0.05일에 비해 두 물질의 모든 농도에서 현저하게 늦게 나타났으며, 특히 lincomycin의 낮은 농도인 0.3 μg L-1에서는 8.61± 0.13일로 가장 늦게 나타났다.
- 우리나라 연안의 저서성 요각류 T. japonicus s.l.를 대상으로 항생제인 fenbendazole, lincomycin에대한 생태독성 반응을 연구한 결과, 독성에 노출될 경우 fenbendazole은 0.3 μg L-1을 제외한 모든 농도에서 생존율이 급격히 줄어들었으며, lincomycin은 1 μg L-1에서 생존율이 줄어들었지만, 그 외의 저, 고농도에서는 크게 영향을 주지 않았다.
- 이번 연구를 통해 fenbendazole과 lincomycin에 따른 성장율, copepodite 발생일, 배부분의 길이, 형태적 기형이 확인되었다. 각 물질에 대한 생태독성은 현재 활발히 진행되고 있으나 그 평가가 어려운 물질들이 있을 가능성을 생각해 볼 수 있다.
- 이러한 특징들은 요각류의 성장 단계에 있어서 크기의 변화를 알아보기에 좋은 척도가 될 수 있다. 이에 본 연구에서는 요각류의 배부분의 길이를 측정하였는데, 저농도의 fenbendazole에서 배부분의 길이가 줄어드는 영향이 나타났다. 이는 같은 생물을 대상으로 한 4-nonyphenol, 4-tert-octylphenol 노출실험 (Bang et al.
- 01). 종합해보면 항생제에 노출된 경우에는 copepodite의 출현이 대조군에 비해 지연이 되어 나타나며, 저농도인 경우에 크게 지연되었다. 내분 비계 장애물질 노출에 따른 성장율은 T.
후속연구
- 이에 본 연구에서 실시한 형태적 기형의 관찰은 낮은 농도의 물질에 대해서도 그 독성에 대한 평가를 할 수 있을 것으로 기대 된다. 또한, 이러한 형태적 기형의 명확한 원인을 파악하기 위해서는 내분비계 노출에 따른 개체의 탈피, 세포 수준의 단백질 분석 등의 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것이다.
- 본연구에서도 lincomycin의 경우 기존의 내분비계 교란물질과 유사하게 나타난다고 할 수 있으나, fenbendazole의 경우 10 μg L-1이상의 농도에서 생존 하지 못하였다. 이는 지금까지의 일반적인 항생제에 대한 보고와는 확연히 다르게 저농도에서도 생존율이 저해됨을 의미하고, 추가적으로 다양한 물질의 저농도에 대한 계속적인 연구가 필요하다고할 수 있다.
- 각 물질에 대한 생태독성은 현재 활발히 진행되고 있으나 그 평가가 어려운 물질들이 있을 가능성을 생각해 볼 수 있다. 이에 본 연구에서 실시한 형태적 기형의 관찰은 낮은 농도의 물질에 대해서도 그 독성에 대한 평가를 할 수 있을 것으로 기대 된다. 또한, 이러한 형태적 기형의 명확한 원인을 파악하기 위해서는 내분비계 노출에 따른 개체의 탈피, 세포 수준의 단백질 분석 등의 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것이다.
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