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문제 정의
- 그러나 아직까지는 내분비 교란물질 4-7-octylphenol 노출에 대 한 깔따구 유충의 기형유발에 대한 연구는 전무한 상태이다. 때문에 이번 연구에서는 하천에서 채집하여 실내 사육한 Chironomus pliunosus를 이 용하여 내분비계 교란물질 4-te-octylphenol에 노출하였을 때 나타나는 생물학적 독성 반응을 생존, 성장, 우화, 성비 뿐 아니라 독성물질 노출에 의해 유도되는 기형을 분석 하고자 하였다.
제안 방법
- 10. 28일째 생물을 회수하였다. 생물의 회수방법은 300 mL polypropylene 용기에 들어있는 퇴적물을 300 pm 표준체에 조심스럽게 부어서 wet sieving 하여 생물을 회수하였다.
- 2, 3, 4번 반복구는 생존율, 우화, 성장률, 5. 6번 반복 구는 기형분석용으로 각각 생물은 20마리씩 투입하였다. 각 반복구 별로 4, 7, 10, 28일째 생물을 회수하였으며, 대조구와 유기용매 대조구도 같은 방법으로 각각 6 반복구를 두어 4, 7.
- C. plwiosus를 이용하여 48 시간 노출 후 생물을 계수하여 LC50을 산출하였다. NOEC는 대조군과 비교하였을 때 생물의 영향이 없는 가장 높은 농도로써 4-wt-octylphenole 1.
- 퇴적물의 인위적인 오염은 US. EPA에서 2001 년에 발행한 시험지침서 (methods for collection, storage and manipulation of sediments for chemical and toxicological analyses: technical manual)를 참조하여 sediment spiking을 하여 본 연구 목적에 맞게 병행하여 실험에 사용하였다.
- 6번 반복 구는 기형분석용으로 각각 생물은 20마리씩 투입하였다. 각 반복구 별로 4, 7, 10, 28일째 생물을 회수하였으며, 대조구와 유기용매 대조구도 같은 방법으로 각각 6 반복구를 두어 4, 7. 10.
- 생물의 회수방법은 300 mL polypropylene 용기에 들어있는 퇴적물을 300 pm 표준체에 조심스럽게 부어서 wet sieving 하여 생물을 회수하였다. 각 실험구별로 회수된 생물을 개수하여 생존율과 사망률을 계산하였다.
- 국내 서 식 깔따구인 Chiro/iong plumosus를 대상으로 내분비계 교란물질인 4-wr-octylphenoI을 sediment spiking된 퇴 적물에 노출 하여 생존, 성 장, 우화, 성비 및 구강 기 형 발생을 살펴보았다.4*"- octylphenole 깔따구의 생존과 우화에 큰 영향을 미치지 않았다.
- 노출 10일 이후는 번데기와 우화시기에 도달하기 때문에 개체를 추출하지 않았다. 기형 발생을 관찰하기 위하여 두부와 몸체를 CMC-10을 이용하여 슬라이드로 제작하였다. 두부는 커버글라스로 눌러 하순기절 (mentum)이 잘 보일 수 있도록 한 후 Olympus SZX16을 이용하여 전체적인 형태를 관찰하고 두부는 Olympus BX510 하에서 400배로 확대 관찰하였다.
- 노출 기 간 동안 24시간 간격 으로 C. plumosus의 우화율을 관찰하였다. 4-7-octylphenole 30 ppm 이하 모든 농도에서 우화에 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다 (Fig.
- EPA, 2001). 노출 기간 동안에 매일 우화한 개체의 머리 부분 안테나 모양의 차이를 통해 암컷과 수컷을 구분하여 성비를 확인하였다.
- 기 형 부위는 MLT, LT 및 MIX로 구분하여 한 부분만 기형이 나타났으면 해당 부분에 기록을 하고 두 부분에 기형이 발생한 경우에는 MIX에 기록을 하여 기형 발생 부분이 중복 기록되는 것을 피하였다. 대악은 두부의 배 부분에서 하순 기절이 위로 향한 상태일 때 오른쪽과 왼쪽으로 구분하였으며, 한 부분만 기형이 나타났으면 해당 부분에 기록을 하고, 두 부분에 기형이 발생한 경우에는 MIX에 기록을 하였다.
- 기형 발생을 관찰하기 위하여 두부와 몸체를 CMC-10을 이용하여 슬라이드로 제작하였다. 두부는 커버글라스로 눌러 하순기절 (mentum)이 잘 보일 수 있도록 한 후 Olympus SZX16을 이용하여 전체적인 형태를 관찰하고 두부는 Olympus BX510 하에서 400배로 확대 관찰하였다. 두부의 구강부분에 있는 대악 (mandible)과 하순기절의 tooth 상태와 기형을 살펴보았다.
- 두부는 커버글라스로 눌러 하순기절 (mentum)이 잘 보일 수 있도록 한 후 Olympus SZX16을 이용하여 전체적인 형태를 관찰하고 두부는 Olympus BX510 하에서 400배로 확대 관찰하였다. 두부의 구강부분에 있는 대악 (mandible)과 하순기절의 tooth 상태와 기형을 살펴보았다. 하순기 절의 구조는 MLT (median lateral teeth) 부분과 LT (lateral teeth) 부분으로 나누어 관찰하였으며, tooth의 기형 정도에 따라 상태를 기록하였다.
- 28일째 생물을 회수하였다. 생물의 회수방법은 300 mL polypropylene 용기에 들어있는 퇴적물을 300 pm 표준체에 조심스럽게 부어서 wet sieving 하여 생물을 회수하였다. 각 실험구별로 회수된 생물을 개수하여 생존율과 사망률을 계산하였다.
- phmiosus를 이용한 생존율측정을 실시하였다. 생존율은 4, 7, 10, 28일째 시험생물을 계수하여 산출하였다. 본 연구에서는 30 ppm 이 하의 4- tert-octylphenole C.
- 성장률은 4, 7, 10일째 생물을 회수하고 무게를 측정하여 초기 생물무게 값과 비교하여 산출하였다. 4 W-octylphenole 4일 노출 후에 0.
- 성장률은 아래의 식에 의해 실험이 끝나는 시점의 생물무게와 실험 시작 전 생물의 무게를 비교하여 계산하였다.
- 유충과 알은 항온기 내에서 사육하며 광주기는 16:8 (light: dark), 광도는 350~500 lux 형광등, 온도는 20±l℃ 조건에서 사육하였고, 먹이로는 Te- traMin®을 미세하게 처리한 후 공급하였다.
- 퇴적물 독성 시험을 위한 4-wr-octylphenol의 농도는 각각 0.3, 3, 30ppm으로 설정하였는데, 이러한 농도설정 범위는 C. p에 대한 급성 (acute) 치사율 및 만성 (chronic), 성장률. 우화율.
- 퇴적물 독성시험법의 정도관리를 위해서 실험 시작 전과 실험이 끝난 시점에 수질을 측정하였다. 측정항목으로는 수온, pH.
- 퇴적물을 4-femoctylphenol로 spiking 후 28일 동안 C. phmiosus를 이용한 생존율측정을 실시하였다. 생존율은 4, 7, 10, 28일째 시험생물을 계수하여 산출하였다.
- 두부의 구강부분에 있는 대악 (mandible)과 하순기절의 tooth 상태와 기형을 살펴보았다. 하순기 절의 구조는 MLT (median lateral teeth) 부분과 LT (lateral teeth) 부분으로 나누어 관찰하였으며, tooth의 기형 정도에 따라 상태를 기록하였다. 기 형 부위는 MLT, LT 및 MIX로 구분하여 한 부분만 기형이 나타났으면 해당 부분에 기록을 하고 두 부분에 기형이 발생한 경우에는 MIX에 기록을 하여 기형 발생 부분이 중복 기록되는 것을 피하였다.
- 4-terr-octylphenol 은 물에 잘 녹지 않기 때문에 4-fe"-octylphenol 1 g 을 acetone 100 mil] 녹여서 제조하였다. 하지만 acetone 자체의 독성영향이 있기 때문에 유기용매에 대한 대조구를 추가하였고 각 농도에 동일한양으로 acetone을 주입하였다.
- 우화율. 형태학적기형을 보기 위한 농도이며, 48 시간 참조독성시험 (48 hr water only test)을 병행하여 실험하였다(US. EPA, 2001). 노출 기간 동안에 매일 우화한 개체의 머리 부분 안테나 모양의 차이를 통해 암컷과 수컷을 구분하여 성비를 확인하였다.
대상 데이터
- 4-rert-octylphenole Aldrich 사제품인 4-/erf-octylphenol, 97% (C14H22O, CAS number 140-66-9)를 사용하였다. 4-terr-octylphenol 은 물에 잘 녹지 않기 때문에 4-fe"-octylphenol 1 g 을 acetone 100 mil] 녹여서 제조하였다. 하지만 acetone 자체의 독성영향이 있기 때문에 유기용매에 대한 대조구를 추가하였고 각 농도에 동일한양으로 acetone을 주입하였다.
- 제조 하였다. 4-rert-octylphenole Aldrich 사제품인 4-/erf-octylphenol, 97% (C14H22O, CAS number 140-66-9)를 사용하였다. 4-terr-octylphenol 은 물에 잘 녹지 않기 때문에 4-fe"-octylphenol 1 g 을 acetone 100 mil] 녹여서 제조하였다.
- 채집되어진 유충과 알은 안양천에서 채취한 모래와 M4배지 (Elendt and Bias, 1990)를 이용하여 실험실에 순치시켰다. 모래는 600 |am 표준체를 사용하여 내서 생물과 굵은 입자를 제거한 모래를 2 L polyethylene 사각용기에 1 cm 정도 넣었으며 사육수인 M4 배지를 500 mL를 넣어 배양하였다.
- 실험 생물로 사용한 깔따구인 Chironomus plu- ”WWS의 유충과 알은 서울시 금천구 안양천 기아대교 부근에서 채집하여 실험에 사용하였다(Fig. 1). 채집되어진 유충과 알은 안양천에서 채취한 모래와 M4배지 (Elendt and Bias, 1990)를 이용하여 실험실에 순치시켰다.
- 1). 채집되어진 유충과 알은 안양천에서 채취한 모래와 M4배지 (Elendt and Bias, 1990)를 이용하여 실험실에 순치시켰다. 모래는 600 |am 표준체를 사용하여 내서 생물과 굵은 입자를 제거한 모래를 2 L polyethylene 사각용기에 1 cm 정도 넣었으며 사육수인 M4 배지를 500 mL를 넣어 배양하였다.
데이터처리
- C. plumosus를 이용한 48 시간 급성독성시험과 인위적으로 sediment spiking 퇴적물 독성시험의 모든 독성 파라메터 산출과정은 Toxcalc와 SPSS 프로그램을 이용하여 수행되었다. 반수치사농도 (LCm)는 시험물질의 각 농도별 반응 곡선으로부터 maximum likelihood method를 사용하여 산출하였으며, 같은 방법으로 95% 신뢰구간을 산출하였다.
- 독성반응 모델은 probit 모델을 적용하였으며 probit 분석의 조건인 부분 사망(영향) 농도 2개 이상 및 유의한 chi-square 검정을 통과하지 못한 경우에는 Linear Interpolation 방법을 이용하여 산출하였다. 또한 NOEC와 LOEC는 Dunnett's Hest를 실시하여 산출하였으며, 통계 처리에 사용된 검정은 Tukey's HSD test (유의수준 a=0.05)를 사용하였다 이상의 통계 분석은 모두 US. EPA(2000)에서 제시하는 표준시험법을 따라 실시하였다.
이론/모형
- 05)를 사용하였다 이상의 통계 분석은 모두 US. EPA(2000)에서 제시하는 표준시험법을 따라 실시하였다.
- 반수치사농도 (LCm)는 시험물질의 각 농도별 반응 곡선으로부터 maximum likelihood method를 사용하여 산출하였으며, 같은 방법으로 95% 신뢰구간을 산출하였다. 독성반응 모델은 probit 모델을 적용하였으며 probit 분석의 조건인 부분 사망(영향) 농도 2개 이상 및 유의한 chi-square 검정을 통과하지 못한 경우에는 Linear Interpolation 방법을 이용하여 산출하였다. 또한 NOEC와 LOEC는 Dunnett's Hest를 실시하여 산출하였으며, 통계 처리에 사용된 검정은 Tukey's HSD test (유의수준 a=0.
- plumosus를 이용한 48 시간 급성독성시험과 인위적으로 sediment spiking 퇴적물 독성시험의 모든 독성 파라메터 산출과정은 Toxcalc와 SPSS 프로그램을 이용하여 수행되었다. 반수치사농도 (LCm)는 시험물질의 각 농도별 반응 곡선으로부터 maximum likelihood method를 사용하여 산출하였으며, 같은 방법으로 95% 신뢰구간을 산출하였다. 독성반응 모델은 probit 모델을 적용하였으며 probit 분석의 조건인 부분 사망(영향) 농도 2개 이상 및 유의한 chi-square 검정을 통과하지 못한 경우에는 Linear Interpolation 방법을 이용하여 산출하였다.
- 유해물질의 농도별 생물영향결과는 주로 Dun- nett's test를 통해 NOEC (No Observed Effect Con- centration)와 LOEC (Low Observed Effect Concen- tration)를 산출하고, probit analysis를 통해 LC50을산출흐였다
성능/효과
- 4-fe"-octylphenole 0.3 ppm, 3 ppm에서는 성비의 차이가 크지 않았으나 30ppm에서는 암컷의 비율이 월등히 높았다. 내분비계 교란물질인 4-tert- octylphenole 30 ppm의 농도에서 C.
- 4 W-octylphenole 4일 노출 후에 0.3 ppm, 3 ppm에서 대조구와 차이가 없었지만 30 ppm에서는 성장속도가 급격히 떨어짐을 알 수 있었다(Fig. 3).
- plumosus의 우화율을 관찰하였다. 4-7-octylphenole 30 ppm 이하 모든 농도에서 우화에 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다 (Fig. 4). 우화율은 모든 농도에서 90% 이상으로 대조군과 차이가 나타나지 않았으며.
- 4-fe"-octylphenol 에 노출된 깔따구하순기 절에서는 고농도에서 LT (lateral teeth)의 기형 이 발생 하였으며, 대악에서는 tooth의 결실이 일부 관찰되었다. 4-rf-octylphenol에 노출된 C. 유생은 30 ppm의 고농도에서 성장률이 감소하고 암컷의 발생비율이 증가하였으며, 하순기절에 기형 이 관찰되었을 뿐, 그 이하의 농도에서는 생태독성 반응이나 기형이 관찰되지 않았으며, 모든 노출 농도에서 생존율 변화와 대악 기형은 관찰되지 않았다.
- 25 ppm으로 산출되었다. LOEC는 대조군과 비교하였을 때 생물의 영향이 나타나는 가장 낮은 농도로써 4-ferr-octyl- phenole 2.5 ppm으로 산출되었으며, LCme 3.56 ppm으로 나타났다.
- plwiosus를 이용하여 48 시간 노출 후 생물을 계수하여 LC50을 산출하였다. NOEC는 대조군과 비교하였을 때 생물의 영향이 없는 가장 높은 농도로써 4-wt-octylphenole 1.25 ppm으로 산출되었다. LOEC는 대조군과 비교하였을 때 생물의 영향이 나타나는 가장 낮은 농도로써 4-ferr-octyl- phenole 2.
- 3 ppm, 3 ppm에서는 성비의 차이가 크지 않았으나 30ppm에서는 암컷의 비율이 월등히 높았다. 내분비계 교란물질인 4-tert- octylphenole 30 ppm의 농도에서 C. plumosus 컷의 비율이 높게 나타났다(Fig. 5).
- 대조군과 오염물질의 각 농도간의 유의성을 검증하기 위해 Tukey's HSD test (유의수준 a=0.05) 를 실시한 결과, 물질의 농도가 증가함에 따라 생존율이 감소하는 경향이 뚜렷하게 나타났다. 실험에서의 농도설정은 생물이 모두 사망할 수 있는 농도와 모두 생존할 수 있는 농도를 설정하고 그사이에 2개 이상의 농도구간이 있으면 오염물질에 대한 생물의 민감도정도를 파악하는데 유용하다.
- 슬라이드 제 작 중 발생한 인위적인 tooth의 깨짐과 자연적인 tooth의마모는 기형으로 처리하지 않았다. 대조군에서는 tooth에 기형이 발생하지 않았으며 4-Zerf-octyl- phenol 처리군의 경우 tooth의 결실이 3 ppm에서 6.7% (Fig. 6b), tooth가 합쳐진 형태의 기형 이 30 ppm에서 6.3%의 발생률을 보였다(Fig. 6c).
- 생존율은 4, 7, 10, 28일째 시험생물을 계수하여 산출하였다. 본 연구에서는 30 ppm 이 하의 4- tert-octylphenole C. plumosus 생 존율에 큰 영 향을 미치지 않음을 알 수 있었다(Fig 2). 저서성 요각류인 Tigriopus japonicus 5.
- 실험에서의 농도설정은 생물이 모두 사망할 수 있는 농도와 모두 생존할 수 있는 농도를 설정하고 그사이에 2개 이상의 농도구간이 있으면 오염물질에 대한 생물의 민감도정도를 파악하는데 유용하다. 본 연구에서의 농도설정 범위는 일반적인 하천에서 오염될 수 있는 농도범위를 초과하여 설정하였으나 모두 사망한 농도가 없었다. C.
- 05) 를 실시한 결과, 물질의 농도가 증가함에 따라 생존율이 감소하는 경향이 뚜렷하게 나타났다. 실험에서의 농도설정은 생물이 모두 사망할 수 있는 농도와 모두 생존할 수 있는 농도를 설정하고 그사이에 2개 이상의 농도구간이 있으면 오염물질에 대한 생물의 민감도정도를 파악하는데 유용하다. 본 연구에서의 농도설정 범위는 일반적인 하천에서 오염될 수 있는 농도범위를 초과하여 설정하였으나 모두 사망한 농도가 없었다.
- , 2002). 이를 종합해 볼 때 4-remoctylphenol과 같은 alkylphenol류는 매우 높은 농도를 제외하면 일반적으로 깔따구의 생존에는 영향을 미치지 않는다고 할 수 있을 것이다.
- 이번 연구에서는 4-wr-octylphenol에 노출된 깔따구 하순기절 기형 이 LT (lateral teeth)에만 국한적으로 기형이 발생되었다. 곽인실과 이원철(2007)의 연구에서도 nonylphenol에 노출된 개체는 MLT보다 LTV] 기형이 많이 발생한 것으로 보고하였으며, 이와는 대조적으로 DEHP (곽인실과 정경숙, 2008), tebufenozide (Kwak and Lee, 2005b)에 노출된 깔따구에서는 MLT에서 기형이 많이 관찰되었다.
후속연구
- plimiosus는 동종을 잡아먹는 동종포식 (cannivalism)이 있었으나 사육 시는 공간과 먹이를 충분히 공급하여 요인을 베제하였다. C. plumosus를 지표생물로 이용하기 위해서는 여러 오염물질에 96 시간 동안 노출시킨 후 민감도를 산출하고 시험생물의 생리, 생태적 특징에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다. 또한 US.
- plumosus를 지표생물로 이용하기 위해서는 여러 오염물질에 96 시간 동안 노출시킨 후 민감도를 산출하고 시험생물의 생리, 생태적 특징에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다. 또한 US.EPA나 OECD, ECOTOX data base에 제시된 국외종 깔따구와 국내종 깔따구의 민감도를 비교하고 표준 독성시험법의 기초자료로서 활용되어야 할 것이다.
- 곽인실과 이원철(2007)의 연구에서도 nonylphenol에 노출된 개체는 MLT보다 LTV] 기형이 많이 발생한 것으로 보고하였으며, 이와는 대조적으로 DEHP (곽인실과 정경숙, 2008), tebufenozide (Kwak and Lee, 2005b)에 노출된 깔따구에서는 MLT에서 기형이 많이 관찰되었다. 이러한 현상이 노출된 물질에 따라 달리 나타나는 것인지에 대한 추후 연구가 필요하다.
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