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문제 정의
- 또한 Bernet 등(2003)도 RAPD 분석의 낮은 재현성을 해결하기 위해서는 폴리아크릴아마이드겔을 이용하는 high-resolution 전기영동 하에서 재현성 있는 밴드만을 선발해야 하고, 특이적인 프라이머를 제작하기 위해 클로닝과 염기서열을 분석하여 SCAR 또는 cleaved amplified polymorphic sequence(CAPS)와 같은 마커로 전환해야 한다고 보고하였다. 따라서 본 실험에서는 선발된 품종 특이적 RAPD 밴드 중 1,000bp 이하 크기의 52종을 대상으로 하여 클로닝과 염기서열 분석을 통해 SCAR 마커로 전환하고자 하였다. 그 결과 사과 품종을 구분할 수 있는 총 17종의 품종 특이적 SCAR 마커가 개발되었고(Table 3), SCAR 프라이머의 염기서열은 Table 3에 나타내었다.
- Sequence characterized amplified region(SCAR) 마커는 RAPD 마커의 단점을 개선하기 위하여 선발된 RAPD 밴드의 염기서열을 분석한 후 상대적으로 긴 프라이머(18-24-mer)를 설계하여 높은 annealing 온도에서 PCR을 수행함으로써 재현성과 안정성이 높을 뿐만 아니라 프라이머 설계를 바꾸어 공우성 표지로 전환할 수도 있다(Paran과 Michelmore, 1993). 따라서 본 연구에서는 사과 국내 육성 신품종의 보다 신속하고 정확한 판별이 가능한 SCAR 마커를 개발하고 그 실용성을 검정하고자 하였다.
제안 방법
- 1. Amplified fragment patterns of OPL-01 random primer from 31 apple cultivars (A) and converted into SCAR markers (B, C). Arrows indicated RAPD and SCAR markers.
- PCR 반응은 genomic DNA 40ng, 1 × PCR buffer(Genetbio, Korea), 5pmol 임의 프라이머, 200μM dNTP, 3mM MgCl2와 0.4 units Taq DNA polymerase(Genetbio, Korea)를 첨가하여, 반응액을 12.5μL로 조정하여 사용하였다.
- 5μL로 조정하여 사용하였다. PCR 반응은 thermocycler(iCycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 다음과 같은 프로그램으로 수행하였다 94℃에서 5분간 초기 변성시키고, 94℃에서 45초(denaturing), 37℃에서 45초(annealing); 그리고 72℃에서 2분간(extension) 과정을 10회 반복 수행한 다음 94℃에서 45초, 42℃에서 45초, 그리고 72℃에서 2분간 30회 반복한 후 72℃에서 5분간 처리하였다. 증폭된 PCR 생성물은 1.
- PCR은 총 15μL 반응액에 genomic DNA 40ng, 200μM dNTP, 5pmol SCAR 프라이머, 1 × PCR buffer(Genetbio, Korea) 및 PCR 반응시 비특이적 DNA 증폭을 최소화하기 위하여 0.5unit의 Hot-start Taq DNA polymerase(Genetbio, Korea)를 첨가하여 수행하였다.
- 사과 RAPD 분석에 적합한 프라이머를 선발하기 위해서 Operon(Operon Technologies, Alameda, CA. USA)과 University of British Columbia(UBC, Vancouver, BC, Canada)에서 제조된 10개의 염기로 구성된 228종의 프라이머를 검정하였다. 품종 간 다형성을 나타내는 RAPD 마커 선발에는 프라이머 검정에서 선발된 총 30종의 임의 프라이머를 이용하였다(Table 2).
- 본 연구에 사용한 재료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 보존 중인 사과 국내 육성 품종 16품종과 도입 15품종을 포함한 총 31품종을 이용하였다(Table 1). 사과 어린잎을 채취하고 DNeasy plant mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 0.
- 이 균주로부터 plasmid DNA를 분리하였고 삽입된 DNA 전 염기서열을 자동 DNA 분석기(ABI 310, Perkin Elmer, Boston, USA)를 이용하여 분석하였다. 선발된 RAPD 마커의 염기서열 분석 결과를 토대로 하여 선발 프라이머의 10개의 염기를 포함하거나 포함하지 않는 24-28 mer 크기의 SCAR 프라이머 작성은 Primer3(http://frodo.wi.mit.edu) 프로그램을 이용하였고, 1개의 RAPD 마커당 4조합 이상의 SCAR 프라이머를 검정하였다. PCR은 총 15μL 반응액에 genomic DNA 40ng, 200μM dNTP, 5pmol SCAR 프라이머, 1 × PCR buffer(Genetbio, Korea) 및 PCR 반응시 비특이적 DNA 증폭을 최소화하기 위하여 0.
- 선발된 품종 특이적인 RAPD 마커의 염기서열 분석을 위해 선발된 DNA 밴드를 잘라내고 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 TOPO-TA cloning system(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 pCR2.
- coli TOP10에 형질전환시킨 후 DNA가 삽입된 균주를 선발하였다. 이 균주로부터 plasmid DNA를 분리하였고 삽입된 DNA 전 염기서열을 자동 DNA 분석기(ABI 310, Perkin Elmer, Boston, USA)를 이용하여 분석하였다. 선발된 RAPD 마커의 염기서열 분석 결과를 토대로 하여 선발 프라이머의 10개의 염기를 포함하거나 포함하지 않는 24-28 mer 크기의 SCAR 프라이머 작성은 Primer3(http://frodo.
- PCR 반응은 thermocycler(iCycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 다음과 같은 프로그램으로 수행하였다 94℃에서 5분간 초기 변성시키고, 94℃에서 45초(denaturing), 37℃에서 45초(annealing); 그리고 72℃에서 2분간(extension) 과정을 10회 반복 수행한 다음 94℃에서 45초, 42℃에서 45초, 그리고 72℃에서 2분간 30회 반복한 후 72℃에서 5분간 처리하였다. 증폭된 PCR 생성물은 1.4% 아가로스겔에서 150V로 3시간 동안 전기영동하여 품종 간 다형성을 탐색하였다.
- 추출된 DNA는 0.8% 아가로스겔에 전기영동하여 확인하였고 DNA 양은 비색계(NanoDrop 2000, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)로 정량한 후 10ng･μL-1의 농도로 희석하여 PCR분석에 이용하였다.
- 선발된 품종 특이적인 RAPD 마커의 염기서열 분석을 위해 선발된 DNA 밴드를 잘라내고 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 TOPO-TA cloning system(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 pCR2.1-TOPO vector에 넣어 E. coli TOP10에 형질전환시킨 후 DNA가 삽입된 균주를 선발하였다. 이 균주로부터 plasmid DNA를 분리하였고 삽입된 DNA 전 염기서열을 자동 DNA 분석기(ABI 310, Perkin Elmer, Boston, USA)를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- Table 4. Genotypes detected by 17 SCAR markers among 31 apple cultivars.
- UBC408 프라이머에서 유래한 약 590bp 크기의 밴드는 A408_592 SCAR 마커로 전환되었는데 ‘홍로’, ‘서광’, ‘새나라’, ‘선홍’, ‘만복’, ‘홍소’, ‘여홍’, ‘피크닉’, ‘Sansa’, ‘Jonathan’, ‘Kougetsu’, ‘Yoko’, ‘Spur Earlyblaze’ 품종에서 증폭되었다. OPO04 프라이머로 증폭된 710bp와 780bp 크기의 밴드는 각각 AO04_711과 AO04_779 마커로 전환되었다. AO04-711마커는 ‘홍로’, ‘감홍’, ‘홍금’, ‘만복’, ‘홍안’, ‘여홍’, ‘Tsugaru’, ‘Jonagold’, ‘Red Delicious’, ‘Fuji’, ‘Senshu’, ‘Ralls Janet’, ‘Yoko’, ‘Spur Earlyblaze’ 품종에서 증폭되었고, AO04_779 마커는 ‘추광’, ‘새나라’, ‘화홍’, ‘선홍’, ‘서홍’, ‘만복’, ‘홍소’, ‘홍안’, ‘피크닉’, ‘Red Delicious’, ‘Fuji’, ‘Jonathan’, ‘Kougetsu’, ‘Yoko’ 품종들에서만 나타났다.
- Koller 등(1993)은 사과 11개 품종을 대상으로 각각의 품종에 대해 시간을 달리하여 5번씩 RAPD 분석을 반복하여 수행한 결과 단일 품종의 밴드패턴이 일정하지 않고 밴드의 수에서 차이가 나는 것이 관찰되었다고 보고한 바 있다. 따라서 본 실험에서는 프라이머 별로 RAPD 분석을 2번씩 반복하여 재현성 있게 나타나는 밴드만을 마커로 선발하였다. Fig.
- 본 연구에 사용한 재료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 보존 중인 사과 국내 육성 품종 16품종과 도입 15품종을 포함한 총 31품종을 이용하였다(Table 1). 사과 어린잎을 채취하고 DNeasy plant mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다.
- 선발된 30종의 임의 프라이머를 이용하여 사과 31품종을 대상으로 RAPD 분석한 결과 재현성 있고 품종 판별용 마커로 이용할 수 있는 83개의 마커를 선발하였다(Table 2). 프라이머에 따라 선발된 다형성 밴드의 수는 1-7개로 평균 2.
- USA)과 University of British Columbia(UBC, Vancouver, BC, Canada)에서 제조된 10개의 염기로 구성된 228종의 프라이머를 검정하였다. 품종 간 다형성을 나타내는 RAPD 마커 선발에는 프라이머 검정에서 선발된 총 30종의 임의 프라이머를 이용하였다(Table 2). PCR 반응은 genomic DNA 40ng, 1 × PCR buffer(Genetbio, Korea), 5pmol 임의 프라이머, 200μM dNTP, 3mM MgCl2와 0.
성능/효과
- AL01_343 마커는 31개 품종 중 ‘서광’ 품종에서만(Table 4, Fig. 1C) 특이적으로 증폭되었고, AT06-453는 ‘홍로’ 품종에서만 나타나 쉽게 품종 판별이 가능하였다(Table 4).
- AO04-711마커는 ‘홍로’, ‘감홍’, ‘홍금’, ‘만복’, ‘홍안’, ‘여홍’, ‘Tsugaru’, ‘Jonagold’, ‘Red Delicious’, ‘Fuji’, ‘Senshu’, ‘Ralls Janet’, ‘Yoko’, ‘Spur Earlyblaze’ 품종에서 증폭되었고, AO04_779 마커는 ‘추광’, ‘새나라’, ‘화홍’, ‘선홍’, ‘서홍’, ‘만복’, ‘홍소’, ‘홍안’, ‘피크닉’, ‘Red Delicious’, ‘Fuji’, ‘Jonathan’, ‘Kougetsu’, ‘Yoko’ 품종들에서만 나타났다.
- 그 결과 사과 품종을 구분할 수 있는 총 17종의 품종 특이적 SCAR 마커가 개발되었고(Table 3), SCAR 프라이머의 염기서열은 Table 3에 나타내었다. OPL01 프라이머로부터 증폭된 약 850bp와 340bp 크기의 RAPD 밴드는 염기서열 분석 결과 각각 851bp와 343bp크기로 염기서열 양끝에 RAPD에 사용하였던 10개의 염기서열이 존재하여 선발된 RAPD 마커의 염기서열로 확인되었다. 이들은 SCAR 마커로 전환 후 단일밴드로 나타나 품종 동정을 용이하게 해 주었고(Fig.
- 품종판별이 가능한 SCAR 마커 7조합으로는 AL1_427, AN11_433, AN08_566, A408_592, AK17_653, AM16_708, AO04_779와 A330_424, AN11_433, AG14_502, AN08_566, A408_592, AK17_653, AO04_779 또는 A330_424, AN11_433, AK14_564, A408_592, AK17_653, AM16_708, AT14_789이다. 개발된 이들 SCAR 마커는 PCR기기와 아가로스겔 전기영동 장치만 갖춘 실험실에서 쉽고 편리하게 분석할 수 있는 장점이 있다. 금후 사과 품종 판별을 위해서는 기존품종이나 신품종에 대해 효율적으로 다형성을 검출하는 기술이 필요하므로 AFLP나 SSR 분석 등을 이용하여 DNA 다형성 정보를 계속 축적할 필요가 있다고 판단된다.
- 따라서 본 실험에서는 선발된 품종 특이적 RAPD 밴드 중 1,000bp 이하 크기의 52종을 대상으로 하여 클로닝과 염기서열 분석을 통해 SCAR 마커로 전환하고자 하였다. 그 결과 사과 품종을 구분할 수 있는 총 17종의 품종 특이적 SCAR 마커가 개발되었고(Table 3), SCAR 프라이머의 염기서열은 Table 3에 나타내었다. OPL01 프라이머로부터 증폭된 약 850bp와 340bp 크기의 RAPD 밴드는 염기서열 분석 결과 각각 851bp와 343bp크기로 염기서열 양끝에 RAPD에 사용하였던 10개의 염기서열이 존재하여 선발된 RAPD 마커의 염기서열로 확인되었다.
- 또한 AK17_653 마커는 ‘홍로’, ‘서광’, ‘추광’, ‘선홍’, ‘썸머드림’, ‘만복’, ‘홍소’, ‘Pink Lady’, ‘Mollie’s Delicious’ 품종의 판별 마커로 이용 가능하였다(Table 4).
- 본 실험에서는 개발된 SCAR 마커는 소수의 국내에서 육성되고 앞으로 유망품종으로 기대되는 신품종들과 기존 도입 품종들을 대상으로 하였기 때문에 다양한 사과 유전자원에 적용하기는 어렵지만 개발된 17종의 SCAR마커 중 다양한 6-7조합을 이용하여 16종의 사과 국내 육성 품종의 판별이 가능하였다. 품종 판별에 이용된 SCAR 마커 6조합으로는 예를 들면 AN11_433, AN08_566, A408_592, AK17_653, AO04_711, AO04_779와 AW15_368, AN11_433, A408_592, AK17_653, AO04_711, AO04_779, 또는 AL1_427, AN11_433, AN08_566, A408_592, AK17_653, AO04_779이다.
- 이와 같이 사라진 다형성을 회복하기 위한 방법으로는 프라이머 길이의 조절, annealing 온도의 조절, 다양한 제한효소의 처리가 시도되었으나(Jun 등, 2005; Paran과 Michelmore, 1993; Xu 등, 1995) 많은 노력이 필요한데 반하여 다형성을 얻지 못하는 경우가 있다. 본 실험에서는 미세한 크기 차이를 가진 다형성 밴드를 아가로스 젤 상에서 분리해 내기 어렵기 때문에 Paran과 Michelmore(1993)이 언급한 바와 같이 선발된 다형성 밴드에 여러 밴드들이 혼재되어 있을 가능성이 있어 RAPD 마커 중 약 33%만 SCAR 마커로 전환된 것으로 추정되었다.
- 그러나 개발된 SCAR 마커가 품종들의 pedigree data를 반영하지는 못하였다. 선발된 RAPD 마커의 염기서열을 바탕으로 제작한 SCAR 프라이머가 모두 단일밴드로는 합성되지 않았고 RAPD 마커인 OPK17_650과 OPN08_850등은 SCAR 전환 후 프라이머 조합에 따라 공우성 마커(co-dominant)로 나타났다. 또한 나머지 SCAR 프라이머들은 PCR 반응 후 RAPD분석에서는 확인할 수 없었던 품종에서 증폭되어 나타났는데 이와 같은 현상은 RAPD 마커를 SCAR 마커로 전환하는 과정에서 흔히 나타나는 것으로 SCAR마커를 처음 제안한 Paran과 Michelmore(1993)도 언급한 바 있다.
- 약 850bp크기의 밴드는 국내 육성 품종인 ‘홍로’, ‘선홍’, ‘홍소’, ‘피크닉’과 도입품종인 ‘Sansa’, ‘Pink Lady’와 ‘Gala’에서만 증폭되었고, 약 340bp의 밴드는 ‘서광’ 품종에서만 특이적으로 증폭되었다(Fig. 1A).
후속연구
- 개발된 이들 SCAR 마커는 PCR기기와 아가로스겔 전기영동 장치만 갖춘 실험실에서 쉽고 편리하게 분석할 수 있는 장점이 있다. 금후 사과 품종 판별을 위해서는 기존품종이나 신품종에 대해 효율적으로 다형성을 검출하는 기술이 필요하므로 AFLP나 SSR 분석 등을 이용하여 DNA 다형성 정보를 계속 축적할 필요가 있다고 판단된다.
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