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문제 정의
- 미생물군집의 정보를 폐기물매립장의 안정화 평가에 활용하기 위하여 매립특성 및 매립폐기물의 성상이 다른 폐기물 매립장의 침출수 미생물을 대상으로 분자생물학적 미생물군집해석법인 T-RFLP법을 적용한 결과 아래와 같은 결론을 얻었다.
- 서로 다른 특성을 갖는 4 곳의 실제규모 폐기물매립장 내부에서 채취한 침출수에 존재하는 미생물의 군집을 비교하였으며, 매립이 진행 중인 폐기물매립장을 대상으로 16S rDNA의 클론 라이브러리 해석을 수행하여 T-RFLP법의 결과와 비교 분석하였다. 본 연구를 통하여 폐기물매립장 안정화 촉진에 관여하는 미생물군집의 평가에 T-RFLP법의 활용 가능성을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 이와 같은 실시간 PCR법에 관련된 실험 및 형광 quenching양의 계산은 선행 연구에서 제시된 방법을 따랐다.7) 증폭된 PCR산물은 MicroSpin S-400 HR columns (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 정제하였다.
- 9)를 이용하여 alignment 하고, 98% 이상 동일한 염기 서열을 나타낸 클론들을 그룹으로 묶어 총 63개의 phylotype 그룹을 얻었다.8) 이 가운데 3개 이상의 클론이 속하는 phylotype 그룹을 대상으로 대표적인 클론을 하나씩 선택하여 M 13f와 M 13r primer로 클로닝된 16S rDNA를 증폭하였다. 증폭된 PCR산물을 정제 및 희석한 후 이를 template로 하여 T-RFLP해석에 사용한 primer로 PCR증폭하였다.
- A 폐기물매립장 침출수의 박테리아 16S rDNA PCR산물을 대상으로 다양한 종류의 제한효소(Hha I, Hae III, Msp I, 상기 3가지 제한효소의 혼합)로 처리하여 미생물군집의 T-RF 패턴 변화를 조사하였다. Fig.
- 증폭된 PCR산물은 전기영동을 통하여 확인하고 Microspin S-400 HR columns(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)을 이용해서 정제하였다. DNA sequencer(Model 377, Applied Biosystem, USA)를 이용해서 클론의 16S rDNA 염기서열을 분석하고, RDP(Ribosomal Database Project)에서 제공하는 CHECK CHIMERA 프로그램으로 chimera artifact를 확인하였다. 분석된 16S rDNA 염기서 열들은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST 검색을 통해서 클론의 염기서열과 가장 가까운 계통그룹과 종을 확인하였다.
- 증폭된 PCR산물을 정제 및 희석한 후 이를 template로 하여 T-RFLP해석에 사용한 primer로 PCR증폭하였다. PCR산물은 정제 후, 상기 T-RFLP분석에서 사용한 방법과 동일하게 제한효소(Hae III, Hha I, Msp I 및 상기 3가지 제한효소의 혼합 처리)로 절단하고 T-RF를 분석 하였다.
- , Palo Alto, CA, USA), 각 폐기물매립장의 침출수에서 추출한 30 ng/ml의 DNA 1 ㎕를 첨가였다. PCR의 cycle에 따른 BODIPY FL 형광의 quenching된 양을 측정함으로써 PCR 산물의 증가를 모니터링하였으며, PCR산물이 지수함수적으로 증가하는 초기 단계(cycle 23)에서 PCR을 중단함으로써 각 DNA 시료에 존재하는 16S rDNA의 상대적인 양을 최대한 반영하고자 하였다(Fig. 1). 이와 같은 실시간 PCR법에 관련된 실험 및 형광 quenching양의 계산은 선행 연구에서 제시된 방법을 따랐다.
- T-RFLP법을 이용하여 폐기물매립장의 구조, 매립 폐기물 종류, 운영 기간에 따른 침출수 미생물군집의 변화를 조사하기 위하여 폐기물매립장 규모 및 매립특성이 다른 폐기물매립장 4곳의 침출수 미생물군집의 T-RF 패턴을 분석하였다. Fig.
- T-RFLP분석용 primer에 의해 증폭된 16S rDNA PCR산물에 제한효소(Hae III, Hha I, Msp I 및 상기 3가지 제한효소의 혼합 처리; Takara Inc., Japan) 5 unit을 첨가하여 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응산물은 Sephadex G-50 (GE Healthcare Life Science, Japan)로 정제하여 말단제한절편(Terminal Restriction Fragment; T-RF)을 회수하였다.
- 정제된 T-RF 1 ㎖와 TAMURA 형광으로 수식된 DNA size marker 1 ㎕, Formamide 12 ㎕를 혼합한 후, 95℃에서 2분간 반응시켜 단일사슬 말단제한절편(singlestranded Terminal Restriction Fragment; ssT-RF)를 생성하고 얼음 위에서 식혔다. ssT-RF는 ABI 377 sequencer 를 이용하여 gene scan mode로 분석하였다. 각 제한효소에 따른 T-RF들의 형광강도(peak height) 값을 그래프로 나타내었으며, SPSS 14 software (SPSS Inc.
- white colony만을 선택 하여 클로닝된 부분만을 증폭시키기 위해 M 13f(5'-AGT CAC GAC GTT GTA-3')와 M 13r(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3') primer를 사용한 colony PCR을 실시하였다.
- 또한, cloning 분석용 PCR증폭을 위해 형광물질로 표지되지 않은 Eub 27f와 Eub 1406r를 primer로 사용한 별도의 PCR용액을 준비하였다. 각 PCR용액 25 ㎕에는 최종농도 0.5 mM의 primer, 160 mM의 각 dNTP, 50 mM의 Tris-HCl(pH 8.3), 1.5 mM MgCl 2, 250 g/ml bovine serum albumin, 0.5 U의 Tag polymerase (Gene Tag, Nippon Gene Co. Ltd., Tokyo, Japan), 0.32 의 TagStart antibody (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, USA), 각 폐기물매립장의 침출수에서 추출한 30 ng/ml의 DNA 1 ㎕를 첨가였다. PCR의 cycle에 따른 BODIPY FL 형광의 quenching된 양을 측정함으로써 PCR 산물의 증가를 모니터링하였으며, PCR산물이 지수함수적으로 증가하는 초기 단계(cycle 23)에서 PCR을 중단함으로써 각 DNA 시료에 존재하는 16S rDNA의 상대적인 양을 최대한 반영하고자 하였다(Fig.
- , Japan) 5 unit을 첨가하여 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응산물은 Sephadex G-50 (GE Healthcare Life Science, Japan)로 정제하여 말단제한절편(Terminal Restriction Fragment; T-RF)을 회수하였다. 정제된 T-RF 1 ㎖와 TAMURA 형광으로 수식된 DNA size marker 1 ㎕, Formamide 12 ㎕를 혼합한 후, 95℃에서 2분간 반응시켜 단일사슬 말단제한절편(singlestranded Terminal Restriction Fragment; ssT-RF)를 생성하고 얼음 위에서 식혔다.
- DNA sequencer(Model 377, Applied Biosystem, USA)를 이용해서 클론의 16S rDNA 염기서열을 분석하고, RDP(Ribosomal Database Project)에서 제공하는 CHECK CHIMERA 프로그램으로 chimera artifact를 확인하였다. 분석된 16S rDNA 염기서 열들은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST 검색을 통해서 클론의 염기서열과 가장 가까운 계통그룹과 종을 확인하였다.
- 본 연구에서는 폐기물매립장의 안정화에 관여하는 미생물 군집의 구조와 다양성을 해석하기 위하여 박테리아의 16S rDNA에 기초한 T-RFLP법을 이용하였다. 서로 다른 특성을 갖는 4 곳의 실제규모 폐기물매립장 내부에서 채취한 침출수에 존재하는 미생물의 군집을 비교하였으며, 매립이 진행 중인 폐기물매립장을 대상으로 16S rDNA의 클론 라이브러리 해석을 수행하여 T-RFLP법의 결과와 비교 분석하였다. 본 연구를 통하여 폐기물매립장 안정화 촉진에 관여하는 미생물군집의 평가에 T-RFLP법의 활용 가능성을 제시하고자 한다.
- 이와 동시에 T-RFLP해석을 위한 PCR증폭을 위해 형광 FAM6으로 5'말단을 표지한 Eub 27f와 Eub 1406r을 사용한 PCR용 액을 별도로 준비하였다.
- 추출한 DNA를 주형으로 사용하여 16S rDNA를 증폭시키기 위한 PCR반응을 수행하였다. 일반적인 PCR 방법으로는 시료에 존재하는 박테리아 16S rDNA의 상대적인 양을 전혀 반영할 수 없기 때문에, PCR 산물의 증폭과정을 모니터링할 수 있는 실시간 PCR 장치인 LightCycler(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 PCR을 수행하였다 (Table 3). PCR 산물을 모니터링하기 위하여 5'말단에 형광 BODIFY FL로 표지한 Eub 27f(E.
- 반응산물은 Sephadex G-50 (GE Healthcare Life Science, Japan)로 정제하여 말단제한절편(Terminal Restriction Fragment; T-RF)을 회수하였다. 정제된 T-RF 1 ㎖와 TAMURA 형광으로 수식된 DNA size marker 1 ㎕, Formamide 12 ㎕를 혼합한 후, 95℃에서 2분간 반응시켜 단일사슬 말단제한절편(singlestranded Terminal Restriction Fragment; ssT-RF)를 생성하고 얼음 위에서 식혔다. ssT-RF는 ABI 377 sequencer 를 이용하여 gene scan mode로 분석하였다.
- 제한효소 Msp I로 자른 T-RF 패턴을 바탕으로 각 매립장 침출수의 종 다양성 지수를 산출하고 비교하였다. 매립이 30% 이루어진 C 폐기물 매립장의 종 다양성(H: 4.
- white colony만을 선택 하여 클로닝된 부분만을 증폭시키기 위해 M 13f(5'-AGT CAC GAC GTT GTA-3')와 M 13r(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3') primer를 사용한 colony PCR을 실시하였다. 증폭된 PCR산물은 전기영동을 통하여 확인하고 Microspin S-400 HR columns(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)을 이용해서 정제하였다. DNA sequencer(Model 377, Applied Biosystem, USA)를 이용해서 클론의 16S rDNA 염기서열을 분석하고, RDP(Ribosomal Database Project)에서 제공하는 CHECK CHIMERA 프로그램으로 chimera artifact를 확인하였다.
- 8) 이 가운데 3개 이상의 클론이 속하는 phylotype 그룹을 대상으로 대표적인 클론을 하나씩 선택하여 M 13f와 M 13r primer로 클로닝된 16S rDNA를 증폭하였다. 증폭된 PCR산물을 정제 및 희석한 후 이를 template로 하여 T-RFLP해석에 사용한 primer로 PCR증폭하였다. PCR산물은 정제 후, 상기 T-RFLP분석에서 사용한 방법과 동일하게 제한효소(Hae III, Hha I, Msp I 및 상기 3가지 제한효소의 혼합 처리)로 절단하고 T-RF를 분석 하였다.
- , Carsbad, CA, USA)을 사용하여 핵산을 추출하였다. 추출된 DNA는 정제한 후 PicoGreen dsDNA quantitation kit(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA)를 사용하여 정량하였다.
- 추출한 DNA를 주형으로 사용하여 16S rDNA를 증폭시키기 위한 PCR반응을 수행하였다. 일반적인 PCR 방법으로는 시료에 존재하는 박테리아 16S rDNA의 상대적인 양을 전혀 반영할 수 없기 때문에, PCR 산물의 증폭과정을 모니터링할 수 있는 실시간 PCR 장치인 LightCycler(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 PCR을 수행하였다 (Table 3).
- 침출수내에 존재하는 미생물은 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 회수하였으며, 필터를 멸균된 가위를 사용하여 적당한 크기로 절단한 후, bead bitting방법을 적용하는 DNA추출 kit(BIO101, Inc., Carsbad, CA, USA)을 사용하여 핵산을 추출하였다. 추출된 DNA는 정제한 후 PicoGreen dsDNA quantitation kit(Molecular Probes, Inc.
- 클론해석 결과 얻어진 총 63개의 phylotype 그룹 가운데 3개 이상의 클론이 속하는 13개의 phylotype그룹을 대상으로 대표적인 클론을 하나씩 임의로 선택하여 4가지 종류의 제한효소 처리에 따른 T-RF를 분석하였다. Table 3에 나타낸 바와 같이 가장 많은 클론이 속하는 phylotype 그룹은 Uncultured ε-proteobacterium과 높은 상동성을 보였다.
- 클론해석을 위한 primer를 사용하여 증폭된 16S rDNA PCR산물을 pGEM-T vector (Promega, USA)를 이용하여 cloning 하였다. PCR 산물을 vector, ligase, buffer와 혼합한 후 16℃에서 1시간 동안 배양하였다.
-
2. A 폐기물매립장 침출수 미생물군집의 16S rDNA 클론 라이브러리 해석
해양을 매립해 조성한 A 폐기물매립장의 침출수 미생물군집의 T-RFLP 해석 결과를 검증하기 위하여 침출수 미생물군집의 16S rDNA clone library를 구축하고, 클론 해석을 수행하였다
. 총 132개의 클론을 해석하여 98%의 상동성을 보인 클론을 같은 phylotype으로 분류함으로써총 63개의 phylotype그룹을 얻었다(Fig.
대상 데이터
- PCR 산물을 모니터링하기 위하여 5'말단에 형광 BODIFY FL로 표지한 Eub 27f(E. coli position 8-27: '-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 Eub 1406r(E. oli position 1389-1406: 5'-ACG GGC GGT GTG TAC AAG-3')를 primer로 사용한 PCR용액을 준비하였다.
- 이와 동시에 T-RFLP해석을 위한 PCR증폭을 위해 형광 FAM6으로 5'말단을 표지한 Eub 27f와 Eub 1406r을 사용한 PCR용 액을 별도로 준비하였다. 또한, cloning 분석용 PCR증폭을 위해 형광물질로 표지되지 않은 Eub 27f와 Eub 1406r를 primer로 사용한 별도의 PCR용액을 준비하였다. 각 PCR용액 25 ㎕에는 최종농도 0.
- 일본 관서 지역내 소재하는 폐기물매립장 크기, 매립된 폐기물량, 매립된 폐기물 종류가 다른 4 곳(A, B, C, D)의 폐기물매립장에서 시추공을 통하여 침출수 시료를 채취하였다(Table 1). 해양을 매립하여 만들어진 A 폐기물매립장은 1980년대 말에 건설된 용량 3,000,000 ㎥의 매립장으로 전체용량의 67%가 플라스틱, 유기성 슬러지, 목재, 슬래그 등으로 매립된 상태였으며, 다양한 시추공을 통해서 채취된 침출수의 pH, COD, BOD, TN, TP 농도는 table 2에 나타낸 바와 같다.
- D 폐기물매립장은 불법폐 기물매립장으로 매립연도를 알 수 없었으며, 잡다한 성상의 폐기물이 복토층 없이 불법투기 후 매립된 상태였다. 침출수의 채취는 2002년 5월, 4곳의 폐기물 매립장에서 시추공을 통하여 채취한 침출수를 1 L 용량의 뚜껑이 달린 유리병에 가득 채운 후 냉장 보관한 상태에서 실험실로 운반되었으며, 도착 즉시 핵산을 추출하였다.
데이터처리
- ssT-RF는 ABI 377 sequencer 를 이용하여 gene scan mode로 분석하였다. 각 제한효소에 따른 T-RF들의 형광강도(peak height) 값을 그래프로 나타내었으며, SPSS 14 software (SPSS Inc. USA)를 이용하여 T-RF pattern의 주성분 분석(Principal Component Analysis; PCA)을 수행하였다. 그리고 미생물 군집구조의 정량적 분석을 위해서 다음 식(1)과 (2)를 이용하여 Shannon-Weiner 종다양성 지수(H)와 Simpson 종다양성 지수(D)를 구하였다.
이론/모형
- USA)를 이용하여 T-RF pattern의 주성분 분석(Principal Component Analysis; PCA)을 수행하였다. 그리고 미생물 군집구조의 정량적 분석을 위해서 다음 식(1)과 (2)를 이용하여 Shannon-Weiner 종다양성 지수(H)와 Simpson 종다양성 지수(D)를 구하였다.
- 본 연구에서는 폐기물매립장의 안정화에 관여하는 미생물 군집의 구조와 다양성을 해석하기 위하여 박테리아의 16S rDNA에 기초한 T-RFLP법을 이용하였다. 서로 다른 특성을 갖는 4 곳의 실제규모 폐기물매립장 내부에서 채취한 침출수에 존재하는 미생물의 군집을 비교하였으며, 매립이 진행 중인 폐기물매립장을 대상으로 16S rDNA의 클론 라이브러리 해석을 수행하여 T-RFLP법의 결과와 비교 분석하였다.
- 1). 이와 같은 실시간 PCR법에 관련된 실험 및 형광 quenching양의 계산은 선행 연구에서 제시된 방법을 따랐다.7) 증폭된 PCR산물은 MicroSpin S-400 HR columns (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 정제하였다.
성능/효과
- 그리고 각 클론를 제한효소 Hha I로 처리하였을 경우에는 61 bp의 T-RF를 나타냈으며, A 폐기물매립장의 침출수를 Hae I으로 처리한 T-RFLP 분석 결과(Fig. 2)에서도 61 bp 의 동일한 T-RF가 우점화 되는 것을 확인할 수 있었다.
- 나. 16S rDNA 클론 해석법을 통해서 확인된 폐기물매립장 침출수내 우점 미생물 군집은 T-RFLP법을 통한 우점 T-RF로 확인할 수 있었다.
- 주성분분석은 관찰된 여러 변수들 중 서로 연관성이 있는 변수들끼리 묶어 새로운 변수를 찾아서 미생물 군집 유사성을 통계적으로 분석하는 기법이며, 정확도가 떨어질 수는 있으나 전체적인 경향판단은 가능하다.17) Hha I, Hae III, Msp I 및 상기 3가지 제한효소 혼합처리의 모든 경우에 있어서 불법폐기물매립장의 침출수 미생물군집은 다른 3곳의 폐기물처리장 침출수 미생물군집과 구별되는 것으로 나타났다. 제한효소 가운데에서도 Hae III를 사용한 경우에 불법폐기물매립장 침출수의 미생물군집이 다른 곳의 미생물군집과 가장 큰 차이를 보였으며, Msp I를 사용한 경우에도 구분은 되었으나, 그 정도가 분명하지 못하였다.
- A 폐기물매립장의 침출수에는 다양한 종류의 ε -Proteobacteria가 혼재하는 것으로 나타났다.
- A폐기물매립장의 침출수 클론해석을 통하여 얻어진 132개의 phylotype(계통형)의 염기서열들은 BioEdit(version 5.0.9)를 이용하여 alignment 하고, 98% 이상 동일한 염기 서열을 나타낸 클론들을 그룹으로 묶어 총 63개의 phylotype 그룹을 얻었다.8) 이 가운데 3개 이상의 클론이 속하는 phylotype 그룹을 대상으로 대표적인 클론을 하나씩 선택하여 M 13f와 M 13r primer로 클로닝된 16S rDNA를 증폭하였다.
- 가. T-RFLP를 활용해서 침출수에 존재하는 우점 미생물군집의 상대적 분포비를 확인할 수 있었다.
- 다. T-RFLP법을 이용하여 매립장의 구조, 매립 폐기물 종류, 운영 기간이 다른 폐기물매립장 침출수내 미생물군집 구조의 차이를 확인 할 수 있었다.
- 같은 방식으로 13개 phylotype그룹의 대표 클론에 대한 제한효소처리 결과를 살펴보면, Table 4에 나타낸 바와 같이 제한효소로 Hha I을 사용한 경우에는 48 bp, 52~54 bp, 58~61 bp, 163 bp, 532 bp, 1055 bp에 해당하는 단편이 생성됨을 알 수 있었고, Hae III을 사용한 경우에는 30 bp, 168 bp, 185~189 bp, 217 bp, 286 bp의 단편이, Msp I을 사용한 경우에는 49 bp, 99~100 bp, 123~125 bp, 423~429 bp, 432~436 bp의 단편이 주로 생성되었다. 그리고 혼합제한효소를 사용한 경우에는 30 bp, 37 bp, 49 bp, 56~63 bp, 286 bp에 해당하는 단편이 생성되는 것으로 나타났다.
- 따라서 A폐기물매립장 침출수 미생물군집의 경우, 제한효소로 Hha I을 사용할 때 가장 다양한 T-RF를 나타냄을 알 수 있었다. 결과적으로, 사용하는 제한효소에 따라 검출되는 T-RF의 개수와 우점 비율이 달라짐을 알 수 있었으며, T-RFLP해석에 사용하는 제한효소를 선택할 때에는 한 개 이상의 제한효소를 이용해서 T-RF의 개수와 우점비율 파악한 후 신중하게 선택하는 것이 바람직하다고 판단된다. 또한, 제한효소를 혼합하여 처리한 경우에는 T-RF의 패턴을 지나치게 단순화시키기 때문에 미생물군집해석에는 적합하지 않은 것으로 판단된다.
- 그러나 본 연구를 통하여 해양을 매립하여 만든 A 폐기물매립장 에는 육상의 폐기물 처리장 그리고 갯벌과는 달리, γ- 또는 δ-Proteobacteria 뿐만 아니라 해양성 ε-Proteobacteria 를 포함한 다양한 해양성 박테리아 종이 황화합물의 순환에 관여하며 공존하는 것으로 생각된다.
- 따라서 T-RFLP법을 사용하여 해석한 침출수내 미생물 군집구조와 일반적으로 널리 사용되고 있는 16S rDNA 클론 해석법에 의한 미생물 군집구조 사이에 유사성이 높다는 것을 알 수 있었다. 그러므로 침출수 미생물군집 구조 모니터링과 같은 반복적인 미생물군집해석이 필요한 경우에는 적절한 제한효소를 적용한 T-RFLP법을 사용함으로써 반복적인 16S rDNA 클론해석법의 수행에 따른 시간, 비용, 노동력의 소비를 줄일 수 있을 것으로 판단된다. 그러나 사용한 제한효소에 따라서 T-RFLP의 우점 T-RF가 16S rDNA 클론 분석에서는 우점 group으로 발견되지 않은 경우도 있었다(Fig.
- 한편, 혼합제한효소의 경우에는 매우 단순화된 T-RF경향을 나타냈으며, 우점하는 T-RF는 32 bp, 48 bp, 59~63 bp, 286 bp이었다. 따라서 A폐기물매립장 침출수 미생물군집의 경우, 제한효소로 Hha I을 사용할 때 가장 다양한 T-RF를 나타냄을 알 수 있었다. 결과적으로, 사용하는 제한효소에 따라 검출되는 T-RF의 개수와 우점 비율이 달라짐을 알 수 있었으며, T-RFLP해석에 사용하는 제한효소를 선택할 때에는 한 개 이상의 제한효소를 이용해서 T-RF의 개수와 우점비율 파악한 후 신중하게 선택하는 것이 바람직하다고 판단된다.
- 2에 나타낸 T-RFLP 분석결과에서 관찰되는 주된 단편의 길이와 거의 일치하였다. 따라서 T-RFLP법을 사용하여 해석한 침출수내 미생물 군집구조와 일반적으로 널리 사용되고 있는 16S rDNA 클론 해석법에 의한 미생물 군집구조 사이에 유사성이 높다는 것을 알 수 있었다. 그러므로 침출수 미생물군집 구조 모니터링과 같은 반복적인 미생물군집해석이 필요한 경우에는 적절한 제한효소를 적용한 T-RFLP법을 사용함으로써 반복적인 16S rDNA 클론해석법의 수행에 따른 시간, 비용, 노동력의 소비를 줄일 수 있을 것으로 판단된다.
- 따라서 T-RFLP법을 이용하여 폐기물매립장의 구조, 매립 폐기물 종류, 운영 기간에 따른 침출수 미생물군집의 구조의 차이를 구별할 수 있음을 확인하였다. Sawamura 등13)도 T-RFLP를 이용하여 매립장 깊이에 따른 매립폐기물 종류, 온도, 수분, 압력 등에 따라서 미생물 군집 구조가 다르다는 것을 확인하였다.
- 제한효소 가운데에서도 Hae III를 사용한 경우에 불법폐기물매립장 침출수의 미생물군집이 다른 곳의 미생물군집과 가장 큰 차이를 보였으며, Msp I를 사용한 경우에도 구분은 되었으나, 그 정도가 분명하지 못하였다. 따라서 사용하는 제한효소에 따라 미생물군집해석의 결과의 활용정도가 차이 나기 때문에 제한효소의 선정이 중요함을 알 수 있었으며, T-RFLP 분석을 통해서 매립장의 특성이 다른 폐기물매립장 침출수의 미생물 군집구조가 다르다는 것을 확인할 수 있었다.
- 제한효소 Msp I로 자른 T-RF 패턴을 바탕으로 각 매립장 침출수의 종 다양성 지수를 산출하고 비교하였다. 매립이 30% 이루어진 C 폐기물 매립장의 종 다양성(H: 4.47, D: 0.95)이 가장 높게 나타났으며, 매립이 60%이상 완료된 A나 B 폐기물 매립장의 종 다양성(H: 3.55-3.86, D: 0.88-0.91) 은 상대적으로 낮게 나타났다. 하지만, 불법폐기물 매립장인 D(H: 4.
- Hae III로 처리한 경우에는 절단되지 않았고, Msp I로 처리한 경우에는 436 bp, 혼합효소로 처리하였을 경우에는 63bp의 T-RF를 나타내었다. 이들 T-RF는 Fig. 2에서 나타낸 각 제한효소로 처리한 경우의 A 폐기물매립장 침출수 미생물군집의 T-RFLP에서 대표적인 T-RF로 모두 확인할 수 있었다.
- 해양을 매립해 조성한 A 폐기물매립장의 침출수 미생물군집의 T-RFLP 해석 결과를 검증하기 위하여 침출수 미생물군집의 16S rDNA clone library를 구축하고, 클론 해석을 수행하였다. 총 132개의 클론을 해석하여 98%의 상동성을 보인 클론을 같은 phylotype으로 분류함으로써총 63개의 phylotype그룹을 얻었다(Fig. 3). 해석한 클론의 53%는 ε-Proteobacteria에 속하였으며, 다음으로 9%가 γ-Proteobacteria, 6%가 δ-Proteobacteria로 ε-Proteobacteria에 속하는 박테리아가 가장 많이 존재하는 것으로 나타났다.
- 하지만 ε-Proteobacteria에 속하는 미생물은 전체 172개 클론 중에서 2개만이 검출되었다.
- 해석한 클론의 53%는 ε-Proteobacteria에 속하였으며, 다음으로 9%가 γ-Proteobacteria, 6%가 δ-Proteobacteria로 ε-Proteobacteria에 속하는 박테리아가 가장 많이 존재하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 라. 따라서 T-RFLP법을 사용하여 폐기물매립장의 미생물군집 구조를 장기적으로 모니터링 한다면 많은 비용과 시간을 소요하는 16S rDNA 클론해석법의 반복적인 수행 없이도 폐기물매립장의 안정화 정도를 평가할 수 있을 것으로 기대한다.
- Sawamura 등13)도 T-RFLP를 이용하여 매립장 깊이에 따른 매립폐기물 종류, 온도, 수분, 압력 등에 따라서 미생물 군집 구조가 다르다는 것을 확인하였다. 또한 그들은 폐기물 매립장내의 미생물군집은 샘플링 지점의 상태, 매립폐기물종류에 따라 차이를 보이므로 현실적인 방법으로 T-RFLP를 이용하여 매립장 침출수내 미생물 군집구조를 모니터링 하는 방법이 매립장의 안정화 정도를 보다 효율적으로 평가할 수 있을 것이라고 제안하였다.
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