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문제 정의
- 본 연구에서는 디젤에 오염된 토양 정화에 기여하는 토양 미생물 군집을 분리하여 농화 배양함으로서 미생물 군집들에 의한 디젤의 분해 양상과 더불어 디젤 분해과정에 기여하는 미생물들을 분석하고자 하였다. 이를 통하여 디젤 분해시 미생물의 군집 간 상호작용을 이해할 수 있을 뿐 아니라 미생물을 통한 디젤 오염된 토양의 효율적 복원을 위한 기초적 연구 자료를 제공할 수 있을 것으로 판단하였다.
- 본 연구에서는 디젤에 오염된 토양 정화에 기여하는 토양 미생물 군집을 분리하여 농화 배양함으로서 미생물 군집들에 의한 디젤의 분해 양상과 더불어 디젤 분해과정에 기여하는 미생물들을 분석하고자 하였다. 이를 통하여 디젤 분해시 미생물의 군집 간 상호작용을 이해할 수 있을 뿐 아니라 미생물을 통한 디젤 오염된 토양의 효율적 복원을 위한 기초적 연구 자료를 제공할 수 있을 것으로 판단하였다.
제안 방법
- 전기영동 후 UV transilluminator에서 DGGE 밴드 확인 후 원하는 band 부위를 잘라낸 후 30 ㎕의 1X TE Buffer 첨가하여 gel에서 DNA가 분리되도록 하였다.20) 분리된 DNA를 341f와 518r를 primer로 PCR을 재 실시하여 생성된 PCR product를 이용하여 sequence하였다.
- DGGE는 40%∼60%의 변성제 농도 구배(변성제 농도 100%는 7 M Urea, 40% Formaide)를 가지는 8% Polyacrylamide Gel을 이용하여(Bio-Rad Ltd. Co., Model 475 Gradient delivery system) 실시하였다.
- , Model 475 Gradient delivery system) 실시하였다. Polyacrylamide Gel을 1 X TAE buffer를 채운 DGGE 전기영동 기기(Bio-Rad D-code system, Hercules, CA, USA)에 부착시켜 GC clamp를 부착한 primer로 PCR을 실시하여 얻은 약 200 bp의 동일한 크기의 PCR product을 gel에 Loading 한후 200 V, 300 min(runing time)17)으로 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 UV transilluminator에서 DGGE 밴드 확인 후 원하는 band 부위를 잘라낸 후 30 ㎕의 1X TE Buffer 첨가하여 gel에서 DNA가 분리되도록 하였다.
- 각각의 미생물 배양액을 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제외한 침전물을 약 0.25 g이 되도록 한 후, Power Soil DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories, Inc.)를 사용하여 DNA 추출을 하였다. DNA 추출여부는 1.
- 균체량(volatile suspended solids)의 측정은 일정량의 배양액을 취하여 600 ηm에서 흡수된 광량을 기존에 건조중량으로 검량된 곡선에 대입하여 환산 측정하였다.
- 디젤분해 효율을 보기 위하여 MSM 액체배지에 디젤 1%(v/v)로 오염시킨 후 YE-5, WH-5로 명명된 두 군집을 각각 접종하였다. 미생물을 주입하지 않은 control을 포함하여 6 set의 배양액을 만들어 실험하였으며, control 배지는 실험과정동안 자연적으로 손실되는 디젤양을 관찰하기 위하여 접종된 배양액과 동일한 조건에서 실험을 수행하였다.
- 먼저 Bacteria의 16S rDNA 증폭을 위하여 EUB 10f와 EUB 1400r primer를 사용하여 1차 PCR을 수행하였으며, 이때 생성된 PCR product를 이용하여 V3 region을 증폭하고자 341f와 518r primer로 2차 PCR을 수행하였다. 또한 DGGE 수행을 위해 341f에 GC clamp를 부착하여 2차 PCR을 다시 수행하였다.
- 0 software의 neighborjoining method을 이용하였으며 균주들의 진화과정을 추적하는 작업은 Kimura 2-parameter Model을 이용하였다. 또한 신뢰성 확보를 위해 1000회의 bootstrap을 시행하였다.20~24)
- 16) 실험에 사용된 primer(Bionics, Korea)의 sequence은 Table 2와 같다. 먼저 Bacteria의 16S rDNA 증폭을 위하여 EUB 10f와 EUB 1400r primer를 사용하여 1차 PCR을 수행하였으며, 이때 생성된 PCR product를 이용하여 V3 region을 증폭하고자 341f와 518r primer로 2차 PCR을 수행하였다. 또한 DGGE 수행을 위해 341f에 GC clamp를 부착하여 2차 PCR을 다시 수행하였다.
- 미생물 군집의 형상 관찰을 위해 SEM(Scanning Electron Microscopy) 분석을 실시하였으며 Fig. 1은 SEM을 통해 배율 5,000배로 관찰한 YE-5와 WH-5 군집의 사진이다. 군집의 형상은 간균 형태로 관찰되었다.
- 디젤분해 효율을 보기 위하여 MSM 액체배지에 디젤 1%(v/v)로 오염시킨 후 YE-5, WH-5로 명명된 두 군집을 각각 접종하였다. 미생물을 주입하지 않은 control을 포함하여 6 set의 배양액을 만들어 실험하였으며, control 배지는 실험과정동안 자연적으로 손실되는 디젤양을 관찰하기 위하여 접종된 배양액과 동일한 조건에서 실험을 수행하였다. Fig.
- 염기서열 분석은 염기서열 분석 전문기관 (Bionics, Korea)에서 수행되었으며, 계통분류학적 확인을 위해 V3 region의 염기서열 결과는 NCBI BLAST Search Database 에서 검색된 염기서열 정보를 이용하였다. phylogenetic tree의 작성 작업은 Mega 4.
- YE-5군집에 비해 WH-5군집의 분해 속도는 현저히 느렸고, 12일째 YE-5 군집은 작은 노말 알칸류 부터 탄소수가 큰 노말 알칸류를 골고루 분해하며 성장 한 반면 WH-5 군집은 특히 C14~C18 의 분해가 더디게 진행되고 전체적인 분해가 미진하다가 배양 26일째가 지나가면서 YE-5군집에 의한 분해양상과 같이 낮은 탄소수에서 높은 탄소수에 걸쳐 전반적인으로 고르게 분해되는 경향을 나타내었다. 이는 군집에 따른 분해 양상과 효율의 차이가 있음을 나타내는 것으로 이를 살펴보기 위해 농화 배양된 YE-5 군집과 WH-5 군집에 존재하는 미생물 해석을 통하여 분해 특성과 군집과 상관관계를 알아보고자 PCR-DGGE 실험을 수행 하였다.
- Polyacrylamide Gel을 1 X TAE buffer를 채운 DGGE 전기영동 기기(Bio-Rad D-code system, Hercules, CA, USA)에 부착시켜 GC clamp를 부착한 primer로 PCR을 실시하여 얻은 약 200 bp의 동일한 크기의 PCR product을 gel에 Loading 한후 200 V, 300 min(runing time)17)으로 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 UV transilluminator에서 DGGE 밴드 확인 후 원하는 band 부위를 잘라낸 후 30 ㎕의 1X TE Buffer 첨가하여 gel에서 DNA가 분리되도록 하였다.20) 분리된 DNA를 341f와 518r를 primer로 PCR을 재 실시하여 생성된 PCR product를 이용하여 sequence하였다.
- 추출한 DNA template에서 16S rDNA의 가변 부위인 V3 region 증폭을 위해 서로 다른 2개의 primer sets을 사용하여 nested PCR을 실시하였다.16) 실험에 사용된 primer(Bionics, Korea)의 sequence은 Table 2와 같다.
이론/모형
- 14) 배양액에 존재하는 디젤의 농도는 환경부 토양공정 시험방법15) 중 Total Petroleum Hydrocarbon(TPH) 분석방법에 준하여 정량 하였으며 디젤의 분석을 위하여 GC-FID(Shmazu-17 A)를 이용하였다.
- Phylogenetic tree showing the relationship among the closest relatives in the GenBank databases and the aerobic culture. The tree was produced using a neigbor-joining method. The bar indicates 5% sequence divergence.
- 염기서열 분석은 염기서열 분석 전문기관 (Bionics, Korea)에서 수행되었으며, 계통분류학적 확인을 위해 V3 region의 염기서열 결과는 NCBI BLAST Search Database 에서 검색된 염기서열 정보를 이용하였다. phylogenetic tree의 작성 작업은 Mega 4.0 software의 neighborjoining method을 이용하였으며 균주들의 진화과정을 추적하는 작업은 Kimura 2-parameter Model을 이용하였다. 또한 신뢰성 확보를 위해 1000회의 bootstrap을 시행하였다.
성능/효과
- Pseudomonas aeruginosa 와 Uncultured Stenotrophomonas sp., Escherichia hermannii 모두 단백세균(Proteobacteria)에 속하는 세균으로 분석 되었다.
- 1) 간균 형태로 관찰된 황색을 띈 선이 매끄럽고 볼록한 형태의 colony가 나타난 YE-5와 colony의 크기가 상대적으로 작으며 투명한 WH-5, 두 토양미생물 군집을 농화배양 한 후 디젤이 함유된 배지에서의 디젤의 분해율을 살펴보았을 때 배양 12일 째 YE-5 군집은 1% (v/v) 초기농도 대비 86.4% 그리고 WH-5 군집은 66.8%의 제거율을 나타내었다. 두 군집의 디젤 분해효율 비교에 있어서 YE-5 군집의 디젤을 분해효과가 더 높은 것으로 나타났으며 이는 디젤오염 토양 복원에 미생물의 적용은 적절한 군집을 사용하여야 함을 나타낸다.
- 2) YE-5 군집의 디젤 분해율은 99.07 mg-Diesel/L․day의 속도로 측정 되었으며, 이는 WH-5 군집의 디젤 분해율이 57.82 mg-Diesel/L․day인 것에 비해 약 1.7배 정도의 빠른 분해속도를 가지는 것을 알 수 있었다. YE-5에서 디젤 당 미생물 생체량의 성장량은 약 0.
- 3) 디젤을 구성하는 탄화수소에 있어서 탄소수가 작은 n-alkane(C10~C15)이 탄소수가 큰 n-alkane(C16~ C20)보다 휘발성도 크고 미생물 분해가 쉽게 이루어지며 탄소수가 큰 (분자량이 큰) 탄화수소는 낮은 휘발성과 상대적으로 미생물 분해가 더디게 진행되나 본 실험에서는 YE-5 과 WH-5 군집에 의해 탄소수에 상관없이 전반에 걸쳐 분해되었으며 분해속도에 있어서 두 군집의 차이는 확연하였다. 따라서 디젤의 전반적인 분해는 YE-5나 WH-5에 존재하는 혼합미생물의 상호작용으로 전반적 분해가 이루어진 것으로 판단되었으며 미생물 군집의 조성과 디젤의 분해효율의 상관관계가 있음을 확인하였다.
- Power Soil DNA Isolation Kit(MO BIO Labortories, Inc.)를 이용하여 반복된 YE-5, WH-5 군집의 DNA를 추출하여 1.2% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 DGGE를 실행한 결과 YE-5 군집에서는 5가지 균을 나타내는 band가 확인 되었으며 WH-5 군집에서는 4가지 균을 나타내는 band가 확인 되었다. Fig.
- 이러한 양상은 기존 연구에서는25) 단일 균주를 사용하여 디젤의 분해가 특정한 탄소수의 범위에 국한되어 나타나는 양상을 띄었다면 본 연구에서는 복합 균주를 이용하여 분해하였기 때문에 저분자의 탄화수소 뿐만 아니라 고분자의 탄화수소까지 분해 할 수 있는 미생물 군집이 배양액에 존재하고 있음을 유추할 수 있었다. WH-5의 군집의 디젤 분해 양상은 최종적으로는 YE-5과 같은 양상을 나타냈으나 분해율이 약 20%정도 차이 났던 12일째 시점에서는 그 분해양상이 다소 다르게 나타났다. YE-5군집에 비해 WH-5군집의 분해 속도는 현저히 느렸고, 12일째 YE-5 군집은 작은 노말 알칸류 부터 탄소수가 큰 노말 알칸류를 골고루 분해하며 성장 한 반면 WH-5 군집은 특히 C14~C18 의 분해가 더디게 진행되고 전체적인 분해가 미진하다가 배양 26일째가 지나가면서 YE-5군집에 의한 분해양상과 같이 낮은 탄소수에서 높은 탄소수에 걸쳐 전반적인으로 고르게 분해되는 경향을 나타내었다.
- WH-5의 군집의 디젤 분해 양상은 최종적으로는 YE-5과 같은 양상을 나타냈으나 분해율이 약 20%정도 차이 났던 12일째 시점에서는 그 분해양상이 다소 다르게 나타났다. YE-5군집에 비해 WH-5군집의 분해 속도는 현저히 느렸고, 12일째 YE-5 군집은 작은 노말 알칸류 부터 탄소수가 큰 노말 알칸류를 골고루 분해하며 성장 한 반면 WH-5 군집은 특히 C14~C18 의 분해가 더디게 진행되고 전체적인 분해가 미진하다가 배양 26일째가 지나가면서 YE-5군집에 의한 분해양상과 같이 낮은 탄소수에서 높은 탄소수에 걸쳐 전반적인으로 고르게 분해되는 경향을 나타내었다. 이는 군집에 따른 분해 양상과 효율의 차이가 있음을 나타내는 것으로 이를 살펴보기 위해 농화 배양된 YE-5 군집과 WH-5 군집에 존재하는 미생물 해석을 통하여 분해 특성과 군집과 상관관계를 알아보고자 PCR-DGGE 실험을 수행 하였다.
- 8%의 제거율을 나타내었다. 두 군집의 디젤 분해효율 비교에 있어서 YE-5 군집의 디젤을 분해효과가 더 높은 것으로 나타났으며 이는 디젤오염 토양 복원에 미생물의 적용은 적절한 군집을 사용하여야 함을 나타낸다.
- 디젤 분해와 더불어 YE-5 군집의 생체량의 성장 양상을 살펴보면 디젤유 농도가 급격하게 떨어지기 시작할 때 약 94.62 mg-Biomass/L․day의 속도로 급격히 성장 하였으며, 이때 디젤은 YE-5 군집에 의해 99.07 mg-Diesel/L․day의 속도로 소비되었다. WH-5 군집에 의한 디젤의 소비가 57.
- )보다 휘발성도 크고 미생물 분해가 쉽게 이루어지며 탄소수가 큰 (분자량이 큰) 탄화수소는 낮은 휘발성과 상대적으로 미생물 분해가 더디게 진행되나 본 실험에서는 YE-5 과 WH-5 군집에 의해 탄소수에 상관없이 전반에 걸쳐 분해되었으며 분해속도에 있어서 두 군집의 차이는 확연하였다. 따라서 디젤의 전반적인 분해는 YE-5나 WH-5에 존재하는 혼합미생물의 상호작용으로 전반적 분해가 이루어진 것으로 판단되었으며 미생물 군집의 조성과 디젤의 분해효율의 상관관계가 있음을 확인하였다.
- 6%의 분해율 보다 높은 수치이며 초기농도는 10,290~35,000 mg/L 으로 하고 혼합균주를 사용한 논문에서27~30) 제시한 52~80% 분해율과 유사한 수치이다. 미생물이 접종되지 않은 control 배지의 경우 약 29.6%의 디젤유가 감소하였는데 이는 실험과정동안 디젤의 자체적 휘발성에 의해서도 상당량의 디젤이 감소됨을 알 수 있었다.
- 5b 역시 3번 band의 미생물이 우점종임을 알 수 있었는데 다양하게 분포되어 가시화된 DGGE band의 미생물 군집을 파악하기 위해 각각의 band의 sequence를 NCBI BLAST을 이용하여 GenBank database와 비교 분석하고 가장 유사도가 높은 종을 검색하여 Table 3에 나타내었다. 반복된 DGGE 실험에서 선명하게 나타난 YE-5와 WH-5 군집의 3번 band는 Pseudomonas aeruginosa 로 규명되었다. Pseudomonas aeruginosa는 이전 연구에서 유류 분해에 탁월한 효과를 보였다고 보고된 바 있는 균이다.
- 2은 YE-5, WH-5 군집의 디젤분해 효율과 미생물의 성장량을 나타낸 그래프이다. 초기 10,000 mg/L의 디젤은 약 10일 지나면서 대부분 분해가 완료되었으며 두 군집에서 디젤 분해는 12일째가 지나면서 YE-5가 86.4%, WH-5가 66.8% 로 YE-5의 군집 배양액에서 디젤 분해율이 높게 나타났으며 이는 초기농도 8,300~13,060 mg/L 으로 하여 Rhodococcus ruber등과 같은 단일 순수균주를 사용한 논문에서6,25~27) 제시한 21.1~64.6%의 분해율 보다 높은 수치이며 초기농도는 10,290~35,000 mg/L 으로 하고 혼합균주를 사용한 논문에서27~30) 제시한 52~80% 분해율과 유사한 수치이다. 미생물이 접종되지 않은 control 배지의 경우 약 29.
- 환경부 및 관계부처에서는 법적 개선과 더불어 오염토양을 복원하기위한 토양 및 지하수오염 정화기술에 대한 연구개발을 집중 육성 하고 있으며, 최근에 이르러 오염토양 정화기술에 대한 현장 적용성을 갖춘 다양한 기술이 개발되고 있고 실 현장에 적용되고 있다. 현재 국내 정화시장의 기술 적용 현황을 살펴보면 총 434개 오염토양 정화현장 내에서 적용된 796개 정화기술 중 지중처리기술이 83.3%로 지상처리기술 16.7% 보다 현저하게 많이 적용된 것으로 조사되었다.2) 이는 국내 토양정화 공사가 대부분 주유소 등을 대상으로 수행되었고 이러한 사업장은 사업장을 유지하면서 복원사업을 수행하는 지중처리 기술을 주로 사용하였기 때문으로 판단 된다.
후속연구
- 이를 통하여 효과적인 디젤 분해를 위해 적절한 미생물 군집의 조합이 필요하다는 것을 알 수 있었으며 개별적 미생물의 디젤 분해에 미치는 영향을 해석하기 위해서는 미 보고된 Escherichia hermannii나 Senotrophomonas sp. 가 디젤의 분해 미치는 영향에 관한 세밀한 후속 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
- 34) 따라서 기존에 디젤 분해 미생물로 알려져 있지 않은 Escherichia hermannii나 Uncultured Stenotrophomonas sp.종에 의한 디젤의 분해에 관해 보다 세밀한 후속 연구가 필요할 것으로 판단되어진다.
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