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문제 정의
- marinus와 마찬가지로 고수온과 고염분의 환경에서 유주자 형성이 보다 조기에 나타남을 보고한 바 있으며, 특히 겨울철과 여름철에 각각 형성된 휴면포자의 유주자 형성과 방출은 수온에 대한 의존성이 상이하게 나타남을 보고하였다. 따라서 본 연구는 우리나라 서해안에 분포하는 퍼킨서스편모충의 생활사 중 감염에 중요한 역할을 하는 휴면포자와 유주자 형성에 미치는 수온과 염분의 영향을 조사함으로써 이 기생충의 생태학적 특성을 조사하고 이를 바탕으로 구제 대책을 수립하는데 기초 자료로 활용하기 위하여 실시되었다.
- olseni는 우리나라 바지락의 대부분이 감염되어 있으며 극심한 염증을 유발하는 우리나라 바지락의 대표적 기생충이다. 본 연구에서는 퍼킨서스편모충의 생태학적 특성을 조사하고자 영양체에서 휴면포자로 전환되는 과정과 유주자를 형성하는 과정에서 수온과 염분이 미치는 영향을 조사하였다. 조사결과 영양체에서 휴면포자로의 유도는 수온이 높을수록 유도율이 높고 휴면포자의 직경이 커지는 현상이 관찰되었다.
제안 방법
- 한편, 염분이 유주자 형성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 5, 10, 20, 30 ppt로 조절된 멸균여과 해수를 Petri dish에 각각 10 ml씩 넣고 순수 분리한 휴면포자 100 µl를 첨가 한 후 20℃의 암실에서 배양하였다. 그 후 무작위로 약 100 여개의 휴면포자를 선택하여 각 세포의 세포발달 단계 (휴면포자, 핵 비대, 2 세포기, 4 세포기, 8 세포기, 16 세포기, 32 세포기, 64 세포기 이상, 유주자 방출 중, 방출 종료) 를 결정하였다. 이 때 수온에 따른 유주자 형성과정 측정은 배양 후 3일간은 3시간 간격, 4일째부터는 12시간 간격으로 9일간 측정하였으며, 염분에 따른 유주자 형성은 배양 개시 후 4일간은 3시간 간격, 5일째부터는 6시간 간격으로 15일간 측정하였다.
- 수온이 유주자 형성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 3.과 같은 방법으로 휴면포자를 순수분리 한 후, Petri dish에 30 ppt로 조절된 멸균여과 해수 10 ml에 휴면포자 100 µl를 넣고 4, 10, 20, 30℃의 암실에서 배양하였다.
- RFTM에서 꺼낸 아가미 조직은 면도칼을 이용하여 잘게 분쇄한 후 100 µm와 50 µm의 망목을 통과시켜 바지락 아가미 조직으로부터 휴면포자를 순수 분리하였다. 순수분리된 휴면포자는 Petri dish에 30 ppt 로 조절된 여과멸균 해수 10 ml와 섞은 후 20℃의 암실에서 배양 하면서 이들 중 1개의 휴면포자만을 선택하여 세포분열부터 유주자 방출 종료 시 까지 1시간 간격으로 위상차 현미경 (Olympus) 을 이용하여 유주자 형성 과정에서 나타나는 각 세포분열 단계의 소요 시간을 측정하였다.
- 그 후 무작위로 약 100 여개의 휴면포자를 선택하여 각 세포의 세포발달 단계 (휴면포자, 핵 비대, 2 세포기, 4 세포기, 8 세포기, 16 세포기, 32 세포기, 64 세포기 이상, 유주자 방출 중, 방출 종료) 를 결정하였다. 이 때 수온에 따른 유주자 형성과정 측정은 배양 후 3일간은 3시간 간격, 4일째부터는 12시간 간격으로 9일간 측정하였으며, 염분에 따른 유주자 형성은 배양 개시 후 4일간은 3시간 간격, 5일째부터는 6시간 간격으로 15일간 측정하였다.
- 한편, 염분이 유주자 형성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 5, 10, 20, 30 ppt로 조절된 멸균여과 해수를 Petri dish에 각각 10 ml씩 넣고 순수 분리한 휴면포자 100 µl를 첨가 한 후 20℃의 암실에서 배양하였다.
- 휴면포자의 유도는 15 ml conical tube에 Wilson-Ormond et al. (1993) 의 방법에 따라 제조된 Ray's Fluid Thioglycollate Medium (RFTM) 10 ml, Chloramphenicol solution과 Nystatin solution 20 µl, 바지락 아가미 1 g을 넣고 각각 4, 10, 20, 30℃의 암실에서 배양 하면서 배양 후 1, 2, 4, 7, 14일 째 휴면포자의 발생과 성장을 관찰하였다.
- 휴면포자의 확인은 RFTM에서 배양된 시료를 Lugol's Iodine으로 염색한 후 2M NaOH로 녹여 광학현미경을 통해 관찰하는 방법을 사용하였다.
대상 데이터
- 0) 을 이용하여 측정하였다. 매 관찰 시 휴면포자 100개를 무작위로 선택하여 측정하였다.
- 본 연구에 사용된 P. olseni의 숙주인 바지락은 충청남도 태안군 남면 신온리에서 2010년 4월에 채집하여 Ice box에 냉장보관 하여 실험실로 옮겨 분석하였다.
성능/효과
- 4). 따라서 퍼킨서스편모충의 유주자 형성은 염분의 변화에 영향을 받으며 높은 염분에서 보다 활발한 세포분열과 높은 비율의 유주자 방출이 이루어지는 것으로 조사되었다. 이와 같은 결과는 Ahn and Kim (2001) 이 보고한 결과와 매우 유사한 것으로써 당시 염분 5ppt와 10ppt에서 배양된 하계 시료의 경우 15일간의 배양 실험에서 유주자가 일부 형성이 되었지만 방출이 전혀 이루어지 않은 것으로 조사되었다.
- 64 세포기 부터 유주자 방출을시작하기 까지는 약 24시간이 소요되었으며, 방출을 시작하여 종료 시 까지는 약 1시간이 소요되었다. 따라서 해수에 유리된 휴면포자가 25 ℃의 수온에서 유주자를 완전히 방출하는데 까지 약 3-4일 정도 소요되는 것으로 관측되었다.
- 3). 또한 10 ppt에서는 배양 10일경 최초의 유주자 방출 완료 개체가 나타났으며, 실험 종료시에는 방출 종료개체가 3-5개체로 전체 휴면포자 중 3-4%를 차지하였다. 그러나 5 ppt에서 배양된 휴면포자인 경우 방출 완료 개체는 전혀 관찰 되지 않았다 (Fig.
- 조사결과 영양체에서 휴면포자로의 유도는 수온이 높을수록 유도율이 높고 휴면포자의 직경이 커지는 현상이 관찰되었다. 또한 유주자 형성은 고수온, 고염분의 환경에서 잘 형성됨으로써 10℃이하에서는 유주자 발생이 이루어지 않으며, 10 ppt에서는 유주자 형성이 급격히 감소하고 5 ppt에서는 유주자 발생이 이루어지지 않음이 확인되었다. 이러한 퍼킨서스편모충의 생태학적 정보는 이 질병의 구제 대책 수립에 중요한 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
- 배양 1일째에 핵비대 현상이 관찰 되었으며, 약 2일 경과 후부터 세포분열 중인 개체들이 관찰되었고 4일째부터 유주자 방출이 시작되었다. 배양 7일째부터 90% 이상의 휴면포자에서 유주자 형성을 위한 세포분열이 확인되었다. 유주자 방출을 종료한 휴면포자들도 배양 4일째부터 관찰되기 시작하여 5일째에는 약 50%의 휴면포자가 방출을 종료하였고 이 비율은 점차 증가하여 실험이 종료된 배양 15일째에는 80-90%의 휴면포자가 유주자의 방출을 종료하였다 (Fig.
- 반면, 10℃와 4℃에서는 실험 종료 시까지 세포 분열이 관찰되지 않았다. 본 연구 결과 수온 20℃에서 배양된 P. olseni 유주자 방출은 30℃ 보다 늦게 시작 되었으며, 실험종료시 유주자 방출 역시 30℃에서 조기에 완료되었다. Ahn and Kim (2001) 에 의하면 20℃보다는 30℃에서 더 높은 유주자 방출 현상을 보고한 바 있어 본 연구와 동일한 결과를 나타내었다.
- 2, 3, 4). 수온이 미치는 영향에 대한 실험에서는 30℃에서 해수에 배양한지 2일 후에 핵비대와 세포분열을 시작한 개체들이 관찰 되었으며 3일째에 50%이상의 세포가 분열을 하였고, 배양 8일째에는 약 70%이상의 세포에서 유주자가 방출되었다. 20℃에서는 2일째에 핵비대 현상이 관찰되었으나 배양 4일째에서야 세포분열이 시작 되었고, 5일째에 50% 이상의 세포가 분열 하였으며, 8일째에 90%이상의 세포에서 유주자가 방출 되었다.
- 실험 결과 퍼킨서스편모충 휴면포자의 형성은 수온의 영향을 크게 받는 것으로 나타나 수온이 높을수록 영양체에서 휴면포자로의 전환이 빨리 일어났고, 유도된 휴면포자의 직경 역시 큰 것으로 조사되었다 (Fig. 1). 30℃에서 배양된 영양체의 경우 배양 1일 후 휴면포자로 유도 되었으며, 이 때 평균 직경은 42.
- 배양 7일째부터 90% 이상의 휴면포자에서 유주자 형성을 위한 세포분열이 확인되었다. 유주자 방출을 종료한 휴면포자들도 배양 4일째부터 관찰되기 시작하여 5일째에는 약 50%의 휴면포자가 방출을 종료하였고 이 비율은 점차 증가하여 실험이 종료된 배양 15일째에는 80-90%의 휴면포자가 유주자의 방출을 종료하였다 (Fig. 4). 그러나 10 ppt에서는 7일째부터 세포분열이 관찰 되었으며 12일째에 유주자 형성이 관찰되었고, 5 ppt에서는 14일째부터 세포분열과 유주자 형성이 관찰되었다.
- 유주자 형성 시 수온과 염분의 영향을 조사한 결과 P.olseni의 유주자 형성에 수온과 염분이 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다 (Fig. 2, 3, 4). 수온이 미치는 영향에 대한 실험에서는 30℃에서 해수에 배양한지 2일 후에 핵비대와 세포분열을 시작한 개체들이 관찰 되었으며 3일째에 50%이상의 세포가 분열을 하였고, 배양 8일째에는 약 70%이상의 세포에서 유주자가 방출되었다.
- 이상의 결과를 살펴보면 Perkinsus spp.의 유주자 형성은 수온과 염분이 중요하게 작용하는 것으로 밝혀졌으나 유주자 형성이 불활화 되는 수온과 염분 조건은 Perkinsus 종마다 다소 상이한 결과를 보였으며, 같은 P.olseni라 할지라도 유럽에서 검출된 종과 아시아에서 검출된 종은 유주자 형성 조건이 일부 다를 수 있음이 제시되었다. 특히 Ahn and Kim (2001) 이 보고한 바와 같이 계절에 따라 같은 환경 조건에도 다르게 반응함이 관찰됨으로써 Perkinsus spp.
- , 2004). 이상의 결과를 살펴보면 Perkinsus spp.의 유주자 형성은 수온과 염분이 중요하게 작용하는 것으로 밝혀졌으나 유주자 형성이 불활화 되는 수온과 염분 조건은 Perkinsus 종마다 다소 상이한 결과를 보였으며, 같은 P.
- 본 연구에서는 퍼킨서스편모충의 생태학적 특성을 조사하고자 영양체에서 휴면포자로 전환되는 과정과 유주자를 형성하는 과정에서 수온과 염분이 미치는 영향을 조사하였다. 조사결과 영양체에서 휴면포자로의 유도는 수온이 높을수록 유도율이 높고 휴면포자의 직경이 커지는 현상이 관찰되었다. 또한 유주자 형성은 고수온, 고염분의 환경에서 잘 형성됨으로써 10℃이하에서는 유주자 발생이 이루어지 않으며, 10 ppt에서는 유주자 형성이 급격히 감소하고 5 ppt에서는 유주자 발생이 이루어지지 않음이 확인되었다.
후속연구
- , 2004). 따라서 국내에서 검출되는 P. olseni의 생태학적 특징에 대한 명확한 이해는 이 기생충의 전파를 저감시키거나 또는 예측하며, 나아가 구제 대책을 수립하는데 중요한 요인이므로 이에 대한 보다 심도 있는 연구가 요망된다.
- 또한 유주자 형성은 고수온, 고염분의 환경에서 잘 형성됨으로써 10℃이하에서는 유주자 발생이 이루어지 않으며, 10 ppt에서는 유주자 형성이 급격히 감소하고 5 ppt에서는 유주자 발생이 이루어지지 않음이 확인되었다. 이러한 퍼킨서스편모충의 생태학적 정보는 이 질병의 구제 대책 수립에 중요한 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
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