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문제 정의
- 이 연구에서는 P. olseni 감염이 바지락 번식에 미치는 영향을 비교하기 위하여 암컷 개체만을 선별한 뒤, 조직학적 방법을 통하여 각 개체들의 성 성숙 단계를 판별하였으며, 체조직내의 생화학적 성분 및 번식량을 측정하였다. 조직학적 분석 결과, 완숙기 바지락 생식소 지수는 감염도가 최고로 높았던 완도바지락은 곰소 바지락에 비하여 생식소지수, 여포 크기 및 여포 내 성숙난의 개체수 모두, 곰소 지역보다 두 배 정도 낮은 값을 보였다(Fig.
- 이 연구에서는 P. olseni 감염이 숙주의 생리에 미치는 영향을 이해하기 위하여 바지락 성 성숙이 활발히 일어나는 5월 말경 경기만, 곰소만 및 완도에서 암컷 바지락 개체군을 동시에 채집하여 이들의 생리학적 특성을 분석하였다. 이를 위하여 조직학적 방법과 효소면역측정법을 이용하여 1) 공간적 분포에 따른 바지락의 생식소 발달 단계, 여포 크기 및 여포 내 생성되는 난(egg)의 수, 2) 공간적 분포에 따른 바지락의 번식량(reproductive effort) 및 체조성 성분, 3) 바지락 개체군의 P.
- 이 연구에서는 바지락의 성 성숙이 활발한 봄철에 경기만 선재도, 전북 곰소만, 및 남해 완도 등, 연중 수온 분포가 다른 지역에 분포하는 바지락 채집하여 P. olseni 감염이 번식에 미치는 영향을 조사하였다. 바지락의 산란은 연중 수온이 곰소나 선재도보다 높은 완도 바지락이 서해안 곰소 및 선재도 바지락보다 빠른 성 성숙 및 산란 활동을 보였다.
제안 방법
- olseni 감염이 숙주의 생리에 미치는 영향을 이해하기 위하여 바지락 성 성숙이 활발히 일어나는 5월 말경 경기만, 곰소만 및 완도에서 암컷 바지락 개체군을 동시에 채집하여 이들의 생리학적 특성을 분석하였다. 이를 위하여 조직학적 방법과 효소면역측정법을 이용하여 1) 공간적 분포에 따른 바지락의 생식소 발달 단계, 여포 크기 및 여포 내 생성되는 난(egg)의 수, 2) 공간적 분포에 따른 바지락의 번식량(reproductive effort) 및 체조성 성분, 3) 바지락 개체군의 P. olseni 감염률(prevalence) 및 감염도(infection intensity)를 분석하여 이들의 상관 관계를 비교하였다.
- P. olseni 감염 진단에 이용된 같은 바지락의 몸통 중앙부로부터 2 mm 두께의 조직 단편을 절취한 뒤, Davidson’s 고정액에 48시간 고정시키고 에탄올을 이용하여 탈수한 후 파라핀(paraffin)으로 포매하였다.
- PBST로 세척 후, 1차 항체로 Park and Choi (2004)가 개발한 rabbit anti-clam egg IgG(5 μg/mL)를 각각의 well에 100 µL씩 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
- 각 바지락 체조직 내 총 단백질 함량은 BCA Protein Assay Kit(Pierce, USA)을 이용하여 분석한 후 560 nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 이 때, Bovine Serum Albumin(BSA)을 표준물질로 이용하였다. 총 탄수화물 함량은 Phenol & Sulfuric acid 방법(Dubois et al.
- 암컷 바지락만을 선별하기 위하여 22G'' 1/2의 주사바늘로 바지락 생식소에서 소량의 생식세포를 채취, 유리 슬라이드에 도말한 뒤 현미경 하에서 난(egg)과 정자(sperm)를 구분하였다. 각 지역별로 50개체의 암컷 바지락을 선별한 뒤, 이들의 체조직 습중량(tissue wet weight, TWWT)를 측정하였다. 패각은 실온에서 건조하여 비만도 [condition index, CI = 조직 건중량(g)/건조 패각무게(g)] 산정에 이용하였다.
- 세 지역에서 채집된 바지락은 그 크기가 지역에 따라 다소 차이가 있어 각 집단간의 생리적 측정요인(총 단백질, 총 탄수화물, 총 지방 및 GSI)의 비교 시, 연령 또는 크기가 영향을 미칠 것으로 예측되었다. 따라서 이러한 변수를 배제하기 위하여, 실험에 사용된 모든 바지락의 평균 각장인 41.3 mm를 이용하여 바지락 조직 건중량에 대한 절대값으로 표준화(standard animal)하였다. 즉, 각장에 대한 조직 건중량을 Log10으로 치환한 후, 선형회귀 곡선(linear regression curve)을 이용하여 상대 성장식을 구하였다(Beninger and Lucas 1984; Kang et al.
- 수집된 휴면포자는 혈구계수판(hemocytometer)를 이용하여 4회 반복하여 계수하였다. 바지락 아가미에 포함되어 있는 P. olseni의 개체수는 Park et al. (1999)가 보고한 상관 관계식 Y = 2.0417X + 186,572(Y = 바지락 개체당 P. olseni 세포 수, X = 바지락 아가미 조직에서 계수된 P. olseni 세포 수)을 이용하여 바지락 체중량 1 gram 당 P. olseni 세포 수로 환산하였다. P.
- 바지락에 존재하는 난 단백질의 함량은 순수 분리된 바지락 난 단백질의 농도별 흡광도 값을 이용한 표준곡선(standard curve)을 통하여 계산하였다. 개체별 바지락 난의 함량은 총 바지락 난 건조 무게에 대한 난 단백질의 건조 무게의 비인 2.
- 상등액은 PBS에 1/200배가 되도록 희석시킨 후 polystylene 96-well microplate에 100 µL씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 항원 coating을 실시하고, 대조구로 바지락 수컷의 체세포 단백질을 사용하였다.
- 생식소 발달 단계 관찰 시, 생식소 내 혈구 침윤 현상이 관찰되었다. 세 지역 바지락 집단간의 생식소 발달에 따른 혈구 침윤 현상의 미치는 영향을 확인하기 위해, 혈구 침윤의 발생 비율과 조직학적 특징을 관찰하였다.
- olseni의 휴면포자(hypnospore)를 수집하였다. 수집된 휴면포자는 혈구계수판(hemocytometer)를 이용하여 4회 반복하여 계수하였다. 바지락 아가미에 포함되어 있는 P.
- 암컷 바지락만을 선별하기 위하여 22G'' 1/2의 주사바늘로 바지락 생식소에서 소량의 생식세포를 채취, 유리 슬라이드에 도말한 뒤 현미경 하에서 난(egg)과 정자(sperm)를 구분하였다.
- 조직학적 관찰에서 완숙기(ripe)로 확인된 바지락을 선별(선재도 N = 24, 곰소 N = 31, 완도 N = 7), 난소 내 여포(follicle)의 크기와 여포내에 생성되는 난(egg)의 수를 각 개체의 조직학적 시료로부터 측정하였다. 여포의 크기는 화상분석 소프트웨어(Image Pro-Plus Version 2.0, Media Cybernetics, USA)를 이용하여 개체별로 4-5개의 여포를 무작위로 선택, 여포의 면적(mm2)을 측정하고, 각각의 여포에서 생성되는 난(egg)의 총수를 계수하였다.
- 위와 같은 방법으로 바지락의 조직 건중량에 대한 체조 성분과 번식량을 standard animal화 하여 지역간 바지락의 체조성분과 번식량을 비교하였다.
- 조직학적 관찰에서 완숙기(ripe)로 확인된 바지락을 선별(선재도 N = 24, 곰소 N = 31, 완도 N = 7), 난소 내 여포(follicle)의 크기와 여포내에 생성되는 난(egg)의 수를 각 개체의 조직학적 시료로부터 측정하였다. 여포의 크기는 화상분석 소프트웨어(Image Pro-Plus Version 2.
- 3 mm를 이용하여 바지락 조직 건중량에 대한 절대값으로 표준화(standard animal)하였다. 즉, 각장에 대한 조직 건중량을 Log10으로 치환한 후, 선형회귀 곡선(linear regression curve)을 이용하여 상대 성장식을 구하였다(Beninger and Lucas 1984; Kang et al. 2007; Baek et al. 2014).
- 1). 채집한 바지락들은 채집 다음날 실험실로 옮겨, 각장(shell length, SL)을 측정하고 육질부와 패각을 분리하였다. 암컷 바지락만을 선별하기 위하여 22G'' 1/2의 주사바늘로 바지락 생식소에서 소량의 생식세포를 채취, 유리 슬라이드에 도말한 뒤 현미경 하에서 난(egg)과 정자(sperm)를 구분하였다.
- 각 지역별로 50개체의 암컷 바지락을 선별한 뒤, 이들의 체조직 습중량(tissue wet weight, TWWT)를 측정하였다. 패각은 실온에서 건조하여 비만도 [condition index, CI = 조직 건중량(g)/건조 패각무게(g)] 산정에 이용하였다. 이 연구에 사용된 지역별 암컷 바지락의 각장과 체조직 습중량은 Table 1과 같다.
- 포매된 조직 시료는 마이크로톰을 이용하여 6 µm 두께로 박절한 후, Harris’ Haematoxylin과 Eosin Y로 비교 염색하였다.
대상 데이터
- 일주일 후, 배양이 완료된 아가미 조직은 원심 분리하여 배양액을 제거하고 5 mL의 2 M NaOH 용액을 튜브에 가한 뒤, 60℃ 항온수조에서 1시간동안 항온처리하여 바지락 조직을 제거하였다. 시료는 다시 원심분리하여 아가미 조직 내 포함되어 있던 P. olseni의 휴면포자(hypnospore)를 수집하였다. 수집된 휴면포자는 혈구계수판(hemocytometer)를 이용하여 4회 반복하여 계수하였다.
- 실험에 사용된 바지락은 2004년 5월 30일 인천 선재도(37°13′49″N, 126°31′56″E), 전라북도 곰소(35°34′15″N, 126°35′23″E) 및 전라남도 완도(34°18′58″N, 126°45′02″E)의 조간대에서 채집되었다(Fig. 1).
- 이 연구에 사용된 지역별 암컷 바지락의 각장과 체조직 습중량은 Table 1과 같다. 조사 지역의 연중 수온 변화는 한국해양자료센터(Korean Oceanographic Data Center, KODC)로부터 얻었으며, 각 조사 정점의 연중 수온 변화는 Fig. 2와 같다.
데이터처리
- 분석 결과의 유의성 검정은 95% 신뢰수준에서 Duncan’s multiple range test를 실시하였다(SAS statistical package, USA).
- 채집 지역간의 바지락 비만도, 번식량(GSI)과 P. olseni 감염도는 one-way ANOVA test를 실시하여 비교하였다. 특히, 생식소 발달 단계별 GSI와 여포 크기는 비교 그룹 간 개체 수가 상이하여, 데이터를 ranking 후에 one-way ANOVA test를 수행하였다.
- olseni 감염도는 one-way ANOVA test를 실시하여 비교하였다. 특히, 생식소 발달 단계별 GSI와 여포 크기는 비교 그룹 간 개체 수가 상이하여, 데이터를 ranking 후에 one-way ANOVA test를 수행하였다. 분석 결과의 유의성 검정은 95% 신뢰수준에서 Duncan’s multiple range test를 실시하였다(SAS statistical package, USA).
이론/모형
- 바지락 암컷의 번식량(egg mass)는 바지락 난 단백질에 특이적으로 개발된 항체를 이용한 indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)로 측정하였다(Park and Choi, 2004). 약 25 mg의 동결 건조된 바지락 조직에 5 mL의 인산완충용액(0.
- 포매된 조직 시료는 마이크로톰을 이용하여 6 µm 두께로 박절한 후, Harris’ Haematoxylin과 Eosin Y로 비교 염색하였다. 바지락의 생식소 발달단계는 Park and Choi (2004)의 방법에 따라 광학현미경 하에서 미분화기(indifferent stage), 초기 발달기(early development stage), 후기 발달기(late development stage), 완숙기(ripe stage), 산란기(spawning stage)와 산란 후기(spent stage)의 총 6단계로 구분하였다.
- 지역별 바지락의 P. olseni 감염률과 감염도는 Park and Choi (2001)의 방법에 따라 분석하였다. 이를 위하여 각 바지락의 아가미 조직 일부를 취한 뒤, 이를 항생제 mycostatin(200 units/mL)과 chloromycetin(2 mg/mL)이 포함되어 있는 FTM 배양액 5 mL 튜브에 포함시킨 뒤, 실온의 암실에서 1주일간 배양하였다.
- 1956)에 따라 분석하였으며, Dextrose anhydrous(Yakuri Pure Chemical, Japan)를 표준물질로 이용, 480 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 지질 함량 분석은 Bligh and Dyer(1959)의 방법에 따라 chloroform과 methanol로 체세포에 포함된 지방을 추출한 후 지방의 중량을 측정하였다.
- 총 탄수화물 함량은 Phenol & Sulfuric acid 방법(Dubois et al. 1956)에 따라 분석하였으며, Dextrose anhydrous(Yakuri Pure Chemical, Japan)를 표준물질로 이용, 480 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 44를 곱하여 구하였다(Park and Choi 2004). ELISA를 통하여 측정된 바지락 난의 중량은 총 바지락 조직 건조 중량과의 비율, gonadosomatic index(GSI)로 나타내었다.
- 바지락의 산란은 연중 수온이 곰소나 선재도보다 높은 완도 바지락이 서해안 곰소 및 선재도 바지락보다 빠른 성 성숙 및 산란 활동을 보였다. P. olseni 감염이 바지락의 번식에 미치는 영향은 감염도가 다른 지역에 비해 세 배 이상 높은 완도에서 관찰되었으며, 완도 바지락은 여포 크기, 여포 내 성숙 난의 수 및 번식량 등이 타 지역보다 유의적으로 낮았다. 따라서 P.
- 완도 지역은 서해안의 선재도로부터 남쪽으로 약 350 km 떨어져 있으며, 2004년 완도 지역의 봄철 수온은 서해안의 두 지역보다 약 3-5ºC 높았다. 그 결과 완도 바지락이 서해안 선재도 및 곰소 바지락 집단보다 성 성숙과 산란 시기가 빨랐던 것으로 사료된다(Fig. 2).
- 8A). 그러나 ELISA에 의하여 측정된 각 지역별 바지락의 절대적 번식량(egg mass)을 standard animal로 환산하여 지역별로 비교한 결과, 곰소바지락의 번식량은 133.3 mg로 선재도(61.79 mg) 및 완도 바지락(31.01 mg) 보다 유의적으로 높은 반면, 완도 바지락의 번식량은 31.0 mg으로 세 지역 중, 가장 낮게 나타났다(Fig. 8B).
- olseni 감염이 바지락의 번식에 미치는 영향은 감염도가 다른 지역에 비해 세 배 이상 높은 완도에서 관찰되었으며, 완도 바지락은 여포 크기, 여포 내 성숙 난의 수 및 번식량 등이 타 지역보다 유의적으로 낮았다. 따라서 P. olseni 감염은 폐사 이외에도 다른 연구에서 밝혀진 바와 같이 번식 활동에 부정적인 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
- olseni 세포도 함께 여과되어 감염이 시작 되는데, 이는 바지락 조직 중에서도 아가미 부위가 가장 우선적으로 감염되는 이유가 그 증거로 볼 수 있다고 보고하였다. 따라서 바지락이 연령이 증가할수록 먹이 여과 섭식 활동도 더 활발하게 되며, 상대적으로 연령이 증가할수록 바지락이 P. olseni 세포를 여과하여 감염될 확률이 증가한다. 또한, P.
- 30 × 106 cells/g wet tissue)보다약 3배 정도 높게 나타났다. 따라서 비록 수온의 영향으로 완도 바지락에서 보다 빠른 성 성숙이 관찰되었지만, P.olseni 감염이 암컷 바지락의 성 성숙이나 번식량에 미치는 영향은 선재도나 곰소보다 높게 나타날 것으로 예측된다. Park et al.
- 또한, 여포 내에 생성된 난의 개체수 역시, 완도 바지락이 평균 14개로, 선재도 22개, 곰소 23개 보다 유의적으로 적은 수를 보였다(p < 0.05, Fig. 7B).
- olseni 감염이 번식에 미치는 영향을 조사하였다. 바지락의 산란은 연중 수온이 곰소나 선재도보다 높은 완도 바지락이 서해안 곰소 및 선재도 바지락보다 빠른 성 성숙 및 산란 활동을 보였다. P.
- 바지락의 지역 평균 GSI는 곰소에서 16.1%로 가장 높게 나타났으며, 이는 선재도 6.4% 및 완도 7.2%보다 유의적으로 높았다(p < 0.05, Fig. 8A).
- 생식소의 조직학적 조사 결과, 2004년 5월 경기만 선재도에서 채집된 바지락은 초기발달기(2%), 후기발달기(48%) 및 완숙기(50%)로 90% 이상의 바지락이 성숙 중이거나 완숙기의 상태로 관찰된 반면, 산란 중이거나 산란이 완료된 개체는 발견되지 않았다. 곰소 바지락은 후기발달기(10.
- 선재도, 곰소 및 완도에서 채집된 바지락은 평균 각장 38.3-45.9 mm로 2-3년 생의 성체로 판명되었다(Table 1). 표준화한 지역별 바지락의 조직 건중량은 선재도와 곰소바지락이 각각 968.
- 2%)로 75% 이상의 바지락이 완숙기였다. 선재도나 곰소만의 바지락과 달리 완도 바지락의 생식소는 후기발달기(20.9%), 완숙기(20.9%), 산란기(53.5%) 및 산란후기(4.7%)로 조사된 바지락의 절반 이상에서 산란 활동이 관찰되었다(Fig. 5).
- 세 지역 바지락의 비만도는 유의적인 차이를 보였는데, 곰소 바지락의 평균 CI는 0.155로 세 지역 중 가장 높았으며, 완도 바지락의 평균 CI가 0.100으로 조사지역 중 가장 낮은 값을 보였다(p < 0.05, Fig. 3B).
- 9℃)을 보였다. 세 지역 중, 남쪽에 위치한 완도지역의 수온이 선재도와 곰소만 보다 항상 높았다(Fig. 2). 이 연구에서 바지락이 채집된 2004년 5월 30일의 수온은 선재도, 곰소, 완도 각각 12.
- 세 지역에서 채집된 바지락은 그 크기가 지역에 따라 다소 차이가 있어 각 집단간의 생리적 측정요인(총 단백질, 총 탄수화물, 총 지방 및 GSI)의 비교 시, 연령 또는 크기가 영향을 미칠 것으로 예측되었다. 따라서 이러한 변수를 배제하기 위하여, 실험에 사용된 모든 바지락의 평균 각장인 41.
- 세 지역에서 채집된 바지락은 대부분 P. olseni에 감염되어 있었으며, 감염율은 선재도 98%, 곰소와 완도가 100%였다. 반면에 P.
- 세 지역의 암컷 바지락 집단의 생식소 발달 단계 관찰 시, 생식소 내 혈구 침윤(hemocyte infiltration) 현상이 관찰되었다. 선재도 바지락의 혈구 침윤은 후기 발달기와 완숙기를 보이는 생식소에서 관찰되었으며, 그 비율은 6%(3/50)였다(Fig.
- (2005)은 서해 곰소만에 서식하는 바지락에서 분리한 Perkinsus sp.의 internal transcribed spacer(ITS)와 nontranscribed spacer region(NTS)의 염기서열을 분석한 결과, 유럽의 바지락과 호주 전복 Haliotis laevigata에서 검출된 P. olseni(=P. atlanticus)와 동일 종 임을 확인하였다.
- 2). 이 연구에서 바지락이 채집된 2004년 5월 30일의 수온은 선재도, 곰소, 완도 각각 12.5℃, 14.2℃, 16.5℃로 완도 지역의 수온과 선재도의 수온 차이는 4.1℃로 나타났다.
- 이 연구에서 채집된 바지락의 경우, 5월말 같은 일자에 채집된 경기만 선재도 바지락과 곰소만 바지락의 생식소발달 단계가 후기 발달 또는 완숙기로, 50% 이상의 개체가 산란기를 보인 남해안 완도 바지락보다 성 성숙이 늦어지고 있음을 알 수 있다(Fig. 5). 바지락이 채집된 시기의 지역별 수온은, 선재도와 곰소가 12.
- 6B). 이와 달리, 완도 바지락에서는 생식소의 혈구 침윤 현상이 높은 비율로 나타났으며(27.9%), 혈구 침윤은 생식소 전체에 걸쳐 고르게 관찰되었다. 혈구 침윤 현상은 완도 바지락의 경우 후기 발달 또는 부분 산란기를 보이는 개체의 생식소에서 주로 관찰되며, 일부 개체에서는 바지락 포자충의 감염과 함께 관찰되었다(Fig.
- olseni 감염이 바지락 번식에 미치는 영향을 비교하기 위하여 암컷 개체만을 선별한 뒤, 조직학적 방법을 통하여 각 개체들의 성 성숙 단계를 판별하였으며, 체조직내의 생화학적 성분 및 번식량을 측정하였다. 조직학적 분석 결과, 완숙기 바지락 생식소 지수는 감염도가 최고로 높았던 완도바지락은 곰소 바지락에 비하여 생식소지수, 여포 크기 및 여포 내 성숙난의 개체수 모두, 곰소 지역보다 두 배 정도 낮은 값을 보였다(Fig. 7, 8). 이는 Park et al.
- 총 단백질 량은 선재도와 곰소 바지락이 각각 195.1 mg과 209.2 mg으로 유의적 차이가 없는 반면, 완도 바지락은 108.4 mg으로 다른 두 지역보다 절반 가량 낮았다(p < 0.05, Fig. 9A).
- 총 지질은 선재도와 곰소 바지락이 각각 117.7 mg과 123.3 mg으로 비슷한 반면, 완도 바지락은 53.5 mg으로 다른 두 지역보다 2배 이상 유의하게 낮았다(p < 0.05, Fig. 9C).
- 총 탄수화물의 경우, 선재도 바지락이 190.3 mg으로 가장 높았으며, 이는 곰소 바지락의 탄수화물 함량(116.0 mg) 및 완도 바지락(31.4 mg) 보다 2-6배 이상 높은 수치였다(p < 0.05, Fig. 9B).
- 9 mm로 2-3년 생의 성체로 판명되었다(Table 1). 표준화한 지역별 바지락의 조직 건중량은 선재도와 곰소바지락이 각각 968.8 mg, 958.8 mg으로 유사한 반면, 완도 바지락은 506.3 mg으로 두 지역 바지락보다 약 절반 정도 낮았다(Fig. 3A).
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