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문제 정의
- Franzetti 등[6]은 디젤 오염 토양에서 분리한 Gordonia sp. BS29을 이용하여, 지방족 탄화수소(n-hexadecane, n-heptadecane, pristane, neicosane, n-octacosan, squalene)와 방향족 탄화수소(phenanthrene, anthracen, pyrene)의 제거에 관한 연구를 수행하였다. 그 결과, 53일 동안 지방족 탄화수소는 균주에 의해 30-89% 제거 되었고, 특히 n-hexadecane과 같은 고분자의 탄화수소를 제거하는데 효과적이었다.
제안 방법
- 18 mL-Screw type test tube에 MSM배지 5 mL을 넣고 SD8을 100 µL(2%, v/v) 접종한 후(최종 OD600nm = 0.2 정도), 디젤 농도가 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 그리고 40,000 mg/L가 되도록 디젤을 첨가 하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 디젤로 오염된 토양에서 디젤 분해능이 우수한 Gordonia sp. SD8을 분리하였고, 유일 에너지원과 탄소원으로 디젤을 첨가한 조건 하에서 이 세균의 성장과 디젤 분해능에 미치는 디젤 농도 및 온도 영향을 조사하였다. 또한, 디젤로 오염된 토양을 정화하는데 미치는 Gordonia sp.
- 본 연구에서는 디젤로 오염된 토양에서 디젤 분해능이 우수한 Gordonia sp. SD8을 분리하였고, 이 균주의 디젤 분해 특성을 액상과 토양에서 조사하였다. SD8은 유일 에너지원과 탄소원으로 디젤을 이용하여 생장 가능하였다.
- 또한, 디젤로 오염된 토양을 정화하는데 미치는 Gordonia sp. SD8의 접종 효과를 평가 하였다.
- 배양 조건은 30oC, 180 rpm으로 하였다. 균주 성장에 미치는 배양 온도의 영향을 규명하기 위해 15, 25, 30, 그리고 42oC의 조건에서 디젤의 분해능을 조사하였다[8]. 배양액 중 잔류 TPH 농도는 18 mL-Screw type test tube에 배양액 5 mL와 추출용매인 hexane 5 mL를 넣은 후 30oC, 200 rpm의 교반기에서 30분간 교반하여 추출하였다.
- 배양액 중 잔류 TPH 농도는 18 mL-Screw type test tube에 배양액 5 mL와 추출용매인 hexane 5 mL를 넣은 후 30oC, 200 rpm의 교반기에서 30분간 교반하여 추출하였다. 그 후 test tubes를 실온에서 30분간 정치한 후 상등액(hexane 용매층)을 채취하여 용매 속에 녹아있는 잔류 TPH의 농도를 불꽃 이온화 검출기가 장착된 gas chromatography(5890 series, Hewlett Packard, USA)를 이용하여 분석하였다. GC 분석 조건은 오븐 온도가 초기 40oC 에서 3분간 유지 후, 4oC/min으로 70oC까지 승온하고, 10oC/min으로 200oC까지 승온, 그리고 8oC/min으로 300oC까지 승온 한 후 15분간 유지하였다.
- 잔류 TPH농도는 토양 5 g을 test tube에 넣고, hexane-acetone solution(1:1, v/v)을 5 mL넣어 준 후 30oC, 200 rpm의 교반기에서 30분간 교반 하였다. 그 후 test tubes를 실온에서 30분간 정치한 후 상등액을 채취하여 용매 속에 녹아있는 잔류 TPH의 농도를 gas chromatography(5890 series, Hewlett Packard, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 2, 3에 도시하였다. 디젤 농도를 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 그리고 40,000 mg-TPH L-1로 각각 다르게 하여 SD8의 성장과 디젤 분해 속도를 비교하였다(Fig. 2). 그 결과, 디젤 농도가 20,000 mg-TPH L-1일 때 SD8는 가장 잘 성장하였고(비성장속도는 0.
- 디젤 분해 세균인 SD8을 유류로 장기간 오염된 토양으로 부터 순수 분리하였다. 분리한 균주의 DNA 염기서열을 분석한 후 phylogenetic tree를 작성하여 Fig.
- 25 µm)을 사용하였으며, carrier gas는 N2를 사용하였다. 디젤의 농도가 0, 312.5, 625, 1,250, 10,000, 20,000, 그리고 40,000 mg/L로 하여 검량선을 작성한 후, 검량식으로부터 TPH 농도를 환산하였다.
- 05 d-1), 디젤 분해속도도 가장 높았다(1,727±145 mg-TPH L-1 d-1). 또한, 배양 온도를 15, 25, 30, 37, 그리고 42oC로 달리하여 SD8 균주의 비성장속도와 디젤 분해속도를 상대값을 이용하여 온도의 영향을 비교하였다(Fig. 3). SD8 균주는 30oC에서 비성장속도와 디젤분해속도가 가장 빨랐고, 25oC일 때의 SD8의 성장속도와 TPH 분해속도가 비슷했으며, 고온과 저온일 때는 균주가 잘 성장하지 못했다.
- 배양액을 LB agar plate(Difco, USA)에 도말하여 30oC에서 배양시킨 후, 형성된 colony의 색과 모양을 고려하여 20개의 균주를 선별한 후, 10,000 mg/L의 디젤이 첨가된 MSM 배지에 접종하여 30oC, 250 rpm의 배양기에서 3일간 진탕 배양하였다. 배양액의 잔류디젤농도를 gas chromatography를 이용하여 분석한 뒤 디젤 분해능을 가진 균을 선별하였다. MSM 배지의 조성은 MgSO4·7H2O 0.
- 디젤 분해 세균인 SD8을 유류로 장기간 오염된 토양으로 부터 순수 분리하였다. 분리한 균주의 DNA 염기서열을 분석한 후 phylogenetic tree를 작성하여 Fig. 1에 나타내었다. 분석된 SD8의 DNA 염기서열은 총 1030 bp였고, NCBI Blast search한 결과 SD8은 파라핀계 탄화수소 또는 메탄계 탄화수소라 불리는 알칸(alkane)을 분해하는 Gordonia sp.
- 온도가 30o인 chamber에 pot을 36일 동안 넣고 7일에 한번씩 15 mL의 MSM 배지와 증류수를 격주로 교대로 주입하여 토양이 건조해지지 않도록 하였다. 일정한 시간 간격으로 대조군과 SD8 균주를 접종한 pot 한 개씩을 통째로 꺼내, 토양 중의 잔류 TPH농도를 측정하였다. 잔류 TPH농도는 토양 5 g을 test tube에 넣고, hexane-acetone solution(1:1, v/v)을 5 mL넣어 준 후 30oC, 200 rpm의 교반기에서 30분간 교반 하였다.
대상 데이터
- SD8을 3.5×107 CFU/g로 넣어 주었고, 나머지 6개의 pot에는 균주를 접종하지 않은 대조군을 준비하였다.
- 분리 균주를 이용한 디젤오염 토양 처리실험을 위해, 인공오염토양은 서울 소재 이화여자대학교의 산림토양을 채취하여 준비하였다. 채취한 토양은 2 mm 체로 쳐서 돌과 이물질을 제거한 후, 산림토양과 마사를 2:1(w/w)로 섞어 준 후, 디젤(20,000 mg-TPH kg-dry soil-1)로 인공 오염 시킨 후, 4일간 서늘한 곳에 두고 하루에 한 번씩 토양을 위아래로 섞어 주었다.
- 시료 주입부와 검출기 온도는 각각 300과 320oC이고, column은 HP-5 capillary column(0.25 mm×30 m, 0.25 µm)을 사용하였으며, carrier gas는 N2를 사용하였다.
- 유류와 중금속으로 장기간 오염된 울산 소재 정유공장의 유류 저장 탱크 주변 토양을 사용하였으며, 채취 토양을 2 mm 체로 쳐서 돌과 이물질을 제거하였다. 이렇게 전처리한 토양 10 g에 멸균수 20 mL을 넣고 200 rpm 교반기에서 30분간 교반 한 후, 실온에서 30분간 정치시켰다.
이론/모형
- 디젤 분해능을 조사한 균주 중에서 디젤 분해능이 가장 우수한 균주를 선별하여 SD8 이라 명명하였다. 이 균주는 16S rDNA 부분 염기서열 분석을 통해 동정하였고, 염기서열 분석은 Koo와 Cho[10]가 이용한 방법을 사용하였다.
성능/효과
- 3). SD8 균주는 30oC에서 비성장속도와 디젤분해속도가 가장 빨랐고, 25oC일 때의 SD8의 성장속도와 TPH 분해속도가 비슷했으며, 고온과 저온일 때는 균주가 잘 성장하지 못했다.
- 본 연구에서는 유류로 장기간 오염된 토양에서 Gordonia sp. SD8 균주를 분리하고 시험관에서 뿐 만 아니라 토양에서 디젤 분해 활성이 발휘됨을 규명함으로써, 오염 토양 정화에 활용 가능한 우수 미생물자원을 확보하였다.
- SD8 균주의 성장과 디젤 분해속도에 미치는 디젤 농도 영향을 조사한 결과, 20,000 mg-TPH L-1농도에서 최대 비성장속도(0.67±0.05 d-1)와 최대분해속도(1727±145 mg-TPH L-1 d-1)를 얻을 수 있었다.
- SD8 접종 효과를 조사한 결과, 17일 경과 후, SD8을 접종하지 않은 대조군 토양의 디젤 잔류 농도는 8,150±755 mg-TPH kg-dry soil-1이었으나, SD8을 접종한 경우에는 3,724 mg-TPH kg-dry soil-1이었다.
- 이러한 결과는 Gordonia sp. SD8의 디젤 분해 활성이 토양에서도 발휘되는 것을 시사하며, SD8 균주는 향후 디젤 등을 포함한 석유계 탄화수소화합물로 오염된 토양을 정화하는데 활용 가능한 미생물임을 보여주는 증거이다.
- BS29을 이용하여, 지방족 탄화수소(n-hexadecane, n-heptadecane, pristane, neicosane, n-octacosan, squalene)와 방향족 탄화수소(phenanthrene, anthracen, pyrene)의 제거에 관한 연구를 수행하였다. 그 결과, 53일 동안 지방족 탄화수소는 균주에 의해 30-89% 제거 되었고, 특히 n-hexadecane과 같은 고분자의 탄화수소를 제거하는데 효과적이었다. 방향족 탄화수소는 76일간 균주를 처리하였는데 anthracen과 pyrene의 제거에 효과적이었다[6].
- 그 결과, 디젤 농도가 20,000 mg-TPH L-1일 때 SD8는 가장 잘 성장하였고(비성장속도는 0.67±0.05 d-1), 디젤 분해속도도 가장 높았다(1,727±145 mg-TPH L-1 d-1).
- 2) 및 증류수 1 L 이다. 디젤 분해능을 조사한 균주 중에서 디젤 분해능이 가장 우수한 균주를 선별하여 SD8 이라 명명하였다. 이 균주는 16S rDNA 부분 염기서열 분석을 통해 동정하였고, 염기서열 분석은 Koo와 Cho[10]가 이용한 방법을 사용하였다.
- 05 d-1)와 최대분해속도(1727±145 mg-TPH L-1 d-1)를 얻을 수 있었다. 또한, 이 균주는 40,000 mg-TPH L-1의 고농도 디젤을 분해할 수 있었으며, 30o C에서 비성장속도와 디젤분해속도가 가장 빨랐다. 디젤로 오염된 토양 정화에 미치는 Gordonia sp.
- BS29의 디젤 생분해능을 조사한 결과 53일 동안 탄화수소는 30-89%가 제거되었다. 본 연구에서 분리한 디젤 분해 미생물인 Gordonia sp SD8 균주는 TPH의 농도 30,000 mg-TPH L-1까지 빠른 속도로 디젤을 분해를 하였고, 40,000 mg-TPH L-1의 고농도 디젤도 분해할 수 있었다. 즉, SD8은 이전 연구자의 균주보다 고농도에서도 디젤을 분해할 수 있음을 알 수 있었다.
- 본 연구에서 분리한 디젤 분해 미생물인 Gordonia sp SD8 균주는 TPH의 농도 30,000 mg-TPH L-1까지 빠른 속도로 디젤을 분해를 하였고, 40,000 mg-TPH L-1의 고농도 디젤도 분해할 수 있었다. 즉, SD8은 이전 연구자의 균주보다 고농도에서도 디젤을 분해할 수 있음을 알 수 있었다.
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