본 연구에서는 69가지의 한약재를 이용하여 구강세균인 Actinomyces viscocus, Streptococcus sobrinus, 그리고 Streptococcus mutans 2종에 대한 항균효과를 조사하였다. 우선 선발된 한약재를 메탄올로 추출하여 조사하였으며 그 결과를 바탕으로 소목, 오매, 오미자, 그리고 황련을 선별하여 열수, 에탄올, 메탄올, 그리고 에틸아세테이트를 이용하여 항균효과를 조사하였다. 조사결과 황련 열수 추출물이 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 조사되었다. 황련 열수 추출물을 이용하여 공시균주에 대한 저해양상을 조사한 결과 180 mg/ml 이상의 농도에서 공시균주의 생육이 대부분 저해되는 것을 확인할 수 있었으며 이 때 황련 열수 추출물의 회수율은 22%였다. 황련 열수 추출물을 UPLC를 이용하여 berberine 함량을 조사한 결과 25.54%로 조사되었다. 또한 $121^{\circ}C$에서 15분간 열 처리 후 황련 열수 추출물의 열 안정성을 조사한 결과 열에 대하여 안정 하다는 것을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 69가지의 한약재를 이용하여 구강세균인 Actinomyces viscocus, Streptococcus sobrinus, 그리고 Streptococcus mutans 2종에 대한 항균효과를 조사하였다. 우선 선발된 한약재를 메탄올로 추출하여 조사하였으며 그 결과를 바탕으로 소목, 오매, 오미자, 그리고 황련을 선별하여 열수, 에탄올, 메탄올, 그리고 에틸아세테이트를 이용하여 항균효과를 조사하였다. 조사결과 황련 열수 추출물이 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 조사되었다. 황련 열수 추출물을 이용하여 공시균주에 대한 저해양상을 조사한 결과 180 mg/ml 이상의 농도에서 공시균주의 생육이 대부분 저해되는 것을 확인할 수 있었으며 이 때 황련 열수 추출물의 회수율은 22%였다. 황련 열수 추출물을 UPLC를 이용하여 berberine 함량을 조사한 결과 25.54%로 조사되었다. 또한 $121^{\circ}C$에서 15분간 열 처리 후 황련 열수 추출물의 열 안정성을 조사한 결과 열에 대하여 안정 하다는 것을 확인할 수 있었다.
In this study, we investigated the antibacterial effect of 69 oriental medicinal herbs (OMHs) on Actinomyces viscocus, Streptococcus sobrinus, and two strains of Streptococcus mutans as oral bacteria. Methanol extracts of OMHs were used in the first antibacterial test, and then boiled water, ethanol...
In this study, we investigated the antibacterial effect of 69 oriental medicinal herbs (OMHs) on Actinomyces viscocus, Streptococcus sobrinus, and two strains of Streptococcus mutans as oral bacteria. Methanol extracts of OMHs were used in the first antibacterial test, and then boiled water, ethanol, methanol, and ethyl acetate extracts of C. japonica, C. sappan, P. mume, and S. chinensis were used in the second test. Boiled water extract of C. japonica was shown to have the most superior effect on oral bacteria. The extract yield of boiled water extract of C. japonica was 22%, and the growth of oral bacteria was almost inhibited at over a 180 mg/ml concentration. Antibacterial effect compound analyzed by UPLC method was identified as berberine, and the content was 25.54%. In addition, the extract appeared to be stable at $121^{\circ}C$ for 15 min.
In this study, we investigated the antibacterial effect of 69 oriental medicinal herbs (OMHs) on Actinomyces viscocus, Streptococcus sobrinus, and two strains of Streptococcus mutans as oral bacteria. Methanol extracts of OMHs were used in the first antibacterial test, and then boiled water, ethanol, methanol, and ethyl acetate extracts of C. japonica, C. sappan, P. mume, and S. chinensis were used in the second test. Boiled water extract of C. japonica was shown to have the most superior effect on oral bacteria. The extract yield of boiled water extract of C. japonica was 22%, and the growth of oral bacteria was almost inhibited at over a 180 mg/ml concentration. Antibacterial effect compound analyzed by UPLC method was identified as berberine, and the content was 25.54%. In addition, the extract appeared to be stable at $121^{\circ}C$ for 15 min.
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문제 정의
본 연구에서는 69가지의 한약재를 이용하여 구강세균인 Actinomyces viscocus, Streptococcus sobrinus, 그리고 Streptococcus mutans 2종에 대한 항균효과를 조사하였다. 우선 선발된 한약재를 메탄올로 추출하여 조사하였으며 그 결과를 바탕으로 소목, 오매, 오미자, 그리고 황련을 선별하여 열수, 에탄올, 메탄올, 그리고 에틸아세테이트를 이용하여 항균효과를 조사하였다.
그러나 보다 우수한 제품을 제조하기 위하여 구강세균에 미치는 각종 화학물질의 영향을 조사하거나(11) 팽이모자반(4), 호장근(13), 정향(10), 오미자(9), 카테킨(21) 그리고 다양한 다류(12)를 이용한 항균효과 등 다양한 연구가 보고되었다. 이에 본 연구자들은 한의학에서 사용되고 있는 한약재를 이용하여 구강세균의 성장을 억제하여 구강질환을 예방 또는 치료할 수 있는 연구를 진행하기 위한 후보물질을 선발하여 조사하였으며 결과를 함께 공유하고자 한다.
제안 방법
1차와 2차 조사는 추출물을 6 mm paper disc(Advantec, Japan)에 20 μl 점적한 후 한천평판확산법(agar diffusion method)으로 조사하였으며 공시균주의 생육이 억제되면서 형성되는 생육저지환(clear zone)의 크기로 항균효과의 유ㆍ무와 정도를 확인하였다.
2차 조사의 결과를 바탕으로 가장 우수한 항균효과를 나타내는 한약재를 최종 선발하고 공시균주의 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 전배양한 공시균주의 수를 조정한 후 100 μl 접종하고 추출물 20 μl를 첨가하여 24시간 배양하면서 조사하였다.
가장 우수한 항균효과를 나타내는 한약재의 추출물을 UPLC(ultra high performance liquid chromatography)를 이용하여 표준품과 비교하였으며 이때의 조건은 Table 2와 같이 하였다. 사용 용매는 모두 특급을 사용하였으며 증류수는 탈이온 처리하였으며, 사용 전 0.
공시균주의 배양을 위하여 Brain Heart Infusion (0.77% calf brains, 0.98% beef heart, 1.0% proteose peptone, 0.2% dextrose, 0.5% sodium chloride, 0.25% disodium phosphate, pH 7.4; Becton Dickinson, USA)을 사용하였다. 공시균주는 37°C에서 정치 배양하였으며 S.
메탄올 추출물의 항균효과를 바탕으로 공시균주에 대하여 양호한 항균효과를 나타낸 소목, 오매, 오미자 그리고 황련을 항균효과 조사를 위한 한약재로 선별하고 각각의 용매로 추출하여 조사한 항균효과와 회수율은 Table 3과 같았다.
미리 배양해 둔 공시균주의 수를 조정한 후 100 μl를 첨가 하여 고체 배지를 제조한 후 한약재의 메탄올 추출물 20 μl를 paper disc에 점적하여 상온에서 건조시키고 배지에 얹어 37°C에서 24시간 배양하여 1차 조사한 항균효과의 결과는 다음과 같았다.
전배양한 공시균주의 수를 조정한 후 100 μl 접종하고 추출물 20 μl를 첨가하여 24시간 배양하면서 조사하였다. 분광광도계(Spectrophotometer, Shimadzu, Japan)를 이용하여 660 nm에서 생육도를 조사하였으며 추출물의 첨가에 따라 배지의 흡광도가 변함으로 배지에 추출물만 첨가한 후 동일한 조건에서 배양하고 흡광도 측정 시 대조구로 사용하였다. 실험에서 얻어진 결과의 유의성은 SPSS 11.
실험을 위해서 공시균주를 고체배지에 접종하여 배양한 후 4°C에서 보관하면서 사용하였으며 한 주에 한 번씩 계대 배양하여 실험 2일전 다시 계대 배양하여 균을 활성화시킨 후 사용하였다.
에탄올, 메탄올 및 에틸아세테이트를 이용한 추출물의 제조는 한약재에 10배량의 용매를 가하고 상온에서 100 rpm, 24시간 교반 시킨 후 여과(Filter paper No. 2, Whatman, Japan)한 후 대형회전농축기(Rotary evaporator, Buchi, Switzerland)로 감압 농축하고 각각의 용매로 다시 현탁한 후 0.2 μm filter (Minisart RC 25, Sartorius, Germany)로 제균하여 준비하였다.
본 연구에서는 69가지의 한약재를 이용하여 구강세균인 Actinomyces viscocus, Streptococcus sobrinus, 그리고 Streptococcus mutans 2종에 대한 항균효과를 조사하였다. 우선 선발된 한약재를 메탄올로 추출하여 조사하였으며 그 결과를 바탕으로 소목, 오매, 오미자, 그리고 황련을 선별하여 열수, 에탄올, 메탄올, 그리고 에틸아세테이트를 이용하여 항균효과를 조사하였다. 조사결과 황련 열수 추출물이 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 조사되었다.
전배양한 공시균주의 수를 조정한 후 100 μl 접종하고 추출물 20 μl를 첨가하여 24시간 배양하면서 조사하였다.
물 추출물의 경우에는 10배량의 1차 정제수를 가하여 85°C 에서 2시간 정도 끓여 추출한 후 용매를 이용한 추출물과 동일한 방법으로 준비하여 사용하였다. 추출물의 회수율은 회수된 추출물의 중량을 추출 시 사용한 한약재의 중량으로 나눈 후 백분율로 계산하였다.
한약재 중 가장 우수한 항균효과를 나타내는 추출물을 121°C에서 15분간 열처리를 한 후 실온에 방치하여 식힌 후 열 처리를 하지 않은 대조구와 함께 한천평판확산법을 이용하여 항균 효과를 비교하였다.
항균효과를 나타내는 한약재를 선별하기 위하여 메탄올 추출물을 이용하여 선행 조사하였으며(1차) 그 결과를 바탕으로 한약재를 선별하고 용매별 추출물을 제조하여 항균효과를 조사하였다(2차). 한약재의 경우 추출물을 제조할 때마다 구입하여 사용하였다.
항균효과를 조사하기 위하여 미리 배양해 둔 공시균주를 원심분리(7,085×g, 2 min)하여 회수한 후 상등액을 제거하고 잔존 배지성분 등의 제거를 위하여 멸균수로 현탁 시키고 동일한 방법으로 3번 반복한 후 희석하여 준비하였으며 1.5±0.5×108 cells/ml로 균수를 조정하여 사용하였다.
2 μm filter (Minisart RC 25, Sartorius, Germany)로 제균하여 준비하였다. 현탁 용매에 의한 항균효과가 나타날 수 있음으로 실온에서 무균적으로 30분 이상 건조 시켜 용매에 의한 영향을 배제시킨 후 연구에 사용하였으며 별도의 대조구는 처리하지 않았다.
대상 데이터
구강세균에 대하여 항균효과를 나타내는 한약재를 조사하기 위하여 본초학을 바탕으로 문헌조사를 하였으며 이를 바탕으로 한약재를 선발하여 수성구 상동 소재의 대원약업사에서 생약제제로 포장되어 판매하는 제품을 구입하여 사용하였다(Table 1).
본초학을 바탕으로 선발한 69종의 한약재로부터 항균효과를 나타내는 물질을 추출하기 위한 용매로 물, 에탄올, 메탄올 및 에틸아세테이트를 사용하였다. 에탄올, 메탄올 및 에틸아세테이트를 이용한 추출물의 제조는 한약재에 10배량의 용매를 가하고 상온에서 100 rpm, 24시간 교반 시킨 후 여과(Filter paper No.
45 μm filter로 여과하여 사용하였다. 사용기기는 UPLC (ACQUITYTM, Waters, USA)를 이용하였으며 검량선 작성은 표준품(25, 50, 100 ppm)을 이용하여 검량선을 작성하여 사용하였다.
한약재의 항균효과를 조사하기 위하여 S. sobrinus KCCM 11898, A. viscocus KCCM 12074, S. mutans KCCM 40105 및 S. mutans KCCM 41032를 한국미생물보존센터로부터 분양 받아 사용하였다.
데이터처리
실험에서 얻어진 결과의 유의성은 SPSS 11.0 (Statistical package for social sciences) program을 이용하여 실험군당 평균± 표준편차로 표시하였다.
성능/효과
viscocus 경우에도 30-90 mg/ml 구간에서 생육이 저해되었으나 150 mg/ml에서 다시 증가하다가 180 mg/ml에서는 생육하지 않는 것으로 조사되었다. S. mutans KCCM 41032의 경우 30 mg/ml의 농도에서 13% 이하의 저해를 받는 것으로 조사되었으며 다른 공시균과 달리 농도에 따른 생육도의 일시적인 상승 없이 농도에 따라 저해를 받는 것으로 조사되었으며 황련 열수 추출물에 대한 저항성이 가장 높은 것으로 조사되었다. S.
S. sobrinus의 경우에는 16종의 한약재(단삼, 대황, 박하, 백굴채, 삼백초, 상심자, 소목, 오매, 오미자, 측백엽, 치자, 판람근, 현호색, 황금, 황련, 황백)에서, A. viscocus의 경우에는 11종의 한약재(단삼, 대황, 박하, 삼백초, 상심자, 소목, 오매, 측백엽, 황금, 황련, 황백)에서, S. mutans KCCM 40105의 경우에는 14종의 한약재(단삼, 단향, 대황, 산수유, 소목, 오매, 오미자, 측백엽, 하엽, 현호색, 홍화, 황금, 황련, 황백)에서 그리고 S. mutans KCCM 41032의 경우에는 20종의 한약재(단삼, 단향, 대계, 대황, 박하, 사상자, 산수유, 삼백초, 상심자, 소목, 소회향, 아출, 오매, 오미자, 지실, 측백엽, 판람근, 황금, 황련, 황백)에서 항균효과를 나태내는 것으로 조사되었다.
54%로 조사되었다. 또한 121°C에서 15분간 열 처리 후 황련 열수 추출물의 열 안정성을 조사한 결과 열에 대하여 안정하다는 것을 확인할 수 있었다.
선발한 한약재의 메탄올 추출을 통한 회수율은 Table 1과 같이 조사되었다. 산사와 산수유의 경우 120% 이상의 회수율을 나타내어 가장 높은 회수율을 나타내었으며 계지 외 16종의 한약재는 10% 미만의 낮은 회수율을, 녹두와 적소두의 경우에는 회수되지 않는 것으로 조사되었다.
선별된 한약재 중 소목의 경우 메탄올 추출물에서, 오매, 오미자 그리고 황련은 열수 추출물에서 가장 우수한 항균효과를 나타내었으며 선별된 한약재 중 황련이 가장 우수한 항균효과를 나타내는 것으로 조사되었으며(Fig. 1) 에틸아세테이트 추출물의 경우 대부분의 결과에서 항균성이 나타나지 않는 것으로 미루어 추출물을 현탁한 유기 용매가 나타낼 수 있는 항균성은 배제할 수 있을 것으로 판단되었다. 이 결과는 안 등(1), 배(2)와 장 등(8)의 연구결과, 특히 장 등이 보고한 황련의 berberine에 의한 항균효과에 대한 연구결과와 유사한 것으로 판단되었다(5).
소목의 경우 4종의 용매 추출물에서 모두 항균효과를 나타내었으나 소목을 제외한 나머지 한약재의 경우 추출 용매에 따라 선택적으로 항균효과를 나타내는 것으로 조사되었다. 소목의 경우 이미 암세포주에 대한 증식억제(6)와 가축의 질병 원인균(7, 17)에 대한 항균성이 있다고 보고 되었으며, 특히 S.
열수 추출물을 121°C에서 15분간 열 처리 후 한천평판확산법을 이용하여 대조구와 항균효과를 비교한 결과 Fig. 4와 같이 공시균주에 대하여 거의 유사한 수준의 항균효과를 나타내는 것으로 조사되었으나 실험구에서 약간 더 우수한 항균효과를 나타내는 것으로 조사되었다.
이에 본 연구자들은 추출한 황련 열수 추출물에서 berberine을 확인하기 위하여 UPLC로 분석한 결과 표준품과 동일한 머무름 시간에서(6분) peak를 확인할 수 있었으며(Fig. 2) 그 함량은 25.54% (25.54 mg/L)로 확인되었다. 그러나 조정제 수준의 시료에서 berberine에 의한 항균효과라고 단정 짓기는 어려울 것으로 판단되었으나 기존의 보고(5)와 비교할 때 가능성은 확인할 수 있었으며 황련 열수 추출물로부터 berberine 성분을 분리ㆍ정제 과정을 진행한 후 이 부분에 대한 확인 연구를 진행할 예정이다.
우선 선발된 한약재를 메탄올로 추출하여 조사하였으며 그 결과를 바탕으로 소목, 오매, 오미자, 그리고 황련을 선별하여 열수, 에탄올, 메탄올, 그리고 에틸아세테이트를 이용하여 항균효과를 조사하였다. 조사결과 황련 열수 추출물이 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 조사되었다. 황련 열수 추출물을 이용하여 공시균주에 대한 저해양상을 조사한 결과 180 mg/ml 이상의 농도에서 공시균주의 생육이 대부분 저해되는 것을 확인할 수 있었으며 이 때 황련 열수 추출물의 회수율은 22%였다.
3과 같이 조사되었다. 추출물을 첨가하지 않은 대조구와 비교할 때 S. mutans KCCM 40105의 경우 30 mg/ml의 농도에서 76%의 생육이 저해되는 것으로 조사되었으며 60 mg/ml 이상의 농도에서는 거의 생육하지 않는 것으로 조사되어 공시균주 중 가장 낮은 농도에서 가장 높은 저해를 나타내었다. S.
황련 열수 추출물을 이용하여 공시균주에 대한 저해양상을 조사한 결과 180 mg/ml 이상의 농도에서 공시균주의 생육이 대부분 저해되는 것을 확인할 수 있었으며 이 때 황련 열수 추출물의 회수율은 22%였다. 황련 열수 추출물을 UPLC를 이용하여 berberine 함량을 조사한 결과 25.54%로 조사되었다. 또한 121°C에서 15분간 열 처리 후 황련 열수 추출물의 열 안정성을 조사한 결과 열에 대하여 안정하다는 것을 확인할 수 있었다.
조사결과 황련 열수 추출물이 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 조사되었다. 황련 열수 추출물을 이용하여 공시균주에 대한 저해양상을 조사한 결과 180 mg/ml 이상의 농도에서 공시균주의 생육이 대부분 저해되는 것을 확인할 수 있었으며 이 때 황련 열수 추출물의 회수율은 22%였다. 황련 열수 추출물을 UPLC를 이용하여 berberine 함량을 조사한 결과 25.
회수율의 경우 오미자 열수 추출물이 112%로 가장 높이 조사되었고 황련 에틸아세테이트 추출물이 0.1%로 가장 낮은 것으로 조사되었으며 회수율과 항균효과의 상관관계는 확인할 수 없었다. 또한 회수율의 경우 추출물을 제조한 경우마다 약간의 차이를 나타내었다.
후속연구
150 mg/ml 전, 후의 농도에서 생육도의 일시적인 상승이 반복실험에서 지속적으로 확인되는 것으로 미루어 박 등(19)의 연구에서와 같이 분광광도계를 이용한 조사결과 첨가물에 의하여 생육이 저해되다가 다시 증가하는 것과 같은 양상을 나타내었으나 그 이유는 불명확하여 이 부분에 대한 연구가 필요한 것으로 판단되었다.
54 mg/L)로 확인되었다. 그러나 조정제 수준의 시료에서 berberine에 의한 항균효과라고 단정 짓기는 어려울 것으로 판단되었으나 기존의 보고(5)와 비교할 때 가능성은 확인할 수 있었으며 황련 열수 추출물로부터 berberine 성분을 분리ㆍ정제 과정을 진행한 후 이 부분에 대한 확인 연구를 진행할 예정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
치아우식증과 관련된 균은 무엇인가?
대표적인 구강질환인 치아우식증과 치주염은 치면세균막내의 세균에 의하여 발생하는 감염성질환이며 치면세균막질환이라고 한다. 현재까지 Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus 그리고 Actinomyces sp.가 치아우식증과 관련이 있는 것으로 알려져 있다(18).
치아우식증을 유발하는 균주들이, 치면세균막을 형성하는 방법은?
가 치아우식증과 관련이 있는 것으로 알려져 있다(18). 이러한 균주들은 glucosyltransferase 를 분비하여 자당으로부터 비수용성 및 수용성 glucan을 생성하는데, 이 중 비수용성 glucan은 치아표면에 부착하게 되고 부착된 glucan에 구강내 여러 세균이 응집하여 치면세균막을 형성하게 된다. 응집된 치면세균막내의 미생물에 의하여 대사산물의 부산물로 산을 생성하게 되며, 세균에 의해 생성된 산은 치면세균막 내에 축적되고 타액의 완충작용의 영향을 받지 않게 되어 초기 치아우식증의 원인이 된다(5).
본 연구에서 소목, 오매, 오미자, 그리고 황련 중, 항균효과가 가장 우수한 한약재는?
우선 선발된 한약재를 메탄올로 추출하여 조사하였으며 그 결과를 바탕으로 소목, 오매, 오미자, 그리고 황련을 선별하여 열수, 에탄올, 메탄올, 그리고 에틸아세테이트를 이용하여 항균효과를 조사하였다. 조사결과 황련 열수 추출물이 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 조사되었다. 황련 열수 추출물을 이용하여 공시균주에 대한 저해양상을 조사한 결과 180 mg/ml 이상의 농도에서 공시균주의 생육이 대부분 저해되는 것을 확인할 수 있었으며 이 때 황련 열수 추출물의 회수율은 22%였다.
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