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문제 정의
- 본 연구는 probiotic bacteria의 선정 기준의 하나인 항산화 활성을 조사하기 위해 갓김치에서 분리된 유산균 5종을 대상으로 hydrogen peroxide, superoxide anions 및 hydroxyl radical 등의 ROS에 대한 저항력과 DPPH radical, superoxide radical 소거능, 환원력 및 Fe2+ chelating 활성 등을 측정하여 산화 억제 능력을 실험한 결과이다.
제안 방법
- 37℃에서 18시간 배양한 유산균은 원심분리(7,000×g, 20분, 4℃)하여 세포를 모으고 PBS로 3회 세척한 현탁 세포액(약 108 CFU/ml) 100 μl를 Lactobacilli MRS agar 평판배지 위에 도말한 후 멸균수에 용해시킨 10 mM paraquat의 10 μl 를 균 접종한 평판배지 위에 spot하여 37℃에서 24시간 배양하여 생성된 저해환을 측정하였다.
- DPPH radical 소거능 측정 : Brand-Williams 등(6)의 방법을 일부 변형하여 DPPH radical 소거능을 측정하였다. 유산균 IC 혹은 ICFE 100 μl에 에탄올에 녹인 4.
- Hydroxyl radical에 대한 저항성 : Fenton 반응을 통해 발생된 hydroxyl radical에 대한 유산균의 저항성은 Barreto 등(4)에 따라 일부 변형하여 측정하였다. PBS에 용해시킨 10 mM terephthalic acid (1,4-benzenedicarboxylic acid), 유산균세포(108 CFU/ml) 및 0.
- PBS에 용해시킨 10 mM terephthalic acid (1,4-benzenedicarboxylic acid), 유산균세포(108 CFU/ml) 및 0.01 mM CuSO4·5H2O가 포함된 용액 내에서 hydroxyl radical을 발생시킨 다음 1 mM H2O2를 첨가 ㅍ하여 반응시켜 15분 간격으로 용액을 채취한 다음 Lactobacilli MRS agar를 이용하여 생균수를 측정하여 저해율을 계산하였다
- 가정에서 담궈 3개월 가량 숙성시킨 갓김치(pH 3.8-5.2) 8종을 수집하여 채취한 시료 50 g과 멸균생리식염수(0.85% NaCl 용액) 450 ml을 혼합하여 2분간 균질화한 후 시료용액1 ml를 1% CaCO3가 첨가된 Lactobacilli MRS agar 배지에 접종하여 37℃, 24-48시간 동안 미호기성 조건(10% O2, Anoxomat system, MART Co., Netherland)으로 배양한 후 투명한 환을 생성하는 독립된 집락을 사면배지에 3회 계대 배양하여 활성을 높인 후 사용하였다. 선발된 5종의 유산균을 대상으로 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (27)에 따라 배양학적 및 생화학적 특성과 API 50 CHL를 이용하여 당 발효능을 조사하여 추정되는 유산균명을 확인하였다.
- 갓김치로부터 분리된 유산균 5종(Lactobacillus acidophilus GK20, Lactobacillus brevis GK55, Lactobacillus paracasei GK74, Lactobacillus plantarum GK81, 및 Leuconostoc mesenteroides GK104)의 활성산소종에 대한 저항성 및 항산화 활성을 조사하였다. Hydrogen peroxide (0.
- 선발된 5종의 유산균을 대상으로 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (27)에 따라 배양학적 및 생화학적 특성과 API 50 CHL를 이용하여 당 발효능을 조사하여 추정되는 유산균명을 확인하였다.
- 유산균의 IC와 ICFE 항산화 활성은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl), superoxide radical 소 거능 및 환원력을 측정하여 평가하였다. 양성 대조구로서 100 mg/L vitamin C 및 BHA을 사용하여 활성을 비교하였다.
- 유산균 IC 혹은 ICFE 100 μl에 에탄올에 녹인 4.0×10-4 M DPPH 용액 100 μl를 96 well plate에 loading한 다음 빛을 차단하여 20℃에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 microplate reader (Spectrocount; Packard Instruments, USA)로 흡광도를 측정하여 다음 식에 따라 DPPH radical 소거능을 계산하였다.
- , USA)로 여과하여 얻었다. 유산균의 IC와 ICFE 항산화 활성은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl), superoxide radical 소 거능 및 환원력을 측정하여 평가하였다. 양성 대조구로서 100 mg/L vitamin C 및 BHA을 사용하여 활성을 비교하였다.
- 즉, 96 well plate 에 sodium carbonate buffer (pH 10.0), xanthine, ethylenediaminetetracetic acid (EDTA), bovine serum albumin 및 nitro blue tetrazolium 혼합용액 100 μl와 유산균의 IC 혹은 ICFE 100 μl를 가하고, xanthine oxidase를 최종적으로 12 mU가 되도록 첨가하여 25℃에서 20분간 반응시킨 후 CuCl로 반응을 정지시킨 후 560 nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식에 따라 superoxide radical 소거능을 계산하였다.
- 한편, 유산균을 접종한 평판배지에 superoxide anions을 유도하는 paraquat을 spot하여 배양한 후 생성된 저해환의 크기를 측정하였다. Paraquat는 확산을 통해 세포막을 통과하여 산소와 반응한 결과 superoxide anions을 생성하여 세포에 유해성분으로 작용한다(34).
- 환원력 측정 : 유산균의 환원력은 Oyaizu (24)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 유산균 IC 혹은 ICFE (100 μl)은 1% potassium ferric cyanide (100 μl)와 sodium phosphate buffer (0.
대상 데이터
- 가정에서 담궈 숙성시킨 갓김치 8종을 수집하여 Lactobacilli MRS agar 평판배지에 배양하여 전형적인 유산균으로 추정되는 균을 대상으로 생화학적 특성 및 당 발효능을 조사한 결과는 Table 1과 같다. GK20은 L형 lactic acid 생산, catalase 음성, lysine과 ornithine 가수분해 및 45℃ 하에서 증식하며 arabinose, ribose, mannose 및 raffinose 등을 분해하고 동정확률(ID) 99.
- 유산균 분리 및 배양에 사용된 배지 Lactobacilli MRS agar 및 broth는 Difco (USA)사 제품, 분리된 유산균의 동정에 사용된 API 50 CHL kit는 bioMériux (France)사 제품, ROS에 대한 저항성 측정과 radical 소거능, 환원력 및 Fe2+-chelating 활성 측정에 사용된 시약은 모두 Sigma Co. (USA)에서 구입 하여 사용하였다.
데이터처리
- a‐e Means with different letters in a column are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 실험은 모두 3회 반복하여 실시하였으며, 유산균주 간의 차이는 SPSS (version 12.0, USA) 프로그램의 분산분석(ANOVA) 을 이용하여 비교하였고, 평균간 유의성은 Duncan’s multiple range test를 사용하여 p<0.05 수준에서 시험구들과 대조구 간의 유의적 차이를 검정하였다.
이론/모형
- Fe2+-chelating 활성 측정 : 유산균의 Fe2+-chelating 능력 측정은 Yu 등(38) 방법에 따라 측정하였다. 유산균의 ICFE 0.
- Superoxide anions에 대한 저항성 : Paraquat(1,1’-dimethyl4,4’-bipyridinium)에 의해 유도된 superoxide anions에 대한 유산균의 저항성은 Bauer 등(5)의 diffusion assay법에 따라 측정하였다.
- Superoxide radical 소거능 측정 : Superoxide radical 소거능은 Kim 등(15) 방법에 따라 측정하였다. 즉, 96 well plate 에 sodium carbonate buffer (pH 10.
- 유산균의 항산화력 측정에 사용된 유산균의 세포는 Lin과 Chang (22)의 방법에 따라 준비하였다. 즉, Lactobacilli MRS broth 배지에 접종하여 37℃, 18시간 배양한 배양액을 원심분리(7,000×g, 20분, 4℃)하여 회수한 pellet (intact cell, IC)은 PBS로 3회 세척 후 PBS에 재현탁하였다.
성능/효과
- 1, 2및 3과 같다. 0.5 mM hydrogen peroxide에 대한 유산균의 저항성 결과, 1시간 반응 후 대부분 균들의 저해율은 10% 내외정도였으나, 반응 3시간 만에는 L. brevis GK55의 저해율이 12.2%로 가장 낮은 반면, L. mesenteroides GK104의 저해율은 42.4%로 가장 높았다. 또한 5시간 후에도 L.
- 가정에서 담궈 숙성시킨 갓김치 8종을 수집하여 Lactobacilli MRS agar 평판배지에 배양하여 전형적인 유산균으로 추정되는 균을 대상으로 생화학적 특성 및 당 발효능을 조사한 결과는 Table 1과 같다. GK20은 L형 lactic acid 생산, catalase 음성, lysine과 ornithine 가수분해 및 45℃ 하에서 증식하며 arabinose, ribose, mannose 및 raffinose 등을 분해하고 동정확률(ID) 99.9%를 나타내어 Lactobacillus acidophilus로 확인되었다. GK55는 D형 lactic acid 생산, catalase 양성, arginine 가수분해하고 혐기적 조건하에서 증식하지 못하고 xylose, maltose, melibiose 및 gluconate 등을 이용하여 Lactobacillus brevis (ID=97.
- GK81은 L형 lactic acid 생산, catalase 양성, ornithine 가수분해, 호기적 조건하에서만 증식하며 mannitol, α-Methyl-D-mannoside, melezitose 및 gentiobiose 등의 당을 분해하는 능력이 있으므로 L. plantarum (ID=99.9%)으로 확인되었다.
- 갓김치로부터 분리된 유산균 5종(Lactobacillus acidophilus GK20, Lactobacillus brevis GK55, Lactobacillus paracasei GK74, Lactobacillus plantarum GK81, 및 Leuconostoc mesenteroides GK104)의 활성산소종에 대한 저항성 및 항산화 활성을 조사하였다. Hydrogen peroxide (0.5 mM)와 반응 5시간 후 L. acidophilus GK20, L. brevis GK55, L. paracasei GK74 및 L. plantarum GK81들은 50% 이상의 생존율을 보였으며, superoxide anions에 의한 저해율은 L. acidophilus GK20와 L. paracasei GK74가 가장 낮았고, hydroxyl radical과의 반응에서는 L. paracasei GK74와 L. plantarum GK81이 가장 안정하였다. 한편, L.
- Hydroxyl radical에 대한 저항성을 조사한 결과, 반응 15분만에 L. acidophilus GK20, L. plantarum GK81 및 L. mesenteroides GK104들의 생균 감소율은 약 20-25% 정도로 이들 균주간에는 유의적인 차이가 없었으며, 이는 L. brevis GK55에 비해 유의적으로 다소 낮았다. 모든 유산균들은 반응시간이 경과함에 따라 저해율이 서서히 증가하는 경향을 나타내었는데, 반응 60분 후에는 L.
- ICFE의 경우에도 L. mesenteroides GK104에서 가장 낮은(18.0±0.5%) 반면, L. plantarum GK81의 소거 활성이 가장 높게 나타났으나(80.6±4.7%), 이는 BHA와 vitamin C의 활성과는 유의적인 차이가 있었다.
- IC에 의한 DPPH radical 소거능은 L. acidophilus GK20, L. brevis GK55 및 L. mesenteroides GK104들은 5% 유의수준에서 차이가 없이 다른 2종의 유산균에 비해 낮은 활성을 보인 반면, L. paracasei GK74의 소거능은 47.6±6.3%에 이르렀고, L. plantarum GK81은 실험 균주 중 가장 높은 소거능(70.8±10.1%)을 나타내었다.
- 유산균의 IC와 ICFE의 환원력 측정을 위해 700 nm에서 흡광도를 측정한 결과는 Table 4와 같다. IC에 의한 환원력은 L. acidophilus GK20와 L. mesenteroides GK104에 의해 가장 낮게 나타난 반면, L. plantarum GK81의 환원력은 가장 높게 나타났는데 이는 BHA와 vitamin C보다 유의적으로 더 높게 나타났으며, L. paracasei GK74의 환원력도 vitamin C와 비슷한 수준인 것으로 확인되었다. 한편, L.
- IC의 superoxide radical 소거능은 L. mesenteroides GK104에서 가장 낮은(19.9±1.3%) 반면, L. brevis GK55와 L. plantarum GK81은 각각 66.2±2.4%와 62.1±8.8%로 높은 활성을 나타내었다.
- -chelating 활성을 측정한 결과는 Table 5와 같다. L. acidophilus GK20과 L. plantarum GK81 IC의 Fe2+-chelating 활성은 약 20-23% 정도였으나, L. brevis GK55, L. paracasei GK74 및 L. mesenteroides GK104 IC는 30% 이상을 나타내었다. 한편 ICFE의 chelating 활성은 L.
- Paraquat는 확산을 통해 세포막을 통과하여 산소와 반응한 결과 superoxide anions을 생성하여 세포에 유해성분으로 작용한다(34). L. acidophilus GK20와 L. paracasei GK74의 저해 정도가 가장 낮았으며, 반면 L. mesenteroides GK104에 대한 저해환의 크기가 가장 크게 나타났으므로 superoxide anions에 대한 저항성도 균주의 종류에 따라 다소 차이가 있었다.
- paracasei GK74 IC의 환원력도 vitamin C와 비슷한 수준으로 나타났다. L. brevis GK55, L. paracasei GK74 및 L. mesenteroides GK104 IC의 Fe2+-chelating 활성은 30% 이상이었고, L. plantarum GK81의 ICFE는 45% 이상의 활성을 나타내었다. 따라서 실험 균주 중 L.
- plantarum GK81의 ICFE는 45% 이상의 활성을 나타내었다. 따라서 실험 균주 중 L. plantarum GK81은 다른 균들에 비해 ROS에 대해 비교적 안정하고, 항산화 활성도 가장 높은 것으로 확인되었다.
- 4%로 가장 높았다. 또한 5시간 후에도 L. brevis GK55의 생존율은 83.6%로 가장 높았고, 그 다음으로 L. acidophilus GK20, L. paracasei GK74 및 L. plantarum GK81도 50% 이상의 생존율을 보여 비교적 안정하였으나, L. mesenteroides GK104의 생존율은 약 30.1%에 불과하여 실험 균주들 중 가장 낮은 저항성을 나타내었다. 일반적으로 유산균은 catalase 음성 반응을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 본 실험에 사용된 L.
- plantarum GK81의 ICFE 환원력도 실험 균주 중 가장 높았으며, 양성 대조구 보다도 유의적으로 높았다. 또한 L. acidophilus GK20, L. paracasei GK74 및 L. plantarum GK81들의 환원력은 IC보다 ICFE에서 더 높았으나, L. brevis GK55와 L. mesenteroides GK104는 IC에서 좀 더 높은 환원력을 나타내었다.
- 1%)을 나타내었는데, 세포(IC)보다는 세포추출물(ICFE)의 활성이 더 높았다. 또한 L. plantarum GK81의 ICFE는 다른 균주들에 비해 높은 superoxide radical 소거능을 보였고, 이 균주의 IC와 ICFE에 의한 환원력은 BHA 와 vitamin C보다 유의적으로 더 높게 나타났으며, L. paracasei GK74 IC의 환원력도 vitamin C와 비슷한 수준으로 나타났다. L.
- plantarum GK81에서 나타났는데 이들의 소거 활성은 BHA와 vitamin C와 유의적인 차이가 없을 정도로 높게 나타났다. 또한 동일한 균주의 IC와 ICFE들간의 활성을 비교한 결과, GK20, GK74 및 GK81은 ICFE에서 더 높은 활성을 보인 반면, GK55와 GK104의 경우는 IC에서 더 높은 소거능을 나타내었다.
- brevis GK55에 비해 유의적으로 다소 낮았다. 모든 유산균들은 반응시간이 경과함에 따라 저해율이 서서히 증가하는 경향을 나타내었는데, 반응 60분 후에는 L. acidophilus GK20, L. brevis GK55 및 L. mesenteroides GK104는 95% 이상의 높은 사멸율을 보인 반면, L. paracasei GK74는 약 24.4%, L. plantarum GK81는약 33.7% 정도 생존한 것으로 나타났다.
- 이상의 결과에서 미루어볼 때, 갓김치에서 분리된 5종의 유산균 모두 radical 소거능, 환원력 및 금속이온 chelating 활성을 가지고 있는 것으로 확인되었으나, 항산화력의 크기는 균주의 종류에 따라 다소 차이가 있었으며, 실험 균주 중 L. plantarum GK81은 다른 균주에 비해 ROS에 대한 저항성이 크고, radical 소거능 및 환원력이 크므로 이를 이용한 지방 산화 방지제 혹은 노화 억제제로서의 개발 가치가 있는 것으로 판단된다.
- 1%에 불과하여 실험 균주들 중 가장 낮은 저항성을 나타내었다. 일반적으로 유산균은 catalase 음성 반응을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 본 실험에 사용된 L. brevis GK55와 L. plantarum GK81는 특이하게 catalase 를 생성하는 것으로 확인되었으며, 이들이 H2O2에 대한 저항성이 높은 것은 catalase 생성 능력에 기인하는 것으로 추정된다.
- plantarum GK81은 45% 이상의 활성을 나타내었다. 하지만 실험 균주 모두 양성대조구인 EDTA에 비해 Fe2+-chelating 활성은 유의적으로 낮은 수준이었다.
- mesenteroides GK104 IC는 30% 이상을 나타내었다. 한편 ICFE의 chelating 활성은 L. acidophilus GK20, L. paracasei GK74 및 L. mesenteroides GK104는 모두 20% 이상이었으며, L. plantarum GK81은 45% 이상의 활성을 나타내었다. 하지만 실험 균주 모두 양성대조구인 EDTA에 비해 Fe2+-chelating 활성은 유의적으로 낮은 수준이었다.
- 하지만 이들의 활성은 양성 대조구인 BHA나 vitamin C보다는 낮은 수준이었다. 한편, ICFE의 소거 능을 측정한 결과, 가장 낮은 소거능은 L. brevis GK55와 L. mesenteroides GK104에서 나타났고, 가장 높은 소거능은 L. plantarum GK81에서 나타났는데 이들의 소거 활성은 BHA와 vitamin C와 유의적인 차이가 없을 정도로 높게 나타났다. 또한 동일한 균주의 IC와 ICFE들간의 활성을 비교한 결과, GK20, GK74 및 GK81은 ICFE에서 더 높은 활성을 보인 반면, GK55와 GK104의 경우는 IC에서 더 높은 소거능을 나타내었다.
- 한편, L. plantarum GK81는 실험 균주 중 가장 높은 DPPH 소거능(70.8±10.1%)을 나타내었는데, 세포(IC)보다는 세포추출물(ICFE)의 활성이 더 높았다.
- paracasei GK74의 환원력도 vitamin C와 비슷한 수준인 것으로 확인되었다. 한편, L. plantarum GK81의 ICFE 환원력도 실험 균주 중 가장 높았으며, 양성 대조구 보다도 유의적으로 높았다. 또한 L.
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