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문제 정의
- 3%가 함유되어 있기 때문에 단백질 함량이 높게 나왔다고 판단된다. 단백질 정량은 항산화 측정 시에 각각의 배지에 단백질 함량을 동일하게 맞추어 기준을 세우기 위하여 실시하였다. 배지별로 가장 낮은 단백질 함량을 가지고 있는 유산균을 기준으로 MRS 배지는 450 μg/mL, M17 배지는 193 μg/mL, 10% 탈지분유는 395μg/mL로 단백질의 함량을 조정하였다.
제안 방법
- Chromosomal DNA를 분리한 후, 16S rDNA를 증폭하기 위해 forward primer(341f): (5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CGA CAG-3')와 reverse primer(534r): (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')를 사용하였다.
- 8% agarose gel로 전기영동을 실시하여 확인하였으며, PCR product purification kit(Intron, Korea)를 사용하여 정제하였다. DNA 염기서열은 ABI 3730xl 자동 염기서열 분석기를 이용하였으며, 분석결과는 NCBI blast(www.ncbi.nih.gov/blast/)의 database를 이용하여 조사하였다.
- PCR premix(Bioneer, Cat No. K-2012)에 증류수 17 μL, forward primer 1 μL, reverse primer 1 μL, DNA 1 μL를 첨가하여 혼합한 후 PCR을 수행하였다.
- PCR 조건은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃에서 1분, 62℃에서 40초, 72℃에서 40초로 30 cycles을 반복하였으며, 72℃에서 40초로 반응을 종료하였다. PCR 반응산물을 0.8% agarose gel로 전기영동을 실시하여 확인하였으며, PCR product purification kit(Intron, Korea)를 사용하여 정제하였다. DNA 염기서열은 ABI 3730xl 자동 염기서열 분석기를 이용하였으며, 분석결과는 NCBI blast(www.
- 유산균의 단백질 정량은 Bradford 방법을 사용하였으며, bovine serum albumin(BSA; Bio-Rad, USA)을 표준물질로 하여 standard curve를 작성하였다. Protein assay(Bio-Rad)는 증류수로 5배 희석해서 사용하였고, 각 유산균의 상등액과 희석한 protein assay의 비율을 1:20으로 혼합하여 5분 후에 흡광도 595 nm에서 측정하였다.
- 균주의 보존을 위하여 모든 유산균은 MRS broth에 2차 계대 배양한 후, 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포 침전물을 얻었으며, 여기에 10% 탈지분유, 0.5% dextrose(Difco), 0.25% yeast extract(Difco)가 각각 함유된 배지를 제조하여 혼합하였다. 이것을 동결 건조시켜 －70℃에 보관하였다.
- 배지별로 가장 낮은 단백질 함량을 가지고 있는 유산균을 기준으로 MRS 배지는 450 μg/mL, M17 배지는 193 μg/mL, 10% 탈지분유는 395μg/mL로 단백질의 함량을 조정하였다.
- API 방법은 BCP 배지의 고유색인 보라색이 유산균과 당이 반응하여 산을 생성하면서 노란색으로 탈색되는 점을 평가하여 동정하는 방법이다. 유산균 23종에 대한 49종 탄수화물의 발효성을 분석하였고, 이 결과는 동정용 프로그램인 http://apiweb.biomerieux.com에 접속하여 해석하였으며, 그 결과를 Table 1에 나타내었다.
- 유산균의 당 발효성 실험을 하기 위하여 API 50 CH kit(Biomerieux, France)를 사용하였다. 유산균 23종을 MRS broth에 37℃, 18시간 배양한 다음 MRS agar에 도말하였다. 동일한 집락을 여러 개 취해서 bromo cresol purple 배지에 취한 후, 2 McFarland로 탁도를 맞춘 다음 접종하여 37℃에서 48시간동안 배양하여 색을 판정하였다.
- 항산화 활성을 측정하기 위해 23종의 유산균을 MRS 배지, M17 배지, 10% 탈지분유에 각각 유산균을 2차 계대 배양하여 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후, 상등액으로 실험하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 23종의 유산균은 김치, 유아 분변, 유제품 등에서 분리하여 MRS agar(Difco, USA)에 도말평판법으로 도말하고 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양 후 노란색 집락을 띄는 균주들을 선택하여 순수 분리하였다.
이론/모형
- ABTS 라디칼 소거능은 Roberta 등(1999) 및 Ken과 Ann(2001)의 방법에 준하여 실험하였다. ABTS 라디칼을 조제하기 위해 7.
- 유산균의 단백질을 정량하는 방법으로 가장 많이 사용하는 방법은 Bradford 방법과 Lowry 방법이 있다. Lowry 방법은 절차가 복잡하고 다른 화합물에 의해 간섭을 많이 받는 단점이 있기 때문에 본 실험에서는 Bradford 방법을 이용하여 단백질 정량을 측정하였다. Bradford 방법은 아미노산의 일종인 아르기닌, 히스티딘, 리신, 타이로신, 트립토판, 페닐알라닌 같은 잔기가 Coomassie brilliant blue G-250(CBB)에 결합할 때 흡광도의 변화에 의거하여 측정하는 방법으로 정량시간이 매우 빠르고 간단하다는 장점을 가지고 있다(Bradford, 1976; Compton & Jones, 1985).
- SOD 유사 활성 측정은 Marklund 등(1974)의 방법을 참조하여 측정하였다. Buffer는 50 mM tris buffer(pH 8.
- 유산균의 단백질 정량은 Bradford 방법을 사용하였으며, bovine serum albumin(BSA; Bio-Rad, USA)을 표준물질로 하여 standard curve를 작성하였다. Protein assay(Bio-Rad)는 증류수로 5배 희석해서 사용하였고, 각 유산균의 상등액과 희석한 protein assay의 비율을 1:20으로 혼합하여 5분 후에 흡광도 595 nm에서 측정하였다.
- 유산균의 동정은 NCBI에서 개발한 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)을 사용하였으며, 본 실험에서 사용된 유산균의 16S rDNA를 추출하여 동정한 결과는 Table 2와 같이 나타내었다.
- 유산균의 신속한 동정 방법인 API 50 CH kit(Biomerieux, France)를 이용하여 당 발효성을 분석하였다. API 방법은 BCP 배지의 고유색인 보라색이 유산균과 당이 반응하여 산을 생성하면서 노란색으로 탈색되는 점을 평가하여 동정하는 방법이다.
성능/효과
- plantarum으로 동정되었다. A-16, A-22 균주는 당 발효성에서는 Lactococcus로 동정되었지만, DNA 염기서열에서는 E. durans로 동정되었다. A-17 균주는 L.
- durans로 동정되었다. A-17 균주는 L. paracasei로 동정되었지만 DNA 염기서열 동정 결과는 L. plantarum으로 나타났다. 이처럼 5종류의 유산균에서 서로 다른 균종이 동정되어 이에 대한 추가 실험이 필요하다고 판단되었다.
- 평균적으로 MRS 배지는 74%, 10% 탈지분유는 9% 정도의 소거능을 보였다. ABTS 라디칼 소거능이 가장 높은 균주는 M17 배지에서 배양한 A-8 균주가 99%로 가장 높았으며, 같은 배지에서 배양한 A-7, A-13 균주가 각각 98%로 높은 활성을 나타내었다.
- ABTS 라디칼 소거능 방법에서 ascorbic acid가 standard 물질로서 뛰어난 물질이라고 보고한 Mathew와 Abraham(2006)의 연구와는 다르게 나타났다. MRS 배지와 M17 배지에서 배양한 23종류의 균주 모두 대조구보다 높은 소거능을 보였으며, 특히, M17 배지에서 배양한 유산균은 평균 93% 정도의 높은 소거능을 나타내었다. 평균적으로 MRS 배지는 74%, 10% 탈지분유는 9% 정도의 소거능을 보였다.
- 16S rDNA 염기 서열에 의한 동정은 유전자 수준에서 정확한 동정법이라 알려져 있다. 그러나 본 실험에서 유산균의 형태와 16S rDNA sequencing의 동정 결과는 일치하였으나, 당 발효성에 의한 동정 결과와는 상이하게 나타났다. A-9, A-10 균주는 당 발효성에서는 L.
- 당 발효성에서 A-2, A-4, A-5, A-6, A-11 균주는 당 발효성에 의한 동정 결과, L. plantarum으로 간균으로 동정되었지만, 현미경으로 관찰한 결과는 구균 모양으로 서로 일치하지 않았다. 하지만 16S rDNA 염기서열에 의한 동정 결과는 E.
- 5～7에 나타내었다. 대조구는 27%로 다른 항산화 실험에 비해 낮게 평가되어 ascorbic acid가 ABTS 라디칼 소거 능력은 떨어진다고 판단된다. ABTS 라디칼 소거능 방법에서 ascorbic acid가 standard 물질로서 뛰어난 물질이라고 보고한 Mathew와 Abraham(2006)의 연구와는 다르게 나타났다.
- 이 외에도 MRS 배지에서 배양한 A-12 균주가 82%, M17 배지에서 배양한 A-15 균주가 81%로 높은 유사활성을 보였다. 대조구의 SOD 유사 활성은 61%로 유산균은 이보다 높게 측정된 것으로 보아 23종의 유산균은 SOD 유사 활성이 있다고 사료된다.
- faecalis로 구균 모양의 유산균으로 동정이 되었고, 현미경으로 관찰한 결과와 그 형태가 일치하였다. 본 실험에서 유산균 동정 방법으로 사용한 16S rDNA 염기서열 결과는 60% 이상의 DNA 상동성을 갖는 균군을 동일 균종으로 결정한다는 Jonson(1986)의 보고와 DNA 비교는 미생물의 분류학상에 있어서 가장 신뢰성이 높은 판단 기준으로 사용되고 있다는 보고에 일치하였다. 본 실험에서는 유산균의 동정 결과와 현미경으로 검경한 결과를 바탕으로 당 발효성에 의한 동정보다 DNA 염기서열 동정 방법이 더 유의성이 있다고 판단할 수 있었다.
- 본 실험에서 유산균 동정 방법으로 사용한 16S rDNA 염기서열 결과는 60% 이상의 DNA 상동성을 갖는 균군을 동일 균종으로 결정한다는 Jonson(1986)의 보고와 DNA 비교는 미생물의 분류학상에 있어서 가장 신뢰성이 높은 판단 기준으로 사용되고 있다는 보고에 일치하였다. 본 실험에서는 유산균의 동정 결과와 현미경으로 검경한 결과를 바탕으로 당 발효성에 의한 동정보다 DNA 염기서열 동정 방법이 더 유의성이 있다고 판단할 수 있었다.
- 2～4에 나타내었다. 실험 결과, 배지별로 단백질의 농도는 달랐으며, M17 배지에서 단백질농도가 가장 낮았으며, 10% 탈지분유에서 가장 높은 단백질 농도를 보였다. 10% 탈지분유의 영양성분을 보면 탈지분유 자체에 단백질이 58.
- MRS 배지, M17 배지, 10% 탈지분유 별로 비교했을 때 다른 항산화 실험에서는 10% 탈지분유의 활성이 월등히 떨어졌으나, SOD 유사활성 실험에서는 다른 배지보다 활성이 떨어지긴 하지만 큰 차이가 나타나지 않았다. 유산균별로 비교해 보았을 때는 SOD 유사활성이 몇몇 균주가 월등하기 보다는 23종의 유산균이 모두유사하게 측정되었다. 이는 실험 방법마다 사용되는 시료나 원리가 다르고, 유산균마다 반응하는 물질이 같을 수 없기 때문이라고 판단되어진다.
- 평균적으로는 M17 배지가 78%로 SOD 유사활성이 가장 높았으나, 가장 높은 활성을 보인 균주는 MRS 배지에서 배양한 A-13 균주로 86%의 활성을 보였다. 이 외에도 MRS 배지에서 배양한 A-12 균주가 82%, M17 배지에서 배양한 A-15 균주가 81%로 높은 유사활성을 보였다. 대조구의 SOD 유사 활성은 61%로 유산균은 이보다 높게 측정된 것으로 보아 23종의 유산균은 SOD 유사 활성이 있다고 사료된다.
- MRS 배지와 M17 배지에서 배양한 23종류의 균주 모두 대조구보다 높은 소거능을 보였으며, 특히, M17 배지에서 배양한 유산균은 평균 93% 정도의 높은 소거능을 나타내었다. 평균적으로 MRS 배지는 74%, 10% 탈지분유는 9% 정도의 소거능을 보였다. ABTS 라디칼 소거능이 가장 높은 균주는 M17 배지에서 배양한 A-8 균주가 99%로 가장 높았으며, 같은 배지에서 배양한 A-7, A-13 균주가 각각 98%로 높은 활성을 나타내었다.
- 이는 실험 방법마다 사용되는 시료나 원리가 다르고, 유산균마다 반응하는 물질이 같을 수 없기 때문이라고 판단되어진다. 평균적으로는 M17 배지가 78%로 SOD 유사활성이 가장 높았으나, 가장 높은 활성을 보인 균주는 MRS 배지에서 배양한 A-13 균주로 86%의 활성을 보였다. 이 외에도 MRS 배지에서 배양한 A-12 균주가 82%, M17 배지에서 배양한 A-15 균주가 81%로 높은 유사활성을 보였다.
- plantarum으로 간균으로 동정되었지만, 현미경으로 관찰한 결과는 구균 모양으로 서로 일치하지 않았다. 하지만 16S rDNA 염기서열에 의한 동정 결과는 E. faecalis로 구균 모양의 유산균으로 동정이 되었고, 현미경으로 관찰한 결과와 그 형태가 일치하였다. 본 실험에서 유산균 동정 방법으로 사용한 16S rDNA 염기서열 결과는 60% 이상의 DNA 상동성을 갖는 균군을 동일 균종으로 결정한다는 Jonson(1986)의 보고와 DNA 비교는 미생물의 분류학상에 있어서 가장 신뢰성이 높은 판단 기준으로 사용되고 있다는 보고에 일치하였다.
후속연구
- plantarum으로 나타났다. 이처럼 5종류의 유산균에서 서로 다른 균종이 동정되어 이에 대한 추가 실험이 필요하다고 판단되었다.
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