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문제 정의
- 따라서 본 연구에서 세포 또는 생체 내에서 단당스핑고지질 함량변화와 세포증식, 세포사 및 세포변이와의 상관관계 규명을 통한 사람에게서 발생하는 질병 예방 및 치료 예후에 대한 예측에 응용하고자 단당세라마이드의 HPLC에 의한 새로운 분석 방법을 개발 하였다.
제안 방법
- 동물실의 온도(23±2℃), 습도(50±10%) 및 명암주기(12시간)는 자동 조절되도록 하였다.
- 단당세라마이드인 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드 표준물질 원액을 에탄올로 희석하여 1, 10 및 20 µM를 조제하였다.
- 역상컬럼(4 µm, 100 mm×8 mm)으로 충진 된 Radial-pak cartridge으로 구성되었다. 형광검출기(Shimadzu RF-10XL)의 조건은 여기파장 340 nm와 방출파장 455nm 이며, 메탄올/ 증류수/ triethylamine(92 : 8 : 0.1, v/v/v)로 조성된 이동상을 사용하여1 ml/min 속도 조건에서 단당세라마이드를 분리하였다. HPLC 크로마토그램은 Borwin system manager software(JMBS, France)를 사용하여 분석하였다.
- 유효성 검증을 위한 항목으로서 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도 및 회수율 구하였다. 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드 표준물질의 희석액을 사용하여 피이크의 시그널 대 노이즈의 비율이 3일 경우를 최소검출농도 규정하였으며, 최소정량농도는 시그널 대 노이즈의 비율이 10인 경우로 규정하였다.
- 유효성 검증을 위한 항목으로서 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도 및 회수율 구하였다. 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드 표준물질의 희석액을 사용하여 피이크의 시그널 대 노이즈의 비율이 3일 경우를 최소검출농도 규정하였으며, 최소정량농도는 시그널 대 노이즈의 비율이 10인 경우로 규정하였다. 단당세라마이드인 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드 표준물질 원액을 에탄올로 희석하여 1, 10 및 20 µM를 조제하였다.
- 단당세라마이드인 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드 표준물질 원액을 에탄올로 희석하여 1, 10 및 20 µM를 조제하였다. 단당세라마이드 분석에 대한 재현성을 확인하기 위하여 실험일내 및 실험일간(4일) 표준편차와 변동계수를 구하였고, 첨가된 표준물질 농도에 대한 측정된 단당세라마이드 함량으로부터 회수율을 결정하였다.
- 생리활성을 나타내는 세라마이드, 세라마이드-1-인산, 스핑고신 및 디하이드로스핑고신은 단당세라마이드 함량분석에 영향을 미치지 않으며, 동일 시료로부터 세라마이드를 포함한 다른 종류의 스핑고지질의 함량도 분석이 가능할 것으로 사료된다. 기존의 추출물로부터 직접 HPLC를 사용하는 방법과 비교 시 지질추출물로부터 TLC 정제를 통하여 비특이적 피크가 없는 단당세라마이드의 HPLC 크로마토그램을 생성함으로써 정량의 정밀성을 증가시켰다.
- 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드 표준물질은 SCDase에 의한 탈아실화 반응에 의해 글루코실스핑고신과 갈락토실스핑고신으로 전환된다. 생성된 단당스핑고신의 아미노기와 OPA 시약의 화학반응에 의해 형광물질이 형성되었으며, HPLC에 의해 분석이 이루어졌다(Fig. 3A). 탈인산화 반응의 효율성은 기질인 단당세라마이드의 순도에 의해서 영향을 받으며, 본 분석법에서 사용한 TLC 정제과정 및 탈지 BSA에 의한 단당세라마이드의 용해도 증가는 SCDase의 효소반응에 최적 조건을 제공한다.
- 단당세라마이드 추출 효율의 최적조건을 확립하기 위하여 Folch 방법(CHCl3 : MeOH=2 : 1) 및 Bligh and Dyer 방법(CHCl3 : MeOH=2 : 1)에서 사용된 추출용매 와 에탄올을 사용하여 배양 세포 및 흰쥐 혈장으로부터 단당세라마이드의 추출 효율을 비교하였다.24,25) 지질추출 및 TLC로부터 단당세라마이드 용출과정에서 사용된 용매조건에서 단당세라마이드의 HPLC 피크면적은각 용매조성에 따라 유의성있는 차이를 보이지 않았다(Table II).
- 특히, 대부분의 생체시료에서 거의 검출되지 않는 디하이드로스핑고신을 내부표준물질로 사용함으로써 단당세라마이드의 함량 분석이 가능하였다. SW-620 세포와 흰쥐 혈장의 단당세라마이드 함량을 측정하였으며, 표준물질과 비교 시 동일한 머무름 시간에서 단당세라마이드 피이크를 확인하였다. 본 분석법을 활용함으로써 세포성장이나 개체발생, 바이러스에 의한 변형이나 발암과 같은 상태에 의해서 단당세라마이드의 생합성 변화를 모니터링함으로써 지질대사의 이해와 대사이상 관련 질환에 임상적으로 응용 할 수 있을 것으로 사료된다.
- 채혈 후 4℃에서 3,000×g로 10분간 원심분리 후 상등액을 취하여 혈장을 당스핑고지질 분석용 시료로 사용하였다.
- SW-620 세포와 흰쥐 혈장으로부터 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드의 함량분석을 수행하였다. SW-620 세포와 사람의 혈청시료에 대한 HPLC 크로마토그램에서 단당세라마이드(글루코실세라마이드 및 갈락토실세라마이드) 피크가 머무름 시간 9.
- 23) 본 분석법은 내부표준물질로 사용된 디하이드로스핑고신은 단당세라마이드로부터 탈아실화된 단당스핑고신과 같은 HPLC 크로마토그램에서 피크가 검출되므로 생체 내 함량분석에 대한 신뢰성이 높은 것으로 사료된다. 생체 내 단당세라마이드 함량은 내부표준 물질로 생체시료에 첨가한 디하이드로스핑고신(C18-base)의 피크면적으로부터 산출하였다. 내부표준물질을 사용하지 않은SW-620세포와 흰쥐 혈장을 분석한 HPLC크로마토그램에서 디하이드로스핑고신이 전혀 검출되지 않았다(Fig.
대상 데이터
- 글루코실세라마이드(glucosylceramide)와 갈락토실세라마이드(galactosylceramide)는 Avanti polar lipids, Inc.(Alabaster, AL, USA)에서 구입하였다. High-performance thin-layer chromatography silica-gel plate(HPTLC)와 메탄올 및 에탄올은 Merck사(Darmstadt, Germany)에서 구입하였으며, 클로르포름과 암모니아수는 Sigma Chemical Company(St.
- (Alabaster, AL, USA)에서 구입하였다. High-performance thin-layer chromatography silica-gel plate(HPTLC)와 메탄올 및 에탄올은 Merck사(Darmstadt, Germany)에서 구입하였으며, 클로르포름과 암모니아수는 Sigma Chemical Company(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. o-phthalaldehyde(OPA)는 Molecular Probes, Inc.
- (Eugene, OR, USA)에서 구입하였고, sphingolipid ceramide Ndeacylase(SCDase)는 Takara Bio, Inc.(Shiga, Japan)로부터 구입하였으며, 그 외 시약은 최상급 순도를 가진 것을 사용하였다.
- 직장암에서 유래된 SW-620세포는 ATCC로부터 구매하였으며(Manassas, VA, USA), 100 units/ml penicillin-streptomycin과 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 RPMI-1640배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다.
- 본 연구는 충북대학교 동물윤리위원회에서 실험계획서를 승인 받은 후 수행하였다. 5주령의 Sprague Dawley 흰쥐를 중앙실험 동물(Seoul, Korea)에서 공급받아 충북대학교 약학대학 동물실에서 약 1주일간 적응시켜 사용하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 동물실의 온도(23±2℃), 습도(50±10%) 및 명암주기(12시간)는 자동 조절되도록 하였다.
- 당스핑고지질 분석에 사용한 HPLC 시스템은 Shimadzu model LC-10AT pump, SIL-10AL auto sampler system과 Nova-pak C18 역상컬럼(4 µm, 100 mm×8 mm)으로 충진 된 Radial-pak cartridge으로 구성되었다.
- 24,25) 지질추출 및 TLC로부터 단당세라마이드 용출과정에서 사용된 용매조건에서 단당세라마이드의 HPLC 피크면적은각 용매조성에 따라 유의성있는 차이를 보이지 않았다(Table II). 따라서, 본 연구에서는 실험과정의 간편성을 위하여 지질 추출에서 에탄올을 사용하였고, TLC 점적 및 분리된 단당세라마이드의 실리카겔로 부터의 용출용매로서 메탄올을 사용하였다.
- 4). 내부표준물질은 천연에서 생성되지 않는 화학합성 단당세라마이드를 사용하는 것이 이상적이지만 현재 사용할 수 있는 내부표준물질이 없으므로 디하이드로스핑고신을 내부표준물질로 사용하였다. SW-620세포 및 흰쥐혈장의 단당세라마이드 함량은 141.
데이터처리
- 1, v/v/v)로 조성된 이동상을 사용하여1 ml/min 속도 조건에서 단당세라마이드를 분리하였다. HPLC 크로마토그램은 Borwin system manager software(JMBS, France)를 사용하여 분석하였다.
성능/효과
- p>스핑고지질은 동물, 식물, 효모 및 Sphingomonas를 포함하는 세균에서 광범위하게 생성된다.1) 생체 내 스핑고지질 대사는 신생합성, 전환 및 분해 과정으로 구성되며, 세포의 소포체에서 발생하는 스핑고지질 신생합성(de novo biosynthesis)은 아미노산인 세린(serine)과 지방산인 팔미테이트(palmitate)를 전구체로 하여 serine palmitoyltransferase의 작용에 의해 스핑고지질 모핵인 3-ketodihydrosphingosine이 생성된다.2,3) 이 물질은 환원되어 dihydrosphingosine이 되며, 지방산이 축합된 dihydroceramide가 생성되고, 이어서 이중결합이 포함된 sphingosine 골격구조를 가지고 있는ceramide로 전환된다.
- 23) 본 연구에서 생체 중 단당세라마이드 함량은 HP-TLC에 의한 물질 분리, SCDase에 의한 단당스핑고신 생성 및 HPLC 분석에 의해 결정되었다. 단당세라마이드인 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드 표준물질은 클로르포름 : 메탄올 : 2.5N 암모니아수(60 : 35 : 8, v/v/v)로 구성된 전개용매를 사용한 HP-TLC 분석에서 Rf 값이 0.79임을 확인할 수 있었다(Fig. 2A). 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드는 동일한 Rf 치를 가지므로 HP-TLC를 사용하여 두 이성질체의 분리가 불가능함을 알 수 있었다.
- 2A). 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드는 동일한 Rf 치를 가지므로 HP-TLC를 사용하여 두 이성질체의 분리가 불가능함을 알 수 있었다. 특히, TLC 조건에서 생체 내에서 생성되는 생리활성 스핑고지질인 스핑고신, 디하이드로스핑고신, 세라마이드 및 세라마이드-1-인산의 Rf 값은 TLC상에서 각각 0.
- 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드는 동일한 Rf 치를 가지므로 HP-TLC를 사용하여 두 이성질체의 분리가 불가능함을 알 수 있었다. 특히, TLC 조건에서 생체 내에서 생성되는 생리활성 스핑고지질인 스핑고신, 디하이드로스핑고신, 세라마이드 및 세라마이드-1-인산의 Rf 값은 TLC상에서 각각 0.80, 0.76, 0.21 및 0.97을 나타내었다(Fig. 2A). 따라서, TLC 크로마토그램에서 단당세라마이드는 세라마이드 및 세라마이드-1-인산과 분리되었으나 스핑고신 및 디하이드로스핑고신은단당세라마이드와 거의 동일한 Rf 값을 나타냈다.
- 2A). 따라서, TLC 크로마토그램에서 단당세라마이드는 세라마이드 및 세라마이드-1-인산과 분리되었으나 스핑고신 및 디하이드로스핑고신은단당세라마이드와 거의 동일한 Rf 값을 나타냈다. 그러나 역상컬럼을 사용한 HPLC분석 시 단당세라마이드는 스핑고신 및 디하이드로스핑고신과 뚜렷이 분리되었으며, 각각 머무름 시간은 9.
- 단당세라마이드인 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드의 표준물질을 각각 1, 10, 20 µM의 농도로 에탄올에 담아 실험일내 분석의 회수율을 측정한 결과 20 µM 농도의 글루코실세라마이드 시료에서 90.5~131.8%의 범위를 가졌으며, 평균 값은 113.8%였다.
- 실험일간 분석의 표준편차와 변동 계수 값은 20 µM 의 글루코실세라마이드에서 각각 0.3%와 1.3% 였으며, 20 µM 농도의 갈락토실세라마이드에서는 각각 1.0%와 5.1%로 나타났다(Table I)
- 실험일간 분석의 회수율을 측정한 결과는 20 µM 의 글루코실세라마이드 시료에서 평균 값은 88.8%로서 79.1~112.9%의 범위를 가졌으며 20 µM 농도의 갈락토실세라마이드 시료에서는 82.8~134.8%의 범위의 회수율이 측정되었으며, 평균 값은 124.0%로 나타났다.
- 실험일내 분석의 정밀도에 대한 표준편차(SD)와 변동계수(CV) 값은 20 µM 의 글루코실세라마이드에서 각각 0.7%와 3.5%였으며, 20 µM 농도의 갈락토실세라마이드에서는 각각 1.2%와 6.0%로 나타났다.
- 3A). 탈인산화 반응의 효율성은 기질인 단당세라마이드의 순도에 의해서 영향을 받으며, 본 분석법에서 사용한 TLC 정제과정 및 탈지 BSA에 의한 단당세라마이드의 용해도 증가는 SCDase의 효소반응에 최적 조건을 제공한다. 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드는 9.
- 7분의 머무름 시간(retention time)에서 피크가 나타났다. 이 결과로 부터 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드의 입체구조적인 차이에 의한 분리가 이루어지지 않음을 확인하였다(Fig 3B). 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드의 최소검출농도는 두 물질 모두 약 0.
- 이 결과로 부터 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드의 입체구조적인 차이에 의한 분리가 이루어지지 않음을 확인하였다(Fig 3B). 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드의 최소검출농도는 두 물질 모두 약 0.1 pmol(S/N=3)이고, 최소정량농도는 1 pmol(S/N=10)을 나타내었다.
- 따라서 두 종류의 단당세라마이드는 분리되지 않고 단일피크로 나타나며, 이 피크는 측정된 생체시료의 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드 총량을 나타내고 있음을 의미한다. 특히, 대부분의 생체시료에서 거의 검출되지 않는 디하이드로스핑고신을 내부표준물질로 사용함으로써 단당세라마이드의 함량 분석이 가능하였다. SW-620 세포와 흰쥐 혈장의 단당세라마이드 함량을 측정하였으며, 표준물질과 비교 시 동일한 머무름 시간에서 단당세라마이드 피이크를 확인하였다.
- 최근에 보고된 SCDase를 사용한 단당세라마이드의 분석법에서 내부표준물질로 사용된 C6-NBD-GlcCer가 시료로부터 추출된 단당세라마이드와 동일한 크로마토크램에서 피크를 검출할 수 없는 단점이 있다.23) 본 분석법은 내부표준물질로 사용된 디하이드로스핑고신은 단당세라마이드로부터 탈아실화된 단당스핑고신과 같은 HPLC 크로마토그램에서 피크가 검출되므로 생체 내 함량분석에 대한 신뢰성이 높은 것으로 사료된다. 생체 내 단당세라마이드 함량은 내부표준 물질로 생체시료에 첨가한 디하이드로스핑고신(C18-base)의 피크면적으로부터 산출하였다.
- 값을 갖는 스핑고신은 HPLC분석에 의해서 머무름 시간이 다른 피크로 분리되었다. TLC 정제과정을 통하여 background가 깨끗한 HPLC크로마토그램이 얻어지며, 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드 피이크는 동일한 머무름 시간에서 용출되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 두 종류의 단당세라마이드는 분리되지 않고 단일피크로 나타나며, 이 피크는 측정된 생체시료의 글루코실세라마이드와 갈락토실세라마이드 총량을 나타내고 있음을 의미한다.
후속연구
- 22) 단당세라마이드를 탈아실화한 후 액상크로마토그라피에 의한 분석방법이 보고되어있으나 내부표준 물질로 사용된 C6-NBD-GlcCer이 분석하고자 하는 단당세라마이드와 동일하게 검출되지 않는 단점이 있다.23) 기존에 알려진 당스핑고지질 분석법은 Mass spectrometry나 NMR spectroscopy 등을 사용하므로 감도나 상세 세부구조를 분석할 수 있는 장점이 있으나, 분석기기의 구매 및 유지비용의 부담이 있으므로 일반 실험실에서 쉽게 사용이 어려우므로 생체 내 당스핑고지질을 용이하게 분석할 수 있는 새로운 분석법의 개발이 필요하다.
- 2B). 생리활성을 나타내는 세라마이드, 세라마이드-1-인산, 스핑고신 및 디하이드로스핑고신은 단당세라마이드 함량분석에 영향을 미치지 않으며, 동일 시료로부터 세라마이드를 포함한 다른 종류의 스핑고지질의 함량도 분석이 가능할 것으로 사료된다. 기존의 추출물로부터 직접 HPLC를 사용하는 방법과 비교 시 지질추출물로부터 TLC 정제를 통하여 비특이적 피크가 없는 단당세라마이드의 HPLC 크로마토그램을 생성함으로써 정량의 정밀성을 증가시켰다.
- SW-620 세포와 흰쥐 혈장의 단당세라마이드 함량을 측정하였으며, 표준물질과 비교 시 동일한 머무름 시간에서 단당세라마이드 피이크를 확인하였다. 본 분석법을 활용함으로써 세포성장이나 개체발생, 바이러스에 의한 변형이나 발암과 같은 상태에 의해서 단당세라마이드의 생합성 변화를 모니터링함으로써 지질대사의 이해와 대사이상 관련 질환에 임상적으로 응용 할 수 있을 것으로 사료된다.
- 2 µM을 나타낸다. 따라서, 본 분석방법은 배양세포와 혈장은 물론 동물 및 사람의 조직으로 시료의 분석 범위를 확대할 수 있으리라 생각되며, 단당세라마이드 함량분석을 통하여 생체 내 생리활성 기전 규명과 지질관련 질환의 중요한 생체 표지물질로 작용할 수 있는 가능성을 제시할 수 있다.
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