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문제 정의
- 이러한 문제에 대응하기 위하여 본 연구진은 해면동물 추출물에 대한 생리활성 및 성분프로파일 분석 데이터베이스를 구축하여 자원의 가치 평가 및 분석을 용이하게 하고, 불필요한 생물자원 소비를 줄여 해양생태계 보존 및 효율적인 해면동물자원연구를 가능하게 함으로서 해결점을 찾고자 하였다. 이를 위해 국립해양생물자원관으로부터 해면동물 추출물을 분양 받은 후 추출물의 기초생리활성과 high-performance liquid chromatography (HPLC) 분석을 수행하였고, 이에 대한 결과를 보고하여 해면동물자원 연구데이터베이스를 구축하는 기초를 마련하고자 한다.
- 가능하게 함으로서 해결점을 찾고자 하였다. 이를 위해 국립해양생물자원관으로부터 해면동물 추출물을 분양 받은 후 추출물의 기초생리활성과 high-performance liquid chromatography (HPLC) 분석을 수행하였고, 이에 대한 결과를 보고하여 해면동물자원 연구데이터베이스를 구축하는 기초를 마련하고자 한다.
제안 방법
- HPLC 및 electrospray ionization mass spectrometry 분석은 Agilent Technologies 1200 series/Agilent 6120 Quadrupole LC/MS (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA) 을 사용하였고, 분석에 사용된 columne Luna C18(2) 5μm column 4.6×150mm (Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA) 를 사용하였다. 전처리 시료의 농축을 위하여 SpeedVac concentrator (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) 를 사용하였다.
- 55μg/mL 농도로 처리하여 2시간 후에 lipopolysaccharides (LPS from Escherichia coli 026:B6, Merck KGaA)를 1μg/mL 농도가 되도록 첨가하였고, 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 griess reagent (sulfanilamide 1% (w/v) in phosphoric acid 5% (v/v):N-(naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride 0.1% (w/v)=1:1)를 첨가하여 상등액과 반응하였고 Synergy HT multi-mode microplate reader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 남은 plate에 EZ-Cytox (DoGenBio.
- 배양한다. 배양된 세포에 화합물을 50, 16.6, 5.5μg/mL 농도로 처리하여 2시간 후에 glutamate (L-Glutamic acid monosodium salt hydrate, Merck KGaA)를 5mM 농도가 되도록 첨가하였다. 이후 세포 생존율이 50%가 되었을 때, InvitrogenTM Calcein, AM (Thermo Fisher Scientific)을 제공된 지침에 따라 처리하여 세포를 염색하였다.
- 시료를 모두 통과시킨 다음, 수분이 제거되도록 충분히 air-aspiration한 후 에탄올 2mL로 용출 시켜 염이 제거된 해면 추출물 시료를 조제하였다. 용출된 시료는 HPLC-MS 분석에 사용하였고, 또한 시료를 농축 후 DMSO (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 녹여 생리활성 탐색에 사용하였다.
- 시료를 모두 통과시킨 다음, 수분이 제거되도록 충분히 air-aspiration한 후 에탄올 2mL로 용출 시켜 염이 제거된 해면 추출물 시료를 조제하였다. 용출된 시료는 HPLC-MS 분석에 사용하였고, 또한 시료를 농축 후 DMSO (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 녹여 생리활성 탐색에 사용하였다.
- 각각 26, 18, 17, 17, 15점 씩 포함되었다. 이들의 활성 데이터를 수집하기 위해, mouse hippocampal neuronal cell line인 HT22를 이용하여 뇌신경 세포 보호 효능과, mouse macrophage cell line인 Raw264.7을 이용하여 항염증 효능을 분석하였다. HT22 세포는 산화적 스트레스에 의한 신경 세포사의 메커니즘을 연구하는 in vitro 모델로 사용되고 있으며, 세포사멸 억제 효과를 측정하여 뇌 질환 예방에 대한 유효 물질을 탐색할 수 있다[11].
- 1과 같이 Lipastrotethya 속은 시료별로 유사한 LC 패턴을 나타낸 반면 Dactylospongia 속과 Cinachyrella 속은 같은 속에서도 함유 성분이 다양하게 나뉘는 패턴을 보였다. 이와 같은 함유 성분의 차이를 이용하여 성분을 나타내는 HPLC 크로마토그램을 BioNumerics 소프트웨어를 이용하여 유사도에 따라 dendrogram 을 작성하였다(Fig. 2).
- 이후 세포 생존율이 50%가 되었을 때, InvitrogenTM Calcein, AM (Thermo Fisher Scientific)을 제공된 지침에 따라 처리하여 세포를 염색하였다. 이후 OperettaTM (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 염색된 세포를 계수하였다.
- , Winooski, VT, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 남은 plate에 EZ-Cytox (DoGenBio., Seoul, Korea)를 10μL씩 처리하여 30분간 37oC에서 반응하였고 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인하였다.
- 5μg/mL 농도로 처리하여 2시간 후에 glutamate (L-Glutamic acid monosodium salt hydrate, Merck KGaA)를 5mM 농도가 되도록 첨가하였다. 이후 세포 생존율이 50%가 되었을 때, InvitrogenTM Calcein, AM (Thermo Fisher Scientific)을 제공된 지침에 따라 처리하여 세포를 염색하였다. 이후 OperettaTM (PerkinElmer Inc.
- 7 cell 을 분주한 후 37oC, 5% CO2 조건에서 overnight 배양하였다. 이후 화합물을 50, 16.6, 5.55μg/mL 농도로 처리하여 2시간 후에 lipopolysaccharides (LPS from Escherichia coli 026:B6, Merck KGaA)를 1μg/mL 농도가 되도록 첨가하였고, 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 griess reagent (sulfanilamide 1% (w/v) in phosphoric acid 5% (v/v):N-(naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride 0.
- 전처리 된 시료는 20분간, 10-100% 아세토니트릴-물(v/v)의 기울기 용리를 이용하여 HPLC-MS 분석하였고, 각각 시료의 254 nm에서 측정한 크로마토그램을 스프레드시트로 변환하였다. 각 결과를 BioNumerics 7.
- [12]. 해면 추출물의 항염증 효능을 조사하기 위해 Raw264.7 cell line에 LPS를 처리하여 증가한 NO를 1/3 이하로 줄이면서 세포 생존은 70% 이상의 결과를 나타내는 시료를 조사하였다. 그 결과, 181개 해면 추출물 시료에서 14개가 위와 같은 효능을 보이는 것을 확인하였다(Table 2).
- 활성 분석 결과 같은 속에 속하는 시료 중에서 일부 시료만이 활성을 나타내었기에 같은 속의 해면에 함유 성분이 각기 다를 것으로 예상되어 HPLC 프로파일링을 통해 각기 다른 활성의 근거를 조사하였다. HPLC 프로파일별 분석결과 Fig.
대상 데이터
- LC-MS용을 사용하였다. 고체상 추출카트리지는 Waters (Milford, OH, USA)의 Sep-Pak Plus tC18 Environmental cartridge (900 mg)을 사용하였고 용출은 실린지를 이용하였다.
- 메탄올, 아세토니트릴, 물은 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)의 HPLC등급을, formic acid는 Thermo Fisher Scientific의 LC-MS용을 사용하였다. 고체상 추출카트리지는 Waters (Milford, OH, USA)의 Sep-Pak Plus tC18 Environmental cartridge (900 mg)을 사용하였고 용출은 실린지를 이용하였다.
- 본 연구진은 해면 추출물 181개의 신경세포보호 및 항염증 생리활성을 확인하였다. 일반적으로 해면 동물의 성분은 세포독성을 나타내는 경우가 많이 알려져 있고 세포 보호 기반의 생리활성은 많이 보고되지 않았으나 본 활성검증에서 181개 시료 중 9.
데이터처리
- 각 결과를 BioNumerics 7.5 소프트웨어(bioMérieux company, Marcy-l’Étoile, France)에서 유사도 분석을 실시하였고 distance 는 Pearson’s correlation로 계산하여 UPGMA 알고리즘을 이용하여 dendrogram을 생성하였다.
성능/효과
- 조사하였다. HPLC 프로파일별 분석결과 Fig. 1과 같이 Lipastrotethya 속은 시료별로 유사한 LC 패턴을 나타낸 반면 Dactylospongia 속과 Cinachyrella 속은 같은 속에서도 함유 성분이 다양하게 나뉘는 패턴을 보였다. 이와 같은 함유 성분의 차이를 이용하여 성분을 나타내는 HPLC 크로마토그램을 BioNumerics 소프트웨어를 이용하여 유사도에 따라 dendrogram 을 작성하였다(Fig.
- 7 cell line에 LPS를 처리하여 증가한 NO를 1/3 이하로 줄이면서 세포 생존은 70% 이상의 결과를 나타내는 시료를 조사하였다. 그 결과, 181개 해면 추출물 시료에서 14개가 위와 같은 효능을 보이는 것을 확인하였다(Table 2).
- 본 연구에 사용한 해면추출물은 모두 181종류로 Table 1과 같이 해면동물문에 포함되는 24개 속에 해당하며 Hyrtios 속, Coscinoderma 속, Cinachyrella 속, Hymeniacidon 속, Plakoris 속이 각각 26, 18, 17, 17, 15점 씩 포함되었다. 이들의 활성 데이터를 수집하기 위해, mouse hippocampal neuronal cell line인 HT22를 이용하여 뇌신경 세포 보호 효능과, mouse macrophage cell line인 Raw264.
- 확인하였다. 일반적으로 해면 동물의 성분은 세포독성을 나타내는 경우가 많이 알려져 있고 세포 보호 기반의 생리활성은 많이 보고되지 않았으나 본 활성검증에서 181개 시료 중 9.4% 시료가 뇌신경 세포 보호 효과를 보이고, 7.7%의 시료가 세포 독성은 낮으면서 항염증지표인 NO 생성은 저해하였다. 이는 추후에 해면동물에서의 활성 화합물 발굴 가능성을 시사하며, 기존의 세포독성 중심의 활성 물질 탐색에서 좀더 다양한 생리활성물질을 탐색할 수 있는 계기를 제시할 수 있을 것으로 기대한다.
- HT22 세포는 산화적 스트레스에 의한 신경 세포사의 메커니즘을 연구하는 in vitro 모델로 사용되고 있으며, 세포사멸 억제 효과를 측정하여 뇌 질환 예방에 대한 유효 물질을 탐색할 수 있다[11]. 해면 추출물의 신경세포 보호 효능을 조사하기 위해 HT22 세포를 glutamate로 산화스트레스를 유도 후에 해면 추출물을 처리하였으며, 그 결과, 181개 시료 중 17개 시료에서 양성대조군인 N-acetyl-L-cysteine 대비 70% 이상의 세포 보호 효과를 나타내었다(Table 2).
후속연구
- 본 연구에서는 단파장(254nm)에서의 HPLC 크로마토그램을 이용하여 유사도에 따른 분류를 실시하였고, 더 나아가 함유 성분을 가시화할 수 있는 NMR, MS 등의 분광학 자료를 다양하게 프로파일화한다면 분류가 어려운 해면동물의 동정에 도움이 될 수 있으며 좀 더 다양하고 효율적인 해면동물자원 연구를 수행 할 수 있을 것으로 판단한다.
- 함유 성분의 프로파일화가 필요하다. 실제 본 연구 결과 같은 속에 포함되는 해면 추출물 간 활성 차이가 크게 나타나고 HPLC 프로파일도 다른 경우가 확인되었는데, 이는 해면 자체의 함유 성분 뿐만 아니라 공생 미생물에 의해 생산되는 화합물의 차이도 있을 것으로 예상되어 해면 연구에서는 해면 공생 미생물을 함께 연구할 필요성을 제시한다.
- 7%의 시료가 세포 독성은 낮으면서 항염증지표인 NO 생성은 저해하였다. 이는 추후에 해면동물에서의 활성 화합물 발굴 가능성을 시사하며, 기존의 세포독성 중심의 활성 물질 탐색에서 좀더 다양한 생리활성물질을 탐색할 수 있는 계기를 제시할 수 있을 것으로 기대한다.
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