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문제 정의
- 균 도말배양 검사에서 S. aureus와 Proteus가 검출되었으나 S. aureus만이 다수로 검출되고 Proteus는 매우 미량으로 검출되어 S. aureus에 대한 항균효과만을 관찰하고자 하였다. Mueller-Hinton 배지(Asan Pharm.
- 이에 저자들은 감염된 흰 쥐의 전층피부 결손에 Betadine®을 soaking, topping하는 방법과 Iodosorb® 연고를 이용하여 창상치유 하는 방법으로 iodine의 드레싱 방법에 따른 창상치유 효과를 비교하고, 균주를 접종하고 배양한 배지에 드레싱 방법으로 부착하여 나타나는 억제대의 크기를 측정하는 방법으로 사용방법에 따른 항균효과에 대해 비교하고자 하였다.
가설 설정
- 창상에 나타나는 괴사 및 염증 정도를 -3부터 0까지 나누어 수치화하였으며, 정상피부의 괴사 및 염증 정도를 0으로 정하여 neutrophil과 같은 염증세포가 군락 형성이 없이 세포 형태로만 부분적으로 나타나면 -1, 군락이 뚜렷하지 않고 작은 군락 형태나 세포 형태로 혼재되고 있는 상태를 -2, 큰 군락을 이루고 있는 상태를 -3으로 하였다. 재상피화, 육아조직 증식 정도와 창상에 나타나는 괴사 및 염증 정도의 정량화된 수치를 합산한 값을 -3에서 6으로 범위를 정하였고 값이 클수록 창상치유 효과가 좋은 것으로 가정하였다.
제안 방법
- 99% 2.2.2-tribromoethanol (Purum®, Fluka, USA) 10 g을 tert-amyl alcohol (ReagentPlus®, Sigma-Aldrich, USA) 10 mL와 혼합한 것을 100%로 하여 phosphate buffered saline (PBS)를 혼합하여 5%로 희석한 후 0.006 mL/g의 용량으로 60마리의 쥐에게 복강 내 주사하여 마취를 한 후 쥐의 배부에 있는 털을 제거하였다.
- Mueller-Hinton 배지(Asan Pharm., Seoul, Korea)에 세균도말검사에서 Staphylococcus aureus(American Type Culture Collection No. 29213) 표준균주를 접종한 후 각 처치군을 드레싱 방법과 동일하게 S 처치군과 I 처치군은 0.5 × 0.5 cm 크기의 거즈에 베타딘 soaking 상태와 연고를 바른 상태로, T 처치군은 베타딘 한 방울을 배지에 묻히는 상태로, G 처치군은 0.5 × 0.5 cm 크기의 거즈를 배지에 붙여 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)의 권장방법대로 배양한 후 판독하였다(Fig. 1).
- 각 처치군은 같은 크기의 거즈를 형성한 후 S 처치군은 Betadine® 용액을 soaking하여 직접 창상에 부착하고, T 처치군은 soaking한 거즈로 창상에 Betadine® 용액만을 묻히고, I 처치군은 같은 크기의 거즈에 같은 정도로 연고를 발라 창상에 부착하고, 대조군은 거즈만을 창상에 부착하였다.
- 감염된 창상에 임상에서 일반적으로 사용되고 있는 Betadine®을 soaking, topping 하여 드레싱하는 방법과 cadexomer iodine 형태의 항균 연고인 Iodosorb®을 실험군으로 하여 항균처치를 하지 않은 대조군과 비교하는 방법으로 Iodine의 드레싱 방법에 따른 창상치유 효과 및 S. aureus가 도포된 배지를 이용하여 항균효과를 비교하였다.
- 기준 면적으로 1 × 1 cm 크기의 정사각형을 스캔하여 면적을 측정하였다.
- 1). 드레싱 제제의 항균력 판독은 24시간 후에 억제대의 크기로 비교하였다.
- 드레싱은 3일 간격으로 같은 방법으로 시행하였다. 실험을 시행한 쥐는 각각 cage 하나에 한마리씩 넣고 10일간 관찰하였으며 관찰기간 동안 사료(5L79, PMI Inc., St. Louis, USA) 및 물은 무제한으로 공급하였다.
- 재상피화, 육아조직 증식 정도, 창상에 나타나는 괴사 및 염증 정도를 정량화 한 수치로 창상치유 효과를 비교하였다. 일자 별 관찰 결과, 모든 기간에서 대조군에 비해 실험군 모두에서 뚜렷한 재상피화 및 육아조직 형성을 보였고 염증 세포 침윤이 감소되어 있는 것으로 나타났다(Fig.
- 정량화는 재상피화, 육아조직 증식 정도와 창상에 나타나는 괴사 및 염증 정도를 수치화하여 값을 합산하여 표시하였다. 재상피화, 육아조직 증식의 형성 정도를 각각 0부터 3까지 나누어 수치화하였는데 재상피화나 육아조직 증식이 전혀 형성되지 않은 경우를 0, 재상피화나 육아조직 증식이 형성되지 못한 결손부분이 2/3 이상이면 1, 1/3 - 2/3이면 2, 1/3 이하인 경우를 3으로 수치화하였다. 창상에 나타나는 괴사 및 염증 정도를 -3부터 0까지 나누어 수치화하였으며, 정상피부의 괴사 및 염증 정도를 0으로 정하여 neutrophil과 같은 염증세포가 군락 형성이 없이 세포 형태로만 부분적으로 나타나면 -1, 군락이 뚜렷하지 않고 작은 군락 형태나 세포 형태로 혼재되고 있는 상태를 -2, 큰 군락을 이루고 있는 상태를 -3으로 하였다.
- 저자들은 iodine의 창상치유 효과를 측정하기 위해 창상치유에 중요한 재상피화, 창상수축 및 항균효과를 측정하고자 하였으며 창상면적의 변화를 통해 창상수축 정도를, 창상조직 검사를 통해 재상피화, 육아조직형성 및 염증 감소 정도를, 배지검사를 통해 항균효과를 측정하였다. 국소항균제의 창상치유 효과를 측정할 때는 전층피부 결손 모델이 부분층피부 결손보다 더 적합하다는 보고5를 참고하여 감염된 창상을 형성하기 위해 마우스의 배부에 전층피부 결손을 형성한 후 24시간을 개방하였는데 S.
- 쥐의 배부(dorsal surface)에 있는 털을 제거하고 10% 베타딘 및 70% ethanol로 배부를 소독하고 1 × 1 cm 크기의 전층피부 결손창을 만든 후 개방된 상태로 24시간 노출시켜 감염을 유발하였다.
- 창상개방 24시간 후에 모든 쥐의 창상에서 균 도말배양 검사를 시행하여 동일하게 Staphylococcus aureus 균주가 다수(many), Proteus 균주가 매우 미량으로 검출되고 삼출물이나 가피가 형성된 육안적 소견으로 감염 여부를 확인한 후 각 15마리씩 결손 부위를 드레싱 방법에 따라 Betadine® soaking으로 처치한 S 처치군, Betadine® topping으로 처치한 T 처치군, Iodosorb®으로 처치한 I 처치군을 실험군으로 하였고 dry gauze만으로 처치한 G 처치군을 대조군으로 분류하였다.
- 재상피화, 육아조직 증식의 형성 정도를 각각 0부터 3까지 나누어 수치화하였는데 재상피화나 육아조직 증식이 전혀 형성되지 않은 경우를 0, 재상피화나 육아조직 증식이 형성되지 못한 결손부분이 2/3 이상이면 1, 1/3 - 2/3이면 2, 1/3 이하인 경우를 3으로 수치화하였다. 창상에 나타나는 괴사 및 염증 정도를 -3부터 0까지 나누어 수치화하였으며, 정상피부의 괴사 및 염증 정도를 0으로 정하여 neutrophil과 같은 염증세포가 군락 형성이 없이 세포 형태로만 부분적으로 나타나면 -1, 군락이 뚜렷하지 않고 작은 군락 형태나 세포 형태로 혼재되고 있는 상태를 -2, 큰 군락을 이루고 있는 상태를 -3으로 하였다. 재상피화, 육아조직 증식 정도와 창상에 나타나는 괴사 및 염증 정도의 정량화된 수치를 합산한 값을 -3에서 6으로 범위를 정하였고 값이 클수록 창상치유 효과가 좋은 것으로 가정하였다.
- 창상유발 후 4일째, 7일째와 10일째에 5마리씩 실험동물을 희생시켜 주변의 창상조직과 창상 전체가 포함되도록 조직을 채취하였다. 채취한 조직을 10% 포르말린 용액에 6시간 이상 고정한 후 Hematoxylin and eosin 염색을 시행하여 광학현미경 하에서 관찰하여 재상피화 정도, 육아조직 증식, 괴사 및 염증의 정도를 관찰하였다.
- 채취한 조직을 10% 포르말린 용액에 6시간 이상 고정한 후 Hematoxylin and eosin 염색을 시행하여 광학현미경 하에서 관찰하여 재상피화 정도, 육아조직 증식, 괴사 및 염증의 정도를 관찰하였다. 창상조직 검사 소견의 정도에 따라 정량화하여 비교하였다. 정량화는 재상피화, 육아조직 증식 정도와 창상에 나타나는 괴사 및 염증 정도를 수치화하여 값을 합산하여 표시하였다.
- 창상유발 후 4일째, 7일째와 10일째에 5마리씩 실험동물을 희생시켜 주변의 창상조직과 창상 전체가 포함되도록 조직을 채취하였다. 채취한 조직을 10% 포르말린 용액에 6시간 이상 고정한 후 Hematoxylin and eosin 염색을 시행하여 광학현미경 하에서 관찰하여 재상피화 정도, 육아조직 증식, 괴사 및 염증의 정도를 관찰하였다. 창상조직 검사 소견의 정도에 따라 정량화하여 비교하였다.
- 기준 면적으로 1 × 1 cm 크기의 정사각형을 스캔하여 면적을 측정하였다. 측정한 면적을 cm2로 환산한 후, 창상유발 1일째 면적을 100%로하고 백분율로 환산하여 면적의 변화를 비교하였다. 4일째에는 각 그룹별로 15마리씩, 7일째에는 10마리씩, 10일째에는 5마리씩이 대상이 되었다.
대상 데이터
- 측정한 면적을 cm2로 환산한 후, 창상유발 1일째 면적을 100%로하고 백분율로 환산하여 면적의 변화를 비교하였다. 4일째에는 각 그룹별로 15마리씩, 7일째에는 10마리씩, 10일째에는 5마리씩이 대상이 되었다.
- 생후 7주된 25 - 35g의 ICR (CrljBgi: CD1)계 흰 쥐 수컷 60마리를 생활조건을 같게 하여 사용하였고, 실험실에서 마우스용 사료와 물로 사육하여 일주일 간의 적응기간을 거친 후 실험을 시작하였다.
데이터처리
- 각 드레싱 방법에 따른 억제대 평균치의 차이는 통계적으로 유의하였다(One-way ANOVA, p < 0.000).
- 창상유발 후 4일째, 7일째와 10일째에 소독된 OHP 필름을 창상에 대고 창상의 경계를 따라 그린 후 스캔하여 영상 분석 프로그램인 Image Tool Version 2.01 Alpha 4(Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA)를 이용하여 창상의 면적을 측정하였다. 기준 면적으로 1 × 1 cm 크기의 정사각형을 스캔하여 면적을 측정하였다.
- 처치 종류별 항균효과에 대한 비교는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA test)을 시행하였고, 일별, 처치 종류별 창상면적 변화에 대한 비교는 이원배치 분산분석(two-way ANOVA test)을 시행하였다. 처치 종류에 따른 창상조직 검사결과는 대상자 수가 적어서 비모수 검정방법인 KruskalWallis test를 시행하였으며 유의 수준은 모두 5% 미만에 두었다.
- 처치 종류별 항균효과에 대한 비교는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA test)을 시행하였고, 일별, 처치 종류별 창상면적 변화에 대한 비교는 이원배치 분산분석(two-way ANOVA test)을 시행하였다. 처치 종류에 따른 창상조직 검사결과는 대상자 수가 적어서 비모수 검정방법인 KruskalWallis test를 시행하였으며 유의 수준은 모두 5% 미만에 두었다. 통계 분석 소프트웨어는 SPSS (SPSS for Windows 14.
이론/모형
- aureus in Mueller-Hinton agar with Betadine® soaking, Betadine® topping, Iodosorb® and gauze dressing. Antibacterial effect was evaluated by disc diffusion method. After 24 hours, additional restricted zone was examined along with edge of antibacterial dressing applied to Mueller-Hinton agar.
성능/효과
- 모든 실험군에서 억제대가 관찰되어 감수성이 있는 것으로 나타났다. 10개 배지에서 억제대 크기의 순위는 I, S, T, G 처치군의 순서로 모두 같았고, 억제대의 평균 크기는 I 처치군에서 가장 크게 나타나 베타딘 연고 드레싱 방법이 가장 항균력이 좋은 것으로 나타났다(Fig. 5). 각 드레싱 방법에 따른 억제대 평균치의 차이는 통계적으로 유의하였다(One-way ANOVA, p < 0.
- 000), 처치군들 간의 일자별 차이에 대한 사후분석결과 4일째에는 실험군인 S, T, I 처치군 끼리는 차이가 유의성이 없으나 순위는 S, I, T 처치군의 순으로 나타났고 대조군과는 유의한 차이를 보였으며, 7일 째에는 각 처치군별 창상면적 변화의 순위는 4일째와 변화가 없었으나, S 처치군과 대조군만 유의한 차이를 보였고 다른 실험군들과 대조군의 차이는 모두 유의성이 없는 것으로 나타났다. 10일째에는 처치군 별로 조사대상이 5마리씩으로 줄어들어 분산이 커지면서 통계적 유의성은 줄어들었으나 각 처치군별 창상면적 변화의 순위와 차이에 대한 통계적 유의성은 4일째와 변화가 없었으며, 실험군과 대조군은 유의한 차이를 보였다(Fig. 2).
- 4, 7, 10일째에 일자가 경과되면서 모든 처치군에서 창상치유 효과 점수가 증가하였고, 치유효과를 정량화한 수치를 비교한 결과 처치군 간에 유의한 차이가 있었다(Kruskal-Wallis test, p < 0.002).
- 9 저자들의 경우 Betadine® soaking 방법이 topping 방법보다 배지를 이용한 항균력 검사에서 더 효과적인 것으로 나타났으며 이것은 Betadine® topping 방법에 비해 soaking 방법이 창상의 삼출물에 의한 항균효과를 나타낼 수 있는 Betadine® 용액의 농도 감소가 더 느리므로 방출되는 유리 iodine의 정도가 더 많기 때문인 것으로 사료되며 유리 iodine이 물과 결합하여 H2OI+ 형태가 되었을 때도 항균효과를 나타낸다는 보고8가 있으므로 습윤상태를 오랫동안 유지할 수 있다는 것도 관련이 있을 것으로 사료된다.
- 각 처치군의 4, 7, 10일의 일자별 차이도 유의하였으나(two-way ANOVA, p < 0.000), 처치군들 간의 일자별 차이에 대한 사후분석결과 4일째에는 실험군인 S, T, I 처치군 끼리는 차이가 유의성이 없으나 순위는 S, I, T 처치군의 순으로 나타났고 대조군과는 유의한 차이를 보였으며, 7일 째에는 각 처치군별 창상면적 변화의 순위는 4일째와 변화가 없었으나, S 처치군과 대조군만 유의한 차이를 보였고 다른 실험군들과 대조군의 차이는 모두 유의성이 없는 것으로 나타났다.
- aureus 균주에 감염된 창상에 Betadine® soaking, topping 및 Iodosorb® 연고를 이용한 드레싱을 시행하였을 때 모두 창상치유 효과가 있는 것으로 나타났으며 Betadine® soaking 방법이 창상치유 효과가 가장 좋은 것으로 나타났다. 또한 배지를 이용한 in vitro 실험에서도 S. aureus 균주에 대해 모두 항균효과가 있는 것으로 나타났으며 Iodosorb® 연고가 항균효과가 가장 좋은 것으로 나타났다.
- 모든 실험군에서 억제대가 관찰되어 감수성이 있는 것으로 나타났다. 10개 배지에서 억제대 크기의 순위는 I, S, T, G 처치군의 순서로 모두 같았고, 억제대의 평균 크기는 I 처치군에서 가장 크게 나타나 베타딘 연고 드레싱 방법이 가장 항균력이 좋은 것으로 나타났다(Fig.
- 모든 처치군에서 시간이 지남에 따라 창상면적이 감소하는 양상을 보였고, 대조군인 G군에 비하여 실험군의 창상면적이 유의하게 빠르게 감소하였다(two-way ANOVA, p <0.000).
- 본 실험에서 Betadine®이나 Iodosorb®을 이용한 드레싱 방법이 감염된 창상치유 및 S. aureus 균주에 대한 항균효과가 있는 것으로 나타났으며 Betadine® soaking 방법이 topping이나 Iodosorb® 연고를 이용한 방법에 비해 창상치유 효과가 더 좋은 것으로 나타났다.
- 실험 결과 모든 실험군과 대조군에서 기간이 경과되면서 창상의 면적이 감소되는 양상으로 나타났으나 실험군들 간의 통계학적 유의성이 없는 것으로 나타났다. 창상면적의 변화로 창상수축에 대한 영향을 고려한다면 창상수축은 주로 섬유아세포에 의해 영향을 받으므로 실험군들 간에는 섬유아세포 및 창상수축에 대한 영향은 뚜렷한 차이를 보이지 않는다고 고려할 수 있으나 창상조직 검사 및 배지를 이용한 항균효과 모두 차이가 있으므로 창상면적 변화만 통계적 유의성이 없는 것은 창상이 완전히 치유될 때까지 관찰하지 못해 창상면적의 변화를 측정하는 기간이 짧았기 때문에 나타난 결과일 수 있다고 사료된다.
- 재상피화, 육아조직 증식 정도, 창상에 나타나는 괴사 및 염증 정도를 정량화 한 수치로 창상치유 효과를 비교하였다. 일자 별 관찰 결과, 모든 기간에서 대조군에 비해 실험군 모두에서 뚜렷한 재상피화 및 육아조직 형성을 보였고 염증 세포 침윤이 감소되어 있는 것으로 나타났다(Fig. 3). 4, 7, 10일째에 일자가 경과되면서 모든 처치군에서 창상치유 효과 점수가 증가하였고, 치유효과를 정량화한 수치를 비교한 결과 처치군 간에 유의한 차이가 있었다(Kruskal-Wallis test, p < 0.
- 저자들의 경우에는 Betadine® soaking과 topping 방법 모두 항균효과가 있으며 시간이 경과되었을 때 창상의 면적이 감소되었으며 조직 검사를 통한 창상치유 효과 측정에서도 대조군인 거즈를 이용한 드레싱 방법에 비해 재상피화가 더 촉진되고 창상치유에 효과적인 것으로 나타났다.
- 창상의 감염 예방 및 치료를 위해 많이 사용되고 있는 iodine의 창상치유 효과를 알아보기 위해 S. aureus 균주에 감염된 창상에 Betadine® soaking, topping 및 Iodosorb® 연고를 이용한 드레싱을 시행하였을 때 모두 창상치유 효과가 있는 것으로 나타났으며 Betadine® soaking 방법이 창상치유 효과가 가장 좋은 것으로 나타났다. 또한 배지를 이용한 in vitro 실험에서도 S.
- 002). 창상치유 효과는 모든 실험군이 대조군인 G군보다 좋았으며, 순위는 S, I, T, G 처치군의 순으로 나타났다(Fig. 4).
- 특히 Betadine® soaking 방법은 Iodosorb®과 Betadine® topping 방법에 비해 4일째부터 조직 검사 정량화 수치가 (+)로 나타나 창상치유 초기부터 염증에 비해 재상피화 및 육아조직 증식을 더 촉진시키는 경향이 있는 것으로 관찰되었다.
후속연구
- 그러나 Iodosorb®이 Betadine® soaking과 topping 방법에 비해 S. aureus 균주에 대한 항균효과가 더 좋음에도 불구하고 창상치유 효과는 더 떨어지는 양상으로 나타났는데 이것은 감염된 창상에서 균주의 감소를 창상에 대한 침습성 감소로 직접적인 관련성을 규정할 수 없다는 보고6를 고려할 필요가 있다고 사료되며 S. aureus 균주에 의해 감염된 창상치유에 대한 Iodosorb®의 영향은 좀 더 연구가 필요하다고 사료된다.
- aureus 균주에 대한 항균효과가 있는 것으로 나타났으며 Betadine® soaking 방법이 topping이나 Iodosorb® 연고를 이용한 방법에 비해 창상치유 효과가 더 좋은 것으로 나타났다. 그러나 임상에 직접적으로 적용하기 위해서는 창상에 사용되는 soaking, topping과 연고의 양이 실제 임상에서 사용되는 양과 차이가 있고 국소적인 창상의 크기, 상태 및 환자들의 전신적 상태 등과 같은 창상에 관련된 여러 조건들에 따라 차이가 있을 수 있으므로 좀 더 연구가 필요하다고 사료된다.
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