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문제 정의
- 본 연구에서는 전기방사를 이용하여 제작된 다층 PMMA/PVA bone plate의 생체적합성에 대해 알아보았다. 세포독성은 없는 것으로 판단되었으며, 초기부착은 대조군보다 느렸지만, 분화시킨 경우에는 대조군과 비슷한 부착과 분화양상을 나타냈다.
제안 방법
- L-929 섬유아세포에 제조된 고정판으로부터 제조된 다층 PMMA/PVA bone plate를 (37 ± 1)℃에서 72 ± 2시간 용출시킨 용출액을 50, 25, 12.5% 첨가하여 세포독성을 측정하였다.
- SEM에 의한 세포 분화를 관찰하기 위해 PMMA/PVA multilayer 고정판에 1.0 × 104 cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 부착 시킨 후, MG-63의 분화를 유도하기 위해 10 mM β-glycerophosphate와 50 µg/ml ascrobic acid를 첨가한 DMEM 배지로 교환해 주고 배양기에 2일, 7일, 14일 배양하였다.
- Scanning electron microscope (SEM)에 의한 세포 부착을 관찰하기 위해 다층 PMMA/PVA bone plate에 30분, 60분, 90분 동안 기른 MG-63 세포를 0.5% glutaraldehyde로 15분 동안 고정한 다음, 0.1M PB로 15분 동안 2회 수세한 후 50~100%의 에탄올로 탈수시켰다. 건조제로 hexamethyldislazene (Sigma)를 사용하였고, 준비된 시편은 백금 코팅한 후 FE-SEM (JSM-7401F)으로 관찰하였다.
- 1M PB로 15분 동안 2회 수세한 후 50~100%의 에탄올로 탈수시켰다. 건조제로 hexamethyldislazene (Sigma)를 사용하였고, 준비된 시편은 백금 코팅한 후 FE-SEM (JSM-7401F)으로 관찰하였다.
- 다층 PMMA/PVA bone plate가 유사체액 내에서 어떤변화가 있는지 관찰하였다. 유사체액에 담근 지 14일 부터 bone-like apatite의 생성이 확인되었다.
- 다층 PMMA/PVA bone plate의 용출액을 얻기 위해 (37 ± 1)℃에서 72 ± 2시간 용출하였으며, 용출 용매는 RPMI1640 배지를 사용하였다.
- 다층 PMMA/PVA bone plate의 표면 미세구조가 세포 부착에 어떤 영향을 미치는 지를 관찰하였다. 세포의 부착과 퍼짐을 비교 분석하기 위해 다층 PMMA/PVA bone plate와 세포의 부착 및 분화가 우수한 것으로 알려진 glass(대조군)에 MG-63세포를 배양한 후 시간에 따른 세포의 부착형태를 SEM으로 비교 관찰하였다.
- 다층 PMMA/PVA bone plate의 표면 미세구조가 세포의 분화에 어떤 영향을 미치는지를 관찰하였다. 다층 PMMA/PVA bone plate에서 기른 세포의 증식 양상을 보면 2일 째부터 세포가 넓게 펼쳐진 형태로 세포와 세포 사이에 결합이 잘 이루어 진 것을 확인하였다.
- 0 × 104 cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 부착 시킨 후, MG-63의 분화를 유도하기 위해 10 mM β-glycerophosphate와 50 µg/ml ascrobic acid를 첨가한 DMEM 배지로 교환해 주고 배양기에 2일, 7일, 14일 배양하였다. 배지는 2일마다 새 배지로 교환하면서 세포를 건강한 상태로 유지하였다. 준비된 시편은 백금 코팅한 후 FE-SEM (JSM-7401F)으로 관찰하였다.
- 본 연구에서는 PMMA와 PVA의 나노섬유를 얻기 위해 전기방사 하였으며, 나노섬유를 사용하여 고정판을 얻기 위해 열압착을 하였다. 이러한 방법으로 제조된 다층 PMMA/PVA bone plate의 생체적합성에 대한 연구를 위하여 MG-63 세포와 L-929 세포를 이용하였으며, 세포에 대한 독성평가, 세포의 부착, 생분해에 관한 연구를 수행하였다.
- 다층 PMMA/PVA bone plate의 표면 미세구조가 세포 부착에 어떤 영향을 미치는 지를 관찰하였다. 세포의 부착과 퍼짐을 비교 분석하기 위해 다층 PMMA/PVA bone plate와 세포의 부착 및 분화가 우수한 것으로 알려진 glass(대조군)에 MG-63세포를 배양한 후 시간에 따른 세포의 부착형태를 SEM으로 비교 관찰하였다.
- 그 후 1 ml의 DMSO를 넣어 형성된 formazan crystal을 완전히 용해 시켰다. 용해된 formazan 용액을 ELISA reader로 595 nm에서 흡광도를 측정한 후 용출액의 농도(%)에 대한 relative cell viability(%)를 구하였다.
- 유사체액에 다층 PMMA/PVA bone plate를 넣어준 후 1일, 7일, 14일, 21일 28일 후에 FE-SEM에 의한 표면관찰, EDS-SEM에 의한 bone-like apatite 형성 관찰, 유사 체액의 pH 및 이온(Ca, P)의 변화를 ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer, ELAN 6000)를 통하여 관찰하였다.
- 본 연구에서는 PMMA와 PVA의 나노섬유를 얻기 위해 전기방사 하였으며, 나노섬유를 사용하여 고정판을 얻기 위해 열압착을 하였다. 이러한 방법으로 제조된 다층 PMMA/PVA bone plate의 생체적합성에 대한 연구를 위하여 MG-63 세포와 L-929 세포를 이용하였으며, 세포에 대한 독성평가, 세포의 부착, 생분해에 관한 연구를 수행하였다.
- 적층 된 PMMA 매트와 PVA 매트를 열압착(T, Tm > T > Tg ; T : temperature, Tm : PMMA의 녹는 점, Tg : PMMA의 유리전이온도) 하였고, 즉시 실온으로 냉각시켜 다층 PMMA/PVA bone plate를 제작하였다(Fig. 3).
- 전기방사기기(EPS 200D, NanoNC, Korea)를 사용하여 PMMA와 PVA의 나노섬유 제작을 수행하였다(Fig. 1). PMMA 전기 방사를 위해 전압은 24 kV, 노즐 크기는 18 GA를 사용하였고, 노즐의 위치는 콜렉터로부터 10 cm 떨어진 곳에서 1.
- 5 ml/h의 속도로 방출하였다. 전기방사로 제작된 나노섬유매트를(Fig. 2.) 적층시켜 Multilyer 형태로 만들었다. 적층 된 PMMA 매트와 PVA 매트를 열압착(T, Tm > T > Tg ; T : temperature, Tm : PMMA의 녹는 점, Tg : PMMA의 유리전이온도) 하였고, 즉시 실온으로 냉각시켜 다층 PMMA/PVA bone plate를 제작하였다(Fig.
- 1M PB로 15분 동안 2회 수세한 후 50~100%의 에탄올로 탈수시켰다. 건조제로 hexamethyldislazene (Sigma)를 사용하였고, 준비된 시편은 백금 코팅한 후 FE-SEM (JSM-7401F)으로 관찰하였다.
대상 데이터
- , Duksan Pure Chemical Co, Ltd)를 20 wt%로 혼합하여 사용하였다. PVA는 SigmaAldrich Company에서 구입하였고, 용매로는 증류수를 12 wt%로 혼합하여 사용하였다.
- 본 연구에서는 전기방사를 위해 PMMA (MW > 110,000 g/mol)을 LG Chemical Company에서 구입하였고, 용매로는 Nitromethane (CH3NO2, Duksan Pure Chemical Co, Ltd)를 20 wt%로 혼합하여 사용하였다.
- 뼈모세포 유래인 MG-63 (KCLB 21427)세포는 DMEM (High glucose)배지, 세포 독성 평가에 흔히 사용되는 섬유아세포인 L-929 세포는 RPMI1640 배지에 각 각 열불 활성화를 시킨 10% 우혈청(FBS, #SH30088, Hyclone)과 항생제(antibiotic-antimycotic solution, #15240-062, Gibco) 1%를 포함시켜 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 배양기에서 증식시켜 사용하였다.
이론/모형
- 전기방사로 제조된 다층 PMMA/PVA bone plate의 세포독성 여부를 알아보기 위해 ISO 10993-5에 공시된 추출물 희석법(extract dilution method)에 의거하여 실험을 진행하였다. L-929 섬유아세포에 제조된 고정판으로부터 제조된 다층 PMMA/PVA bone plate를 (37 ± 1)℃에서 72 ± 2시간 용출시킨 용출액을 50, 25, 12.
성능/효과
- 30분 기른 MG-63의 부착을 비교해 보면 다층 PMMA/PVA bone plate에서 기른 세포는 초기 부착에 관여하는 filopodia와 lamellapodia를 관찰할 수 없었으나, 대조군의 경우에는 약간의 filopodia와 lamellapodia를 관찰할 수 있었다.19,20) 60분, 90분에는 세포가 넓게 펼쳐진 형태로 소재에 완전히 부착하였고, 특히 90분에는 본 연구에 사용된 소재가 세포의 초기 부착과 퍼짐 현상이 우수한 소재로 확인 되었다(Fig. 7).
- 시간 변화에 따른 부착 및 퍼짐 양상은 다소 차이를 보였다. 30분 기른 MG-63의 부착을 비교해 보면 다층 PMMA/PVA bone plate에서 기른 세포는 초기 부착에 관여하는 filopodia와 lamellapodia를 관찰할 수 없었으나, 대조군의 경우에는 약간의 filopodia와 lamellapodia를 관찰할 수 있었다.19,20) 60분, 90분에는 세포가 넓게 펼쳐진 형태로 소재에 완전히 부착하였고, 특히 90분에는 본 연구에 사용된 소재가 세포의 초기 부착과 퍼짐 현상이 우수한 소재로 확인 되었다(Fig.
- 유사체액에 담근 지 14일 부터 bone-like apatite의 생성이 확인되었다. SEM-EDS로 측정한 결과 Ca과 P가 관찰되었으며(Fig. 9), ICP-MS 측정 결과 Ca과 P 이온 농도가 14일 후부터 감소하는 것을 확인하였으며, pH의 변화는 거의 없는 것을 확인하였다(Fig. 10). 이는 Ca과 P 이온이 bone-like apatite 생성에 기여한 것으로 예측할 수 있고, 이런 결과는 본 소재를 골절된 뼈에 이식하였을 때 부착면에서 뼈모세포의 부착, 증식 및 분화에 도움을 주어 골재생에 긍정적인 역할을 할 것으로 생각된다.
- 다층 PMMA/PVA bone plate의 표면 미세구조가 세포의 분화에 어떤 영향을 미치는지를 관찰하였다. 다층 PMMA/PVA bone plate에서 기른 세포의 증식 양상을 보면 2일 째부터 세포가 넓게 펼쳐진 형태로 세포와 세포 사이에 결합이 잘 이루어 진 것을 확인하였다. 7일, 14일 기른 세포는 세포와 세포 사이에 결합이 이루어지면서 모든 고정판의 표면에 부착하여 성장하는 양상을 보였으며, 다층 PMMA/PVA bone plate에서 기른 MG-63의 증식 및 분화가 대조군과 거의 차이가 없는 것을 확인하였다(Fig.
- 5% 첨가하여 세포독성을 측정하였다. 대조군의 흡광도를 100%로 하여 농도별 흡광도를 비례적으로 측정한 결과, 78~91%의 생존률을 보여(Fig. 6), 본 연구에서 사용된 PMMA와 PVA는 세포독성이 낮으며 이는 다층 PMMA/PVA bone plate가 생체 내 이식되었을 때 독성과 면역반응이 낮을 것으로 생각된다.17,18)
- 4). 또한 인장강도 시험에서도 다층 PMMA/PVA bone plate가 가장 높은 것으로 확인되었다(Table 2) (Fig. 5).
- 세포독성은 없는 것으로 판단되었으며, 초기부착은 대조군보다 느렸지만, 분화시킨 경우에는 대조군과 비슷한 부착과 분화양상을 나타냈다. 유사체액에 담근 후 14일 만에 bone-like apatite가 형성되었으며 이는 생체 내 이식되었을 때 뼈모세포에 긍정적인 영향을 줄 것으로 기대된다. 또한 pH의 변화가 거의 없는 것으로 보아 생체 내 이식되었을 때 조직 손상 등의 영향을 주지 않을 것으로 생각된다.
- 10). 이는 Ca과 P 이온이 bone-like apatite 생성에 기여한 것으로 예측할 수 있고, 이런 결과는 본 소재를 골절된 뼈에 이식하였을 때 부착면에서 뼈모세포의 부착, 증식 및 분화에 도움을 주어 골재생에 긍정적인 역할을 할 것으로 생각된다.21) 유사체액에 담근 지 1일, 7일, 14일, 28일 후에 다층 PMMA/PVA bone plate의 표면을 SEM으로 관찰하였을 때 차이가 없었다(Fig.
- 제작 된 다층 PMMA/PVA bone plate는 micro-CT(Skyscan 1172) 촬영을 통해 2D 이미지를 얻은 뒤 bone plate내부 조직의 균일성과 치밀도를 관찰 하였는데 전 방향에서 내부조직이 매우 균일하고 치밀하게 제작되었음을 확인하였다(Fig. 4). 또한 인장강도 시험에서도 다층 PMMA/PVA bone plate가 가장 높은 것으로 확인되었다(Table 2) (Fig.
후속연구
- 또한 pH의 변화가 거의 없는 것으로 보아 생체 내 이식되었을 때 조직 손상 등의 영향을 주지 않을 것으로 생각된다. 따라서 추후 동물실험을 통해 다층 PMMA/ PVA bone plate의 시간경과에 따른 강도변화 및 생분해에 대한 연구를 추가한다면 생분해성 고분자 bone plate를 제작할 수 있을 것으로 기대된다.
- 여러 우수한 특성을 갖는 PMMA와 PVA를 전기방사하면 우수한 성질을 갖는 나노섬유를 얻을 수 있으며, 이를 압축하여 고강도 다층 PMMA/PVA bone plate를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.
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