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문제 정의
- 각각의 시료에서 ginsenoside Rg1, Re, Rf, 등 HPLC에서 전방에 위치하고 있는 분자량이 큰 다당체 함유 성분이 분자량이 작은 ginsenoside Rc, Rb2, Rd, Rg3 및 ginsenoside Rh2 성분으로 어떠한 조건으로 이환되는가를 보고자 하는 것이 연구의 목적이므로 통계처리는 시행하지 않았다.
- 본 연구는 인삼과 산양삼의 특이적인 ginsenoside 함량이 열 자극을 통한 홍삼화와 Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium lactis 등의 유산균 처리 과정에 의해 시간의 흐름에 따라 어떠한 성분의 변화가 일어나는지 관찰하고, 항암작용 및 항 전이작용8-10) 등이 보고된 ginsenoside-Rg3와 ginsenoside-Rh2를 대량 함유한 결과물이 이러한 과정을 통해 확보될 수 있는지를 관찰하고자 시도되었다.
- 이에 저자들은 이미 많은 연구를 통해 암세포의 성장 및 전이억제 효과가 보고8-10)된 ginsenoside Rh2, ginsenoside Rg3를 대량 함유한 삼 가공제품을 개발하기 위한 선행연구로, 인삼과 산양삼의 ginsenoside 함량이 열처리와 발효과정에 의해 어떠한 변화를 나타내며 또한 차이가 있는가를 알아보고자 HPLC(`High Performance Liquid Chromatography, 이하 HPLC)를 이용하여 각각의 뿌리에 함유된 10여 종의 ginsenosides를 측정한 후 성분의 변화를 추적하여 분석한 결과, 유의한 결론을 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- )의 농축기를 사용하였고, 분석용 HPLC로는 Varian 9012 Solvent Delivery System, 검출기는 Varian Variable Wavelength 9050 UV-VIS detector, 그리고 Autos-ampler는 Varian 9300을 사용하였다. AcCN, MeOH 등의 분석시약은 모두 HPLC용 시약을 사용하여 측정하였으며, 추출 및 분획용 용매는 모두 특급시약을 사용하여 실험하였다.
- 건조한 각각의 시료들을 유효 성분의 용출이 용이하도록 이축압축 성형기를 이용하여 각각의 입자 크기가 평균 5 ㎛가 되게 초미세 분말을 만들었다. 그리고 인삼의 발효에 유용하다고 보고11)된 유산균들로 혼합된 (주) cellbiotec (한국)의 ATP 혼합유산균 생균분말(Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacteri-um lactis)을 각각의 삼미세분말에 1%씩 접종하여 37℃의 clean banch에서 최종 7일간 배양하였고, 배양 1, 2, 4, 7일째에 각각의 샘플을 채취한 후 HPLC를 이용하여 10종의 ginsenoside 함량 분석을 시행하였다.
- 의 연구를 통해 상기한 유산균들은 인삼의 발효물 제조 공정에 적합한 것으로 보고된 바 있다. 그리고 시간의 경과에 따른 성분 변화를 확인하기 위하여 접종 후, 배양 1, 2, 4, 7일째에 각각의 샘플을 채취한 후 HPLC 를 이용하여 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg.3, Rh1 그리고 Rh2의 10종 ginsenoside 함량 분석을 시행하였다.
- 건조한 각각의 시료들을 유효 성분의 용출이 용이하도록 이축압축 성형기를 이용하여 각각의 입자 크기가 평균 5 ㎛가 되게 초미세 분말을 만들었다. 그리고 인삼의 발효에 유용하다고 보고11)된 유산균들로 혼합된 (주) cellbiotec (한국)의 ATP 혼합유산균 생균분말(Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacteri-um lactis)을 각각의 삼미세분말에 1%씩 접종하여 37℃의 clean banch에서 최종 7일간 배양하였고, 배양 1, 2, 4, 7일째에 각각의 샘플을 채취한 후 HPLC를 이용하여 10종의 ginsenoside 함량 분석을 시행하였다.
- 비극성 사포닌류의 패턴 분석을 위한 표준액은 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2의 10종 표준품을 각각 100 ㎍/㎖씩 취한 후 MeOH 1 ㎖에 녹인 후 0.45 ㎛ membrane filter로 여과하여 사용하였고, 검액은 얻어진 시료 외에 n-BuOH 분획물 10 ㎎을 취한 후 MeOH 1 ㎖에 녹인 후 0.45 ㎛ membrane filter로 여과하여 분석하였다.
-
⑥10종 표준품의 HPLC chromatogram과 분석시료의 chromatogram 양상
상기에서 제시한 방법에 따라 HPLC로 분석하여 표준품 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2와 수종의 삼류에 대한 각각의 chromatogram을 얻은 후 정량 평가하였다.
- 열처리 및 발효 등 각각의 단계를 홍삼화, 건조, 발효 1일째, 2, 4, 7일로 나누어 각각의 처치에 따라 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2의 10종 성분이 어떠한 변화를 나타내는지를 관찰하고자 하였다. 먼저 각각의 공정에서 확보된 삼류에 80% MeOH 100-500 ㎖를 가하여 수욕 상에서 3시간씩 3회 환류 추출하고 여과 후 농축하여 80% MeOH 추출물을 얻었다.
- 인삼 및 산양삼이 홍삼으로 되는 과정에서 나타나는 ginsenoside의 함량 변화를 관찰하기 위하여 모든 시료를 흐르는 물에 깨끗이 세척한 후 고압증숙기 안에 가지런히 세운 후 95-100℃에서 15시간 동안 증숙하였다. 증숙이 끝난 시료들은 다시 건조를 위해 95-100℃에서 72시간 동안 각각의 시료들이 타지 않도록 주의를 기울이면서 건조시켜 실험에 사용하였다.
- 인삼과 산양삼의 특이적인 ginsenoside 함량이 열 자극을 통한 홍삼화와 Lactobacillus rhamnosus 등의 유산균 처리 과정에 의해 시간의 흐름에 따라 어떠한 성분의 변화가 일어나는지 관찰하고자 HPLC를 이용하여 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2의 함량을 비교 분석하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 표준품 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2의 10종 표준품을 각각 500, 400, 300, 200, 100, 50 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 분석하여 얻은 각각의 ginsenoside에 대한 피크 면적비 (X축)와 표준품 농도 (Y축)에 대한 검량선을 각각 작성하였다. 그 결과 각 ginsenoside에 대한 검량선의 함수와 상관계수 R2값은 Table 2.
대상 데이터
- Rotary vacuum evaporator는 Eyela (Tokyo Co.)의 농축기를 사용하였고, 분석용 HPLC로는 Varian 9012 Solvent Delivery System, 검출기는 Varian Variable Wavelength 9050 UV-VIS detector, 그리고 Autos-ampler는 Varian 9300을 사용하였다. AcCN, MeOH 등의 분석시약은 모두 HPLC용 시약을 사용하여 측정하였으며, 추출 및 분획용 용매는 모두 특급시약을 사용하여 실험하였다.
- 본 실험에 사용한 산양삼은 충남 서천시에 있는 천방농산에서 재배된 수령 8-9 년생을 36뿌리 무작위로 선정하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 인삼은 4년 근과 6년 근으로 강화농협에서 구입하여 각각 36 뿌리씩 무작위로 추출하여 실험에 사용하였다.
- 얻어진 80% MeOH 추출물을 증류수에 현탁시켜 n-hexane, EtOAc 및 n-BuOH 순으로 분획한 후 농축하여 사포닌 주성분 분획물인 n-BuOH 분획물을 얻었다. 조사포닌 n-BuOH 분획물을 사포닌의 패턴 분석을 위한 시료로 사용하였다(Fig. 1).
성능/효과
- 1. 홍삼화 열 자극에 대하여 이전의 연구와 비교하였을때 인삼 4년근과 6년근은 큰 차이를 나타내지 않았으나, 산양삼은 ginsenoside Rb1, Rb2가 감소하였고, Rc, Rd 는 거의 변화를 나타내지 않았으며, Re와 Rf, Rg1 Rg3, 그리고 Rh1이 증가하였다.
- 2. 발효과정을 통한 ginsenoside의 함량 변화를 관찰한 결과, 인삼 4년근은 ginsenoside Re, Rg1이 감소하였고, Rb1, Rd, Rg3, 그리고 Rh1이 증가하였다.
- 3. 발효과정을 통한 ginsenoside의 함량 변화를 관찰한 결과, 인삼 6년근은 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, 그리고 Rg1이 감소하였고, Rg3가 소폭 증가하였다.
- 4. 발효과정을 통한 ginsenoside의 함량 변화를 관찰한 결과, 산양삼은 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, 그리고 Rg1이 큰 폭으로 감소하였고, Re, Rf, 그리고 Rg3가 상당히 증가하였다.
- 5. 발효과정을 통한 ginsenoside의 함량 변화는 인삼 4년근에 비해서는 6년근이, 6년근보다는 산양삼이 더욱 활발히 일어났고, 발효 노출 시간이 길어질수록 그 변화는 더욱 뚜렷하게 나타났다.
- 각 종 삼류에 증숙 과정을 통한 열 자극을 준 결과 ginsenoside의 함량에 변화가 나타남을 알 수 있었다(Fig. 3-11).
- 발효과정에서 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rb1의 함량 분석을 실시한 결과 4년근 인삼은 6.86 ㎎/g에서 발효 1일째 5.64 ㎎/g으로 줄다가 2일째는 6.54 ㎎/g으로 증가하였고, 4일에는 5.78 ㎎/g, 7일째에는 5.44 ㎎/g을 나타내어 소폭 감소하는 경향을 나타내었다.
- 발효과정에서 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rb2의 함량 분석을 실시한 결과 4년근 인삼은 4.86 ㎎/g에서 발효 1일째 4.17 ㎎/g으로 줄다가 2일째는 4.71 ㎎/g으로 소폭 증가하였고, 4일에는 4.34 ㎎/g, 7일째에는 4.27㎎/g을 나타내어 소폭 감소하는 경향을 나타내었으나 그 변화는 크지 않았다.
- 발효과정에서 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rc의 함량 분석을 실시한 결과 4년근 인삼은 4.42 ㎎/g에서 발효 1일째 3.82 ㎎/g으로 줄다가 2일째는 4.30 ㎎/g으로 소폭 증가하였고, 4일에는 4.00 ㎎/g, 7일째에는 3.72 ㎎/g을 나타내어 발효 과정이 진행될수록 소폭 감소하는 경향을 나타내었으나 그 변화는 크지 않았다.
- 발효과정에서 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rd의 함량 분석을 실시한 결과 4년근 인삼은 1.79 ㎎/g에서 발효 1일째 1.69 ㎎/g으로, 2일째는 1.77 ㎎/g, 4일에는 1.69 ㎎/g, 7일째에는 1.55 ㎎/g을 나타내어 그 변화는 크지 않았다.
- 발효과정에서 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Re의 함량 분석을 실시한 결과 4년근 인삼은 2.06 ㎎/g에서 발효 1일째 1.38 ㎎/g으로 줄다가 2일째는 1.67 ㎎/g으로 소폭 증가하였고, 4일에는 1.14 ㎎/g, 7일째에는 0.88 ㎎/g을 나타내어 발효과정이 진행될수록 점차 감소하는 경향을 나타내었다.
- 발효과정에서 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rf의 함량 분석을 실시한 결과 4년근 인삼은 0.48 ㎎/g에서 발효 1일째 0.87 ㎎/g으로 늘다가 2일째는 0.79 ㎎/g으로 소폭 감소하였고, 4일과 7일째에는 0.72 ㎎/g을 나타내어 소폭 증가하였다.
- 발효과정을 통한 ginsenoside의 함량 변화를 관찰한 결과 인삼 4년근은 ginsenoside Re, Rg1이 감소하였고, Rb1, Rd, Rg3, 그리고 Rh1이 증가하였다.
- 산양삼은 인삼 4년근이나 6년근에 비하여 상당히 큰 변화를 나타내었는데, ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, 그리고 Rg1이 큰 폭으로 감소하였고, Re, Rf, 그리고 Rg3가 증가하였으며, 특히 ginsenoside Rg3는 처음 삼의 상태보다 약 7배 이상으로 상당히 많은 양이 증가하였다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rg1의 함량 분석을 실시한 결과 4년근 인삼은 1.78 ㎎/g에서 발효 1일째 1.20 ㎎/g으로 줄다가 2일째는 1.37 ㎎/g으로 소폭 증가하였고, 4일에는 0.93 ㎎/g, 7일째에는 0.73 ㎎/g을 나타내어 전반적으로 감소하는 경향을 나타내었다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rg3의 함량 분석을 실시한 결과 4년근 인삼은 0.17 ㎎/g에서 발효 1일째 0.13 ㎎/g으로 줄다가 2일째는 0.15 ㎎/g, 4일에는 0.18 ㎎/g, 그리고 7일째에는 0.19 ㎎/g을 나타내어 그 변화는 크지 않았다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rh1의 함량 분석을 실시한 결과 4년근 인삼은 0.18 ㎎/g에서 발효 1일째 0.12 ㎎/g으로 줄다가 2일째는 0.14 ㎎/g, 4일에는 0.15 ㎎/g, 그리고 7일째에는 0.16 ㎎/g을 나타내어 큰 변화를 나타내지 않았다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rh2의 함량 분석을 실시한 결과 모든 삼류에서 발견되지 않았고, 열처리 과정이나 발효과정에 의해서도 생성되지 않음을 알 수 있었다.
- 이러한 결과는 체내 미생물의 대사과정을 통해 ginsenosides가 분해되는 일련의 과정, 즉 다수의 당을 가진 구조에서 일정한 자극에 의해 당들이 떨어져 나가면서 분자구조가 작아지는 과정(Fig. 12)을 참조하여 볼 때, 인삼 4년근에 비해서는 6년근이, 6년근보다는 산양삼이 유산균에 의한 배당체의 분해가 더욱 활발히 일어남을 알 수 있었다. 또한 발효 노출 시간이 길어질수록 그 변화는 더욱 뚜렷하게 나타났다.
- 하지만 본 연구에서 목표로 하였던 암 전이 억제 효능을 지니고 있는 ginsenoside Rh2는 실험 과정에서 생성이 되지 않은 것으로 나타났다.
후속연구
- 이러한 연구 결과를 바탕으로 향후 보다 더 구체적인 환경 설정을 통하여 특정 성분을 고용량 함유하는 삼 제품이 개발되길 바라는 바이다.
- 지금까지 고려인삼에서 추출 분리되어 밝혀진 ginsenoside의 종류를 보면 oleanane계 사포닌인 ginsenoside Ro 1종과 protopanaxadiol계 사포닌인 ginsenoside Ra1, Ra2, Ra3, Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3, 그리고 Rh2 등 총 10종이며, protopanaxatriol계 사포닌인 ginsenoside Re, Rf, 20-gluco-Rf, Rg1, Rg2와 Rh1 등이 있고15), 앞으로도 많은 ginsenoside가 분리 동정될 것으로 기대하고 있다.
- 향후 더욱 더 많은 양의 ginsenoside Rg3와 ginsenoside Rh2를 생성할 수 있는 발효의 시간 등 환경설정이나 특정 성분에 반응하는 특정 균주 등 지속적인 연구를 진행해야 할 것으로 생각되었다.
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