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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 대두보다 가공적성이 뛰어난 조직대두단백을 이용하여 고초균에 의한 고체 발효를 장기간 수행하였고 이에 따라 생산된 발효물의 품질, 항산화 활성과 γ-PGA 함량 및 물성을 평가하여 기능성 성분들이 강화된 조직대두단백 발효물을 생산하고자 하였다.
제안 방법
- γ-PGA 의 함량은 정제한 γ- PGA를 표준물질로 사용하여 GPC 분석을 실시하고 생성된 peak area를 이용하여 계산하였다.
- B. subtilis HA 균주를 이용한 TVP 발효물을 동결건조한 후 분말을 5% 점질물 용액으로 만든 후 동적 점탄성을 측정하였다. 점탄성 측정은 20℃로 설정된 원통형점도계에 spindle(Platte PP35Ti, 3.
- 0 mL/min의 속도로 흘려주었고 RI detector를 이용하여 검출하였다. Fructose를 농도별로 주입하여 각 농도별에 따른 peak 면적을 이용하여 표준곡선을 작성하였다(17).
- TVP 발효물의 탄성율(elastic modulus, G')과 점성율(viscous modulus, G")은 0～1 Hz의 범위 내에서 frequency sweep에 의하여 측정하였다.
- 건조한 점질물을 0.1 M Na2SO4/0.05 M NaN3(glacial acetic acid로 pH를 4로 조정) 용액에 1% 되게 녹인 다음, 원심분리 후 상등액을 0.45 μm syringe filter로 여과하여 GPC(gel permeation chromatography)로 분석하였다.
- 동결 건조된 발효물 분말 2 g에 물과 70% 주정을 각각 200 mL을 첨가하여 진탕 배양기를 이용하여 25℃에서 120rpm의 속도로 12시간씩 3회 추출하였다. 추출물을 여과지를 이용하여 여과한 뒤 감압농축한 후 동결건조 하여 항산화 측정을 위한 시료로 사용하였다.
- 동결 건조된 조직대두단백 발효물 2 g에 증류수 18 mL을 가하여 상온에서 30분간 교반 추출하여 1,000×g에서 15분간 원심분리 하여 상등액을 취한 다음 상등액 1 mL을 screw cap test tube의 cap(PYREX, diameter 13 mm)에 담아 colorimeter(Color Reader, CR-10, MINOLTA, Osaka, Japan)를 이용하여 L(lightness), a(redness), b(yellowness)값을 측정하였다.
- 동결건조 된 TVP 발효물 5 g에 증류수 45 mL 첨가하여 균질화 후에 여과 체(sieve, 0.99 mm)를 이용하여 여과시킨 시료를 제조하였다. 여과액 13 mL을 취하여 원통형점도계(HAAKE RheoStress 1, Karlsruhe, Germany)에 spindle(Rotor DG43 DIN 53544 Titan)을 장착하여 measuring cup DG43을 사용하여 측정하였다.
- 동결건조 된 TVP 발효물을 5% 농도로 제조하여 점질물의 점탄성 특성을 알아보았다. 발효 시간에 따른 점성과 탄성의 변화에는 차이가 있었으며 전반적으로 TVP 발효물은 탄성(G')보다 점성(G")이 높은 것으로 나타났다(Fig.
- 발효 기간에 따라 생산된 점질물중인 γ -PGA의 분자량 변화를 GPC를 이용하여 측정하였다(Table 4).
- 82이었으며, ΔE값은 백색판의 L, a, b값과 시료 L, a, b값과의 차이값을 이용하여 계산하였다. 시료의 갈색도는 상등액 1 mL을 1.5 mL cuvettes에 담아 spectrophotometer(Uvikon, Kontron Co., Ltd., Milano, Italy)를 이용하여 UV-VIS spectra(scanning range, 200～550 nm; scanning, 1 nm)와 갈색도(300 nm)를 측정하였다.
- 점질물에 함유된 레반의 함량을 측정하기 위하여 건조된 점질물을 1% 용액으로 제조하여 1% oxalic acid를 동량 가한 후 100℃에서 15분간 가열한 후 22,500×g에서 5분간 원심한 뒤 레반 가수 분해물을 포함하는 상층액만을 회수하였다.
- 조직대두단백을 이용하여 B. subtilis HA에 의한 장기간 동안 고체 발효를 통해 얻어진 발효물의 품질, 항산화 활성 및 물성 변화를 평가하였다. 발효시간에 따라 발효물의 색도는 L값은 감소하고 a, b 값은 증가하였으며 수용성 추출물의 갈색도는 발효 48시간까지는 서서히 증가하나 그 후에는 변화가 없는 것으로 나타났다.
- 동결 건조된 발효물 분말 2 g에 물과 70% 주정을 각각 200 mL을 첨가하여 진탕 배양기를 이용하여 25℃에서 120rpm의 속도로 12시간씩 3회 추출하였다. 추출물을 여과지를 이용하여 여과한 뒤 감압농축한 후 동결건조 하여 항산화 측정을 위한 시료로 사용하였다. DPPH 라디칼에 대한 소거활성은 Blois의 방법(14)에 따라 측정하였다.
- 0 mL/min의 속도로 흘려주었다(18). 표준곡선은 각기 다른 분자량(130, 400, 770, 1200 kDa)을 가진 dextran(American Polymer Corporation, Mentor, OH, USA)을 이용하여 작성하였다. γ-PGA 의 함량은 정제한 γ- PGA를 표준물질로 사용하여 GPC 분석을 실시하고 생성된 peak area를 이용하여 계산하였다.
- 99 mm)를 이용하여 여과한 다음 1,500×g에서 20분간 원심분리하여 균체 및 불용성 성분을 제거하고 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액을 2배 부피의 isopropanol을 첨가하여 고형분을 침전시킨 후 회수하여 60～70℃ 진공감압건조기에서 하루 동안 건조 후 건조무게를 측정하였다.
- 희석된 용액 990 μL에 sample 10 μL를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- Baker, Phillipsburg, NJ, USA)를 사용하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 ABTS(2,2-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 희석된 용액 990 μL에 sample 10 μL를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다. 상대 활성 비교를 위한 대조군으로는 Vit-C와 trolox를 사용하였다.
- (Decatur, IL, USA)로부터 구입하여 밀봉한 후 암소에서 보관하여 사용하였다. 용매인 pretanol은 Duksan 화학(Ansan, Korea)에서 구입하였으며, HPLC에 사용된 water와 acetonitrile은 HPLC 등급용 용매(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA)를 사용하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 ABTS(2,2-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)는 Sigma사(St.
- 각 시료의 유리 라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 IC50 값으로 나타내었다. 이때 상대 활성의 비교를 위하여 대조군으로 BHT, BHA, Vit-C를 사용하였다.
- 재래식 청국장에서 분리한 후 한국미생물보존센터에 기탁한 B. subtilis HA(KCCM 10775P) 균주를 사용하였다. 스타터 배양액은 탈지대두분말 5% 용액(w/v)을 균질화한 후 121℃에서 15분간 멸균한 액체 배지 50 mL에 MRS agar plate에서 42℃에서 24시간 동안 배양한 균주를 1회 접종한 뒤 진탕배양기(SI-900R, JEIO TECH Co.
데이터처리
- Means with the different letters in each column are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 실험 결과는 SPSS statistical package program(V.17.0)을 이용하여 평균과 표준오차(mean±SE)를 구하였으며, 각 집단 간 평균치 차이를 검증하기 위하여 one way-ANOVA 및 Duncan's multiple range test 를 적용하였다.
이론/모형
- ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ ̇cation decolorization assay 방법(15)에 의하여 시행하였다. 7 mM ABTS(Sigma Chemical Co.
- 추출물을 여과지를 이용하여 여과한 뒤 감압농축한 후 동결건조 하여 항산화 측정을 위한 시료로 사용하였다. DPPH 라디칼에 대한 소거활성은 Blois의 방법(14)에 따라 측정하였다. 시료를 각각의 용매에 녹여 농도별로 희석한 희석액 0.
- 여과액 13 mL을 취하여 원통형점도계(HAAKE RheoStress 1, Karlsruhe, Germany)에 spindle(Rotor DG43 DIN 53544 Titan)을 장착하여 measuring cup DG43을 사용하여 측정하였다. 측정온도는 20℃에서 전단속도(ŕ)는 1～100 sec-1의 범위에서 점도 측정을 통해서 유동특성을 알아보았고, 점조도 지수는 power law model로 측정하였다(16).
성능/효과
- γ -PGA 함량은 발효시간이 증가하면서 증가하는 경향을 보이면서 168시간에 37.72% 생산되었고, 분자량은 발효시간이 경과될수록 감소하였다.
- 72% 생산되었고, 분자량은 발효시간이 경과될수록 감소하였다. Levan 함량은 발효 초기인 12시간째 7.83%에서 발효시간이 경과할수록 감소하는 것으로 나타났다.
- TVP 발효물에서 생산된 점질물 중의 γ -PGA 함량은 발효시간이 길어짐에 따라 증가하였으며, 발효 48시간에서 31.56%에서 168시간에는 37.72%를 함유하고 있었다.
- ABTS와 potassium persulfate를 암소에 방치하여 ABTS+이 생성되면 시료의 항산화력에 의해 ABTS+이 소거되어 radical 특유의 청록색이 탈색되는데 이를 흡광도 값으로 나타내어 ABTS+의 소거 활성을 측정할 수 있다. TVP 발효물의 ABTS radical 소거 활성은 발효 전보다 발효 후가 높았으며 이는 DPPH radical 소거능 결과와 일치하였다(Table 3).
- 발효시간에 따라 발효물의 색도는 L값은 감소하고 a, b 값은 증가하였으며 수용성 추출물의 갈색도는 발효 48시간까지는 서서히 증가하나 그 후에는 변화가 없는 것으로 나타났다. TVP 발효물의 물과 70% 에탄올 추출물의 DPPH radical 소거 활성 측정 결과 발효 24시간째 70% 에탄올 추출물의 IC50값이 0.99 mg/mL로 가장 활성이 우수하였고 발효시간이 길어져도 활성이 증가하지 않았다. 또한 ABTS radical 소거 활성도 70% 에탄올 추출물이 발효 72시간째 IC50값이 1.
- TVP 발효물의 점조도는 발효 48시간째 7.89 Pa·sn 으로 가장 높았고 그 후에는 감소하는 것으로 나타났으며 점질물 함량은 발효 24시간째 26.49%로 가장 높은 함량을 보인 후 감소하는 것으로 나타났다.
- TVP 발효물의 점조도는 발효 48시간째 7.89 Pa·sn 으로 가장 높았고 이후에는 감소하는 것으로 나타났다.
- 99 mg/mL로 가장 활성이 우수하였고 발효시간이 길어져도 활성이 증가하지 않았다. 또한 ABTS radical 소거 활성도 70% 에탄올 추출물이 발효 72시간째 IC50값이 1.68 mg/g으로 가장 높았다. TVP 발효물의 점조도는 발효 48시간째 7.
- 34 mg/mL로 나타났으며 발효가 진행되면서 소거 활성이 증가하는 것으로 나타났다. 발효 24시간째 IC50 값이 물 추출물은 1.22 mg/mL, 70% 에탄올 추출물은 0.99 mg/ mL으로 가장 우수한 소거 활성을 나타내었고 발효시간이 길어져도 활성이 증가하지 않는 것으로 나타났다.
- subtilis HA 균주는 levan을 생산하는 균주로 TVP 발효물의 점질물에서도 levan이 검출되었다. 발효 시간에 따른 TVP 발효물 중 levan 함량은 발효 12시간째 7.83%에서 발효시간이 경과될수록 감소하는 것으로 나타났다. 미생물에 의한 levan의 생산은 탄소원의 농도, 당 종류에 따른 저해, 질소원의 농도, salt의 영향 등 영양적 요인과 배양온도, 압력, pH 등의 환경적 요인 등 여러 가지 요인에 의해 영향을 받는다고 보고되고 있다(40).
- 발효 시간에 따른 점성과 탄성의 변화에는 차이가 있었으며 전반적으로 TVP 발효물은 탄성(G')보다 점성(G")이 높은 것으로 나타났다(Fig. 3).
- 발효 전 TVP의 물 추출물과 70% 에탄올 추출물의 IC50값은 각각 4.82, 4.86 mg/mL로 나타났으며 발효에 의해 소거 활성이 증가하여 물 추출물은 발효 72시간째 IC50 값이 2.17 mg/mL, 70% 에탄올 추출물은 1.68 mg/mL으로 항산화 활성이 가장 높았으나 발효 시간이 길어지면서 감소하는 경향을 보였다.
- TVP 발효물의 물과 70% 에탄올 추출물의 DPPH radical 소거 활성 측정 결과를 Table 2에 나타내었다. 발효 전 증자 TVP는 IC50 값은 물 추출물이 2.68 mg/mL, 70% 에탄올 추출물은 2.34 mg/mL로 나타났으며 발효가 진행되면서 소거 활성이 증가하는 것으로 나타났다. 발효 24시간째 IC50 값이 물 추출물은 1.
- 8 kDa로 나타났다. 발효 초기에 생산된 점질물은 isopropanol 혼합에 의해 쉽게 뭉쳐졌으나 발효 시간이 경과할수록 점질물의 상태가 잘 뭉쳐지지 않고 퍼지는 형태가 되어 점질물의 물성에 차이가 있음을 나타났다. 이는 고초균이 TVP로부터 생산하는 고분자 점질물인 γ -PGA와 levan의 조성 및 PGA depolymerase 효소 의해 γ -PGA 분자량의 감소 등에 의한 복합적인 결과라 추측되며, Yao 등 (41)은 Bacillus subtilis NX-2에 의해 생산된 γ-PGA가 γ-PGA depolymerase 효소에 의한 가수분해로 배양 시간이 경과할수록 분자량이 작아진다고 보고하였다.
- 발효 초기인 12시간째 γ -PGA의 분자량은 1649.3 kDa이었으나 발효 시간이 경과할수록 분자량이 감소하여 발효 168시간째 γ -PGA 분자량은 1286.8 kDa로 나타났다.
- 1에서 나타내었다. 발효가 시작되면서 melanoidin이 생성되기 시작하여 발효 48시간째 까지 급격하게 증가하며 그 이후에는 거의 변화가 없는 것으로 나타났다. Hondo(23)는 된장을 공기 중에 방치하면 된장의 갈변이 촉진되며, 된장의 갈변은 온도에 의해 영향을 받는데 30℃에서의 갈변속도를 1로 보면 35℃에서는 2.
- subtilis HA에 의한 장기간 동안 고체 발효를 통해 얻어진 발효물의 품질, 항산화 활성 및 물성 변화를 평가하였다. 발효시간에 따라 발효물의 색도는 L값은 감소하고 a, b 값은 증가하였으며 수용성 추출물의 갈색도는 발효 48시간까지는 서서히 증가하나 그 후에는 변화가 없는 것으로 나타났다. TVP 발효물의 물과 70% 에탄올 추출물의 DPPH radical 소거 활성 측정 결과 발효 24시간째 70% 에탄올 추출물의 IC50값이 0.
- 89 Pa·sn 으로 가장 높았고 이후에는 감소하는 것으로 나타났다. 점질물 함량은 발효 24시간째 26.49%(w/w)로 가장 높은 함량을 보였고 48시간까지 그 함량을 유지하다 이후에는 소량 감소하는 것으로 나타났다. 이는 발효 시간이 길어짐에 따라 효소에 의해 점질물의 일부분이 가수분해 되어 점조도가 감소되고 점질물 함량이 감소되는 것이라 여겨지며, Ashiuchi 등(36)은 청국장 점질물의 분해효소인 poly-γ-glutamate depolymerase 가 균체 외 효소로서 생성되어 점질물을 분해시켜 점조도를 저하시킨다고 보고하였다.
후속연구
- 앞으로 여러 고초균들에 의해서 생산된 점질물 또는 γ -PGA의 점탄성의 특성과 분자량간의 관계에 대한 더 많은 연구가 필요할 것이라 생각된다.
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