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문제 정의
- 補血, 潤燥, 滑腸의 要藥으로서 실험적으로는 혈중지질강하, 간기능개선, 간보호효과등이 있다고 보고하였다. 본 연구에서는 當歸가 간섬유화 억제에도 일정부분 효과가 있을 것으로 기대되어 실험에 착수하였다.
- 이에 저자는 當歸가 간성상세포의 섬유화 억제에 미치는 영향을 관찰하고자, MTT Assay와 BrdU Assay를 시행하여 간성상세포의 활성도와 증식을 살펴보았고, collagen의 합성량, 단백합성에 직접관련이 있는 mRNA의 발현량 및 IL-6 cytokine의 생성량을 관찰하였으며, 물추출물 및 에탄올 80% 추출물의 효과를 비교하여 약재 추출 방법의 차이에 의한 치료 효과의 차이를 검증하고자 하였다.
제안 방법
- 1% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamine이 포함된 배지에 약재를 필요한 농도로 희석하여 처리하였다.
- Bioneer사의 Top DNA Polymerase Kit을 사용하여 수행하였다.
- MTT Assay를 통해 간성상세포의 활성도를 알아보기 위해 1㎖의 DMEM에 2mg의 MTT 비율로 용액을 만들고 적절히 희석시키기 위해서 온도를 따뜻하게 하였다. 24well plate에 HSC-T6 cell을 4×104/ml의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양한 후 약재를 처리하고 각각 23시간, 47시간 후 각 well에 200㎕의 MTT 용액을 첨가하여 45분 동안 37℃의 온도에 배양하였다.
- PIP의 양은 EIA plate reader를 이용하여 흡광도를 측정함으로써 수치화할 수 있다. PIP의 정확한 샘플 농도는 그 특정 흡광도를 표준 커브에 찍힌 표준흡광도와 비교함으로써 얻을 수 있었다.
- Peprotech사의 IL-6 ELISA kit을 사용하여 제작사의 지시에 따라 수행하였다.
- Procollagen assay의 condition을 만들기 위해서 간성상세포를 5×104/well로 24 well plate에 seeding 한 후, 24시간이 경과한 후에 간성상세포가 만들어내는 procollagen의 양을 측정하기 위하여 procollagen type I C-peptide EIA Kit(TaKaRa, Japan)를 사용하였으며, 제작사의 지시를 따라서 측정하였다.
- Promega사의 Reverse Transcription System을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 當歸가 간성상세포의 세포활성과 증식능, collagen 합성 및 그 유전자 발현, Cytokine IL-6 생성에 미치는 영향을 관찰하고자 rat의 간성상세포에 약물을 처리한 후 MTT assay, BrdU assay, Procollagen assay, RT-PCR 및 Cytokine IL-6 발현량 측정을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 當歸가 간성상세포의 활성화와 collagen 합성에 미치는 영향을 유전자의 변화양상을 통하여 파악하여 보고자 GAPDH를 house keeping gene으로 하고, 촬영된 이미지를 바탕으로 0㎍/㎖과 GAPDH를 기준으로 비율을 구하여 수치로 나타내었다. 24시간에서는 모두 특별한 경향성을 발견할 수 없었고, 48시간의 경우는 ASMA, TIMP2, collagen type 1a2에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현이 감소되는 경향이 있었다(Fig.
- 간성상세포에 當歸을 처리하였을 때 활성도를 살펴보기 위하여 MTT assay 를 시행하였다. 當歸를 증류수 및 80% EtOH로 각각 추출하여 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였고, 약재의 처리는 24시간, 48시간 동안 하였다. 當歸의 증류수 추출물에서는 24시간 및 48시간 동안 처리한 고농도 투여군에서 세포활성의 증가가 인정되었으며, 80% EtOH 추출물 처리군에서는 48시간 동안 처리한 고농도 투여군에서 유의성 있는 증가가 관찰되었다(Fig.
- 다음으로는 當歸가 간성상세포의 collagen 합성에 미치는 영향을 유전자의 변화양상을 통하여 파악하여 보고자 성상세포의 활성시에 증가하는 것으로 알려진 ASMA, 간섬유화에서 기존의 콜라겐 골격을 이루고 있는 collagen type Ⅵ 분해하는 물질인 MMP를 억제하는 것으로 알려진 TIMP1와 TIMP2, 간손상시 늘어나는 콜라겐 중의 하나인 procollagen Type 1a2 gene의 변화양상을 살펴보았다. House keeping gene으로는 GAPDH을 선택하였다.
- 대략 490nm의 참조 파장으로 설정하고 405nm의 파장에서 microplate reader로 샘플들의 흡광도를 측정하였다.
- 제작사의 지시에 따라 Capture antibody, Detection antibody, Murine IL-6 standard, Avidin-HRP Conjugate를 만들었다.
- 즉, 10X buffer 5㎕, dNTP 4㎕, primers FWD, REV 각 20 pmoles, ddH2O 35.8㎕, Taq Polymerase 0.2㎕, cDNA 1㎕를 넣어 총 volume이 50㎕가 되게하여 PCR을 수행하였다. 첫 번째 cycle에서는 95℃ 5분, 55℃ 1분, 72℃ 1분으로 하였고, 이후 19-28cycles는 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분으로 하였으며, 마지막 cycle은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃10분으로 하였다.
- 즉, MgCl2(25mM) 4㎕, 10X RT buffer 2㎕, dNTP (10mM) 2㎕, Random primer 1㎕(0.5㎍), Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor 0.5㎕, AMV RT 0.6㎕(15u), target RNA 1㎍을 넣고 나머지는 DEPC water를 첨가하여 총 용량이 20.1㎕가 되게 하여 25℃ 10분, 42℃ 1시간, 95℃ 5분 동안 처리하여 cDNA를 제작하고 5℃에서 차게 해서 -20℃에 보관하였으며 필요할 때마다 사용하였다.
- 한약재를 동결건조하고 다시 배지에 녹여서 세포에 처리할 때 약재별로 나타나는 세포독성은 약재에 따라 다양한 차이를 보이므로 세포독성은 나타나지 않으면서 약 효과를 관찰할 수 있는 농도의 설정이 중요하다. 지금까지 각종 논문에 소개된 일반적인 한약재의 농도는 일반적으로 500㎍/㎖이하로 설정되어 이용되어 온 것을 참고로 하여 본 연구에서는 31.25㎍/㎖, 62.5㎍/㎖, 125㎍/㎖, 250㎍/㎖, 500㎍/㎖로 결정하고 시간별로 처리하였다.
- 처리할 약재의 농도별로 6-well plate의 3개 well에 HSC-T6 cell을 8×104/well의 농도로 분주하고 다음날 농도별로 약재를 처리한 후 24시간 및 48시간 후에 Qiagen사의 RNeasy Mini Plus Kit를 이용하여 RNA를 분리하였다.
- 2㎕, cDNA 1㎕를 넣어 총 volume이 50㎕가 되게하여 PCR을 수행하였다. 첫 번째 cycle에서는 95℃ 5분, 55℃ 1분, 72℃ 1분으로 하였고, 이후 19-28cycles는 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분으로 하였으며, 마지막 cycle은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃10분으로 하였다. 이렇게 하여 생긴 생산물은 2% agarose gel을 이용하여 전기영동(110 Volt, 20분 간)한 후 densitometer를 이용하여 각 밴드의 밝기를 정량화하였다.
대상 데이터
- FBS, DMEM, Antibiotics 등은 Gibco사(CA, USA), n-propanol, MTT 등은 Sigma사(MO, USA), BrdU Kit은 Roche사(Germany), Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit는 TaKaRa사(Japan), RNeasy Mini Plus Kit는 Qiagen사(CA, USA), Top DNA polymerase는 Bioneer사(Korea), RT System은 Promega사(WI, USA), IL-6 Kit은 Peprotech사(London, UK) 등의 제품을 사용하였고, 기타 plastic wares는 SPL사(Korea) 제품을 이용하였다.
- House keeping gene으로는 GAPDH를 사용하였고, target gene으로는 Alpha Smooth Muscle Actin (ASMA), TIMP1, TIMP2, procollagen Type 1a2의 gene을 사용하였으며 각 primer의 sequence는 다음과 같다.
- 다음으로는 當歸가 간성상세포의 collagen 합성에 미치는 영향을 유전자의 변화양상을 통하여 파악하여 보고자 성상세포의 활성시에 증가하는 것으로 알려진 ASMA, 간섬유화에서 기존의 콜라겐 골격을 이루고 있는 collagen type Ⅵ 분해하는 물질인 MMP를 억제하는 것으로 알려진 TIMP1와 TIMP2, 간손상시 늘어나는 콜라겐 중의 하나인 procollagen Type 1a2 gene의 변화양상을 살펴보았다. House keeping gene으로는 GAPDH을 선택하였다. 실험결과 24시간에서는 모두 특별한 경향성을 발견할 수 없었고, 48시간의 경우는 ASMA, TIMP2, Collagen1a2에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현이 감소되는 경향을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 본 실험에 사용한 약재는 국내산으로 대한약전 외 한약규격집에 근거하여 경희의료원에서 구입하여 엄선한 것을 사용하였다.
- Friedman)을 이용하였다. 세포는 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamine이 포함된 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였다.
- 當歸 100g씩을 환류추출기에 넣고 1000cc의 증류수 또는 80% EtOH를 더하여 관류냉각장치를 부착한 상태로 2시간씩 전탕하였다. 이 전탕액을 Whatmann Paper로 여과한 후 rotary evaporator로 감압농축하고 동결 건조하여 23g(증류수 추출) 및 20g(80% EtOH 추출)씩의 건조추출물을 얻어서 실험에 사용하였다. 이렇게 얻은 약재는 세포배양액에 10mg/㎖의 농도로 녹이고 0.
데이터처리
- Microsoft사의 Excel program을 이용하여 T-test를 수행하였으며, p<0.05인 경우를 유의성이 있는 것으로 보았다.
이론/모형
- 當歸가 간섬유화 발생에 중요한 역할을 한다고 알려진 염증성 매개 물질중의 하나인 IL-6 생성에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 Peprotech사의 IL-6 kit을 사용하여 제작사의 지시를 따라 ELISA법으로 정량하였다. 24, 48시간 동안 약제를 처리한 후 나타난 결과, 농도 의존적으로 측정치의 증가를 보였으며 특히 고농도에서 유의한 증가를 보였다(Fig.
- 當歸를 처리했을 때 간성상세포의 증식에 미치는 효과를 확인해 보기 위해 BrdU assay를 시행하였다. 증류수 추출물과 80% EtOH 추출물 모두에서 일정 농도 이상에서 유의성 있는 억제 효과가 나타냈으며, 특히 48시간의 경우, 증류수 추출물에 비해 80% EtOH 추출물에서 더욱 유의한 세포증식 억제를 보이는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 간성상세포에 當歸을 처리하였을 때 활성도를 살펴보기 위하여 MTT assay 를 시행하였다. 當歸를 증류수 및 80% EtOH로 각각 추출하여 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였고, 약재의 처리는 24시간, 48시간 동안 하였다.
- 쥐의 간성상세포인 HSC-T6(kind gift of Dr. Scott L. Friedman)을 이용하였다. 세포는 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamine이 포함된 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였다.
성능/효과
- 1. 當歸는 증류수 추출물에서는 간성상세포 활성을 오히려 유의하게 증가시켰으며, 80% EtOH 추출물은 별다른 영향을 미치지 못했다.
- 2. 當歸는 간성상세포의 증식을 증류수 추출물에서는 24시간까지만 유의성있게 억제하였고, 48시간에서는 특별한 경향성이 없었으며, 80% EtOH 추출물은 24시간 및 48시간에서 모두 유의성 있게 억제하였으며 특히 48시간에서 더 많은 억제반응을 나타냈다.
- 24, 48시간 동안 약제를 처리한 후 나타난 결과 모두 농도 의존적으로 증가하는 경향성을 보여주었으며, 특히 고농도(500㎍/㎖)에서 유의성 있는 결과가 관찰되었다(Fig. 7).
- 當歸가 간섬유화 발생에 중요한 역할을 한다고 알려진 염증성 매개 물질중의 하나인 IL-6 생성에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 Peprotech사의 IL-6 kit을 사용하여 제작사의 지시를 따라 ELISA법으로 정량하였다. 24, 48시간 동안 약제를 처리한 후 나타난 결과, 농도 의존적으로 측정치의 증가를 보였으며 특히 고농도에서 유의한 증가를 보였다(Fig. 7).
- 24, 48시간 동안 약제를 처리한 후 나타난 결과, 모두 농도 의존적인 감소 경향성을 나타냈으며, 특히 24시간 처리군의 경우 125㎍/㎖, 250㎍/㎖, 500㎍/㎖의 고농도에서 유의성 있는 감소가 관찰되었다(Fig. 6).
- /well로 24 well plate에 seeding 한 후, 24시간이 경과한 후에 간성상세포가 만들어내는 procollagen의 양을 측정하기 위하여 procollagen type I C-peptide EIA Kit(TaKaRa, Japan)를 사용하였으며, 제작사의 지시를 따라서 측정하였다. 24, 48시간 동안 약제를 처리한 후 나타난 결과, 모두 농도 의존적인 감소 경향성을 나타냈으며, 특히 24시간 처리군의 경우 고농도에서 유의한 감소가 관찰되었다(Fig. 6). 이러한 결과로부터 當歸는 간성상세포의 procollagen 합성을 억제할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
- 24시간 동안 처리한 當歸의 증류수 추출물에서는 125㎍/㎖부터 유의성 있는 세포활성도의 증가 경향이 나타났으며, 80% EtOH 추출물에서는 모든 농도에서는 대조군과 비교하여 거의 변화가 없었다. 한편 48시간에서는 증류수 추출물의 경우 250㎍부터 세포활성도가 증가하는 경향을 보였으며, 80% EtOH 추출물에서도 500㎍/㎖에서 세포활성도가 유의성 있는 증가가 인정되었다(Fig.
- 24시간 동안 처리한 當歸의 증류수 추출물에서는 62.5㎍/㎖부터 모두 일정수준의 유의성 있는 세포 증식 억제 경향이 나타났으며, 80% EtOH 추출물에서는 각각 62.5㎍/㎖, 250㎍/㎖에서 유의성 있게 세포증식을 억제하였다. 한편 48시간에서는 증류수 추출물의 경우 125㎍/㎖에서만 유의성 있는 감소를 보였지만 특별한 경향성은 없었고, 80% EtOH 추출물에서는 각각 62.
- 3. 當歸는 48시간에서 ASMA, TIMP2, Collagen 1a2유전자 발현을 감소시키는 경향성이 있었다.
- 4. 當歸는 간성상세포의 procollagen 합성 억제에 대한 영향에 대한 실험에서 24, 48시간 모두 농도 의존적인 감소 경향성을 나타냈다.
- 5. 當歸는 IL-6 생성을 24시간 및 48시간에서 모두 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타냈으며, 특히 고농도에서 유의한 증가를 보였다.
- MTT assay 결과와 비교하여 살펴보면, 80% EtOH 추출물에서는 간성상세포 활성도에 별다른 영향을 미치지 못하였으나 BrdU assay 결과는 증류수 추출물에 비해 더욱 유의성 있는 활성도 억제 반응이 나타났다.
- Results show that both DW DG and 80% ethanol DG activate stellate cell viability in 48 hours.(P values compared with the none treated.
- 當歸를 증류수 및 80% EtOH로 각각 추출하여 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였고, 약재의 처리는 24시간, 48시간 동안 하였다. 當歸의 증류수 추출물에서는 24시간 및 48시간 동안 처리한 고농도 투여군에서 세포활성의 증가가 인정되었으며, 80% EtOH 추출물 처리군에서는 48시간 동안 처리한 고농도 투여군에서 유의성 있는 증가가 관찰되었다(Fig. 1, Fig. 2).
- 따라서 當歸의 증류수 추출물은 간성상세포 활성을 오히려 증가시키며, 세포 생존율을 촉진하는 작용이 있음을 짐작할 수 있었다. 이러한 결과는 이 등의 當歸가 CoCl2로 유발된 저산소증에 의한 성상세포의 생존율을 향상시키고 세포막의 파괴를 억제하였다는 보고20와 유사한 것이다.
- House keeping gene으로는 GAPDH을 선택하였다. 실험결과 24시간에서는 모두 특별한 경향성을 발견할 수 없었고, 48시간의 경우는 ASMA, TIMP2, Collagen1a2에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유전자 발현이 감소되는 경향을 관찰할 수 있었다(Fig. 5-a, Fig. 5-b, Fig. 5-c).
- 이러한 결과로부터 當歸가 간성상세포의 활성화에 관여하는 일부 유전자에 대한 억제 작용이 있음을 알 수가 있었다.
- 이상에서 當歸는 간성상세포의 활성도는 상승시켰으나, 간성상세포의 증식을 부분적으로 억제하였고, TIMP2, Collagen 1a2 유전자 발현과 procollagen 합성을 억제하였으며, IL-6 생성량을 촉진하였다. 향후 當歸가 간섬유화에 미치는 영향에 관한 연구가 지속적으로 필요할 것으로 사료된다.
- 즉, 이러한 실험결과들을 미루어볼 때, 當歸가 간성 상세포의 세포사멸을 억제하면서도 ASMA, TIMP2, Collagen 1a2 유전자 발현과 procollagen 합성을 감소시키고, IL-6의 분비를 촉진하여 기질을 분해시킴으로써 간섬유화를 억제하는 효과가 있을 것이라고 판단된다.
- 當歸를 처리했을 때 간성상세포의 증식에 미치는 효과를 확인해 보기 위해 BrdU assay를 시행하였다. 증류수 추출물과 80% EtOH 추출물 모두에서 일정 농도 이상에서 유의성 있는 억제 효과가 나타냈으며, 특히 48시간의 경우, 증류수 추출물에 비해 80% EtOH 추출물에서 더욱 유의한 세포증식 억제를 보이는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3, Fig. 4).
- 5㎍/㎖, 125㎍/㎖, 500㎍/㎖에서 유의성 있게 세포 활성도가 감소하였다. 증류수 추출물과 80% EtOH 추출물 모두에서 일정농도 이상에서 유의성 있는 억제 효과가 나타냈으며, 특히 48시간의 경우, 증류수 추출물에 비해 80% EtOH 추출물에서 더욱 유의한 세포증식 억제를 보이는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3 Fig. 4).
- 24시간 동안 처리한 當歸의 증류수 추출물에서는 125㎍/㎖부터 유의성 있는 세포활성도의 증가 경향이 나타났으며, 80% EtOH 추출물에서는 모든 농도에서는 대조군과 비교하여 거의 변화가 없었다. 한편 48시간에서는 증류수 추출물의 경우 250㎍부터 세포활성도가 증가하는 경향을 보였으며, 80% EtOH 추출물에서도 500㎍/㎖에서 세포활성도가 유의성 있는 증가가 인정되었다(Fig. 1, Fig. 2).
후속연구
- 이상에서 當歸는 간성상세포의 활성도는 상승시켰으나, 간성상세포의 증식을 부분적으로 억제하였고, TIMP2, Collagen 1a2 유전자 발현과 procollagen 합성을 억제하였으며, IL-6 생성량을 촉진하였다. 향후 當歸가 간섬유화에 미치는 영향에 관한 연구가 지속적으로 필요할 것으로 사료된다.
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