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문제 정의
- 본 연구는 DSS로 대장염을 유도한 마우스 모델에 당귀 추출물을 투여한 후 당귀의 항대장염 효과를 확인한 결과이다.
- 이러한 연구를 토대로 본 저자는 당귀가 궤양성 대장염에 효과가 있을 것으로 사료되어, ICR mice에 Dextran Sulfate Sodium(DSS)를 사용하여 유도한 염증성 대장 질환 모델에서 당귀추출물을 투여한 후 대장염 유도 마우스의 체중 및 대장 길이 변화, 비장비대, 대장염에 대한 질병활성도(Disease activity index, DAI), 사이토카인, 대장조직의 손상 및 염증 정도를 측정함으로써 당귀 추출물의 항대장염 효과를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 당귀추출물은 증류수에 녹여 제조한 후 7일동안 매일 대장염 유도 마우스에 경구투여 하였다. DSS 섭취량은 하루에 한 마리의 마우스 당 5ml 섭취량을 기준으로 하여 급수하였다. 실험이 끝나는 마지막 전날 마우스를 절식시키고, 다음날 마취시킨 뒤 대장을 분리하여 즉시 길이를 측정한 다음 급속 냉동하여 –80℃의 냉동실에 보관하였다.
- DSS로 유도한 대장염 마우스에서 당귀 추출물이 대장의 길이변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 마우스를 희생시킨 직후 대장 조직을 분리하여 장의 길이를 측정한 후 각 군별로 비교하였다(Fig. 2). 대장염을 유도한 DSS군의 장의 길이는 4.
- DSS로 유도한 대장염 마우스에서 당귀 추출물이 대장조직 회복에 미치는 영향을 알아보기 위하여 대장조직을 H&E 염색하여 현미경을 사용하여 X20, X40, X100 배율로 관찰한 후 조직의 병변에 대하여 분석하였다(Fig. 6A).
- DSS로 유도한 대장염 마우스에서 당귀 추출물이 질병활성도(Disease activity index, DAI)에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 매일 대변의 묽기, 혈변의 관찰 및 체중의 증감을 측정하여 질병활성도의 경향을 측정하였다(Fig. 4). Control에 비해 대장염을 유도한 DSS군에서 시간경과에 따른 질병활성도가 유의적으로 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
- DSS로 유도한 대장염 마우스의 염증 분석에 당귀 추출물이 미치는 영향을 측정하기 위하여, 마우스 대장 조직을 H&E 염색한 후, 조직에 나타난 염증을 기준 점수표를 이용하여 측정하였다(Fig. 7).
- Inflammation was scored using a scale of 0 (normal epithelial cell), +1 (Prolonged epithelial cell) +2 (Destruction of barrier), +3 (Ulcer plus 30%< barrier loss 60%) in epithelial cell, +1 (mild Infiltration), +2 (moderate Infiltration), +3 (severe Infiltration) in Immune cell.
- 각 군별 마우스의 체중 변화, 혈변의 정도, 변의 묽기를 매일 측정하였다. 질병 활성도 (Disease activity index, DAI)는 (1) 체중의 감소, (2) 혈변, (3) 묽은 변의 정도를 각각 수치화하고 이를 합산하여 나타내었다12).
- 각 군의 장 조직에 발생한 염증을 수치화하여 분석하기 위하여 기준 점수표를 적용하였다. 점막에서 정상상피세포는 0점, 늘어 진상피세포는 1점, 세포 장벽의 붕괴는 2점, 궤양의 발생과 동시에 30%<장벽의 붕괴정도<60%일 때는 3점, 궤양의 발생과 동시에 장벽의 붕괴가 60% 이상 관찰 될 때에는 4점을 적용하였고, 점막 염증세포에서 침윤의 정도가 보통일 때 1점, 중간정도의 수치일 때 2점, 심할 때 3점을 적용하였다.
- 3000㏄ 용량의 물에 당귀 80g을 넣고 약탕기에 2시간 20분 동안 탕전하여 960㏄의 용량으로 추출하였다. 당귀 추출물은 Rotary vaccum evaporator (EYELA, Tokyo, Japan)을 사용하여 농축하였다. 농축시료는 Freeze Dryer FDU-1200 (EYELA, Tokyo, Japan)을 사용하여 동결 건조하였고, 실험에 사용하기 전까지 –80℃의 deepfreezer에 보관하였다.
- 사육하는 기간 동안 물, 사료는 자유식으로 공급되었고, 한주간의 순화기간 뒤 마우스를 각 처리군당 10마리씩 5군 (일반, 대장염 유발군, 5-ASA 투여군, 당귀추출물 50㎎/㎏, 100㎎/㎏를 투여한 군)으로 무작위로 나누었다. 당귀추출물은 증류수에 녹여 제조한 후 7일동안 매일 대장염 유도 마우스에 경구투여 하였다. DSS 섭취량은 하루에 한 마리의 마우스 당 5ml 섭취량을 기준으로 하여 급수하였다.
- 대장 염증 질환에서 비장의 무게는 장기에 일어난 염증을 판단하는 주요 마커가 되기 때문에 DSS로 유도한 대장염 마우스에서 당귀 추출물이 비장의 무게변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 비장 조직을 분리한 후 비장 무게를 측정하여 그 무게를 비교하였다(Fig. 3). 대장염을 유도한 DSS 군의 비장 무게는 0.
- 마우스의 대장조직을 10% formalin을 사용하여 보존하고, “Swiss rolled” 방법을 사용하여 5μM parafin으로 고정 및 박편하였다.
- 박편한 조직을 슬라이드에 옮긴 후 Hematoxylin and eosin(H&E) staining법으로 염색하여 조직의 세포질과 핵을 구별하였고, 이를 SZX10 현미경 (올림푸스, 서울, 대한민국)을 사용하여 장조직의 염증세포 분포와 상피세포를 조직학적 관찰, 촬영 하였다.
- 본 실험에서는 24시간동안 DSS를 자유 급식하며 대장염을 유도하는 동안, 당귀 추출물을 하루에 한 번 경구 투여하는 방식으로 약물 투여를 진행하였고, 실험이 진행되는 일주일에 거쳐 매일 DSS에 의한 대장염의 유발 및 당귀 추출물에 의한 개선 증세를 보기위하여 체중 측정, 변의 묽기, 혈변의 유무를 측정하였고, 실험종료 후 마우스의 대장조직을 분리하여 장의 길이, 장조직의 형태학적인변화, 장조직의 염증화 및 사이토카인 생성량을 측정하였다.
- 실험이 끝나는 마지막 전날 마우스를 절식시키고, 다음날 마취시킨 뒤 대장을 분리하여 즉시 길이를 측정한 다음 급속 냉동하여 –80℃의 냉동실에 보관하였다. 비장 역시 즉시 채취하여 무게측정을 진행하였다. 본 동물실험은 실험동물 윤리 위원회의 가이드라인과 상지대학교 동물실험 지침서에 따라 진행되었다.
- 동물사육실의 환경은 20 ± 5℃, 상대습도 55 ± 10%, 명암 12시간 주기로 유지하였다. 사육하는 기간 동안 물, 사료는 자유식으로 공급되었고, 한주간의 순화기간 뒤 마우스를 각 처리군당 10마리씩 5군 (일반, 대장염 유발군, 5-ASA 투여군, 당귀추출물 50㎎/㎏, 100㎎/㎏를 투여한 군)으로 무작위로 나누었다. 당귀추출물은 증류수에 녹여 제조한 후 7일동안 매일 대장염 유도 마우스에 경구투여 하였다.
- 마우스의 대장 조직을 분리하여 그 일부를 잘라 PBS로 세척후, 10% FBS가 들어간 DMEM 배지에 넣고 24시간 배양한 후 조직을 제외한 상층액을 채취하여 즉시 -80℃의 냉동실에 보관하였다. 염증성 매개인자인 IL-6 사이토카인을 측정하기 위해, 효소면역분석법 (EIA, Enzyme immunoasssay)을 진행하였고, 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 파장 값 540㎚에서 각 샘플의 파장값을 측정한 후 IL-6 사이토카인 생성량을 측정하였다.
- 육안상 DSS 군에서 Control군 대비 장벽 근육층의 두께가 확연히 두꺼워짐을 확인할 수 있었고, 5-ASA군에서는 장벽 근육층의 두께가 다시 얇아짐을 확인 할 수 있었다. 이를 수치화하기 위하여 각 군의 조직에서 다섯 부분을 임의 추출하여 장벽 근육층의 두께를 측정하였고, 그 수치를 통계 처리하였다(Fig. 6B). DSS군의 장벽 근육층의 두께는 Control군에 비해 1.
- 점막에서 정상상피세포는 0점, 늘어 진상피세포는 1점, 세포 장벽의 붕괴는 2점, 궤양의 발생과 동시에 30%<장벽의 붕괴정도<60%일 때는 3점, 궤양의 발생과 동시에 장벽의 붕괴가 60% 이상 관찰 될 때에는 4점을 적용하였고, 점막 염증세포에서 침윤의 정도가 보통일 때 1점, 중간정도의 수치일 때 2점, 심할 때 3점을 적용하였다.
- 점막에서 정상상피세포는 0점, 늘어 진상피세포는 1점, 세포 장벽의 붕괴는 2점, 궤양의 발생과 동시에 30%<장벽의 붕괴정도<60%일 때는 3점, 궤양의 발생과 동시에 장벽의 붕괴가 60% 이상 관찰 될 때에는 4점을 적용하였고, 점막 염증세포에서 침윤의 정도가 보통일 때 1점, 중간정도의 수치일 때 2점, 심할 때 3점을 적용하였다. 점막하 조직에서 역시 염증세포에서 침윤의 정도가 보통일 때 1, 중간정도의 수치일 때 2, 심할 때 3점을 적용하여 전체 점수를 합산하여 통계 처리하였다.
대상 데이터
- 대장염 유도 약물인 Dextran Sulfate Sodium (DSS)는 MPbio(MP Biomedicals, Santa Ana, California, USA)에서 구입하였다. 5-ASA (5-Aminosalicylate)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. mouse IL-6 ELISA Set는 BD OptEIA™(BD Sciences, New Jersey, USA)에서 구입하였다.
- 6주령 ICR 수컷 마우스를 ㈜ 라온 바이오 링크 (Yonginsi, Republic of Korea)에서 분양받았다. 동물사육실의 환경은 20 ± 5℃, 상대습도 55 ± 10%, 명암 12시간 주기로 유지하였다.
- mouse IL-6 ELISA Set는 BD OptEIA™(BD Sciences, New Jersey, USA)에서 구입하였다.
- 당귀는 참당귀를 경북 봉화군 춘양에서 재배한 것을 온누리생약 (Seoul, Repulic of Korea)을 통해 구매하였다. 3000㏄ 용량의 물에 당귀 80g을 넣고 약탕기에 2시간 20분 동안 탕전하여 960㏄의 용량으로 추출하였다.
- 대장염 유도 약물인 Dextran Sulfate Sodium (DSS)는 MPbio(MP Biomedicals, Santa Ana, California, USA)에서 구입하였다. 5-ASA (5-Aminosalicylate)는 Sigma-Aldrich (St.
데이터처리
- 분석 결과 간 유의성은 P < 0.05 수준에서 GraphPad Prism (version 5)을 사용하여 검정하였다.
- 실험에서 얻은 모든 결과는 one-way analysis of variance(ANOVA) with Dunnett’s test를 사용하여 통계 처리하였고, mean ±S.E.로 나타내었다.
이론/모형
- DSS로 유도한 대장염 마우스의 대장 조직에서 사이토카인의 생성량에 대한 당귀추출물의 억제효과를 확인하기 위하여, 효소면역분석법(Enzyme immunoassay, EIA)을 이용하여 IL-6 사이토카인 생성량을 측정하였다. DSS군의 IL-6 사이토카인의 생성량은1,043.
- 비장 역시 즉시 채취하여 무게측정을 진행하였다. 본 동물실험은 실험동물 윤리 위원회의 가이드라인과 상지대학교 동물실험 지침서에 따라 진행되었다.
- 더불어 이들 염증 관련 사이토카인의생성량 증가는 궤양성 대장염을 앓고 있는 환자뿐만 아니라, DSS로 유도한 대장염 mice에서도 확인 할 수 있다20). 본 실험에서는 궤양성 대장염에서의 대표적으로 과 생성되는 전 염증 사이토카인인 IL-6을 효소면역측정법 (Enzyme Immunoassay)을 이용해 측정하였다. DSS투여군은 Control군에 비해 사이토카인 IL-6 생성량이 유의적으로 증가하였다.
성능/효과
- ). (B) Muscle thicknesses of colon sections from control , DSS-treated mice, and 5-ASA, Angelica gigas Nakai extract mice were evaluated. tissues by staining H&E is examined by microscope.
- 01배의 유의성 있는 증가율을 보였다. 5-ASA군의 IL-6 사이토카인 생성량은 857.5 pg/ml으로 DSS군 대비 17.78%의 억제율을 보였다. 당귀추출물 50 ㎎/㎏ 투여군의 IL-6 사이토카인 생성량은 563.
- 62%의 감소율을 나타내었다. 5-ASA군의 대장의 길이는 5.8 cm로 대장염 발생에 따른 길이의 감소가 유의성 있게 억제됨을 확인할 수 있었다. 당귀 추출물 50 ㎎/㎏ 투여군의 대장 길이는 6.
- 82%의 증가율을 나타내었다. 5-ASA군의 비장 무게는 0.10 g으로 DSS군 대비 비장의 비대가 유의성 있게 억제됨을 확인하였고, 21.14%의 억제율을 나타내었다. 당귀추출물 50 ㎎/㎏ 투여군의 비장의 무게는 0.
- 7). Control군은 정상 상피세포로 구성되어있고 부분적으로 염증세포에서 약간의 침윤을 관찰 할 수 있었으나(total score 3), DSS군은 점막 조직과 점막하 조직에서 전반적으로 염증세포의 심한 침윤을 볼 수 있었고, 점막 조직의 상피세포에서 주로 장벽의 붕괴와 궤양이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다(total score 8). 이에 반해 양성대조군인 5-ASA 투여군은 점막 조직에서 상피세포막의 붕괴가 회복되고, 염증 세포의 침윤이 줄어드는 것을 관찰할 수 있었고, 점막하 조직 역시 염증 세포의 침윤이 억제됨을 확인할 수 있었으나 유의한 억제 효과가 나타나지는 않았다(total score 7).
- 4). Control에 비해 대장염을 유도한 DSS군에서 시간경과에 따른 질병활성도가 유의적으로 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 양성대조군인 5-ASA군은 DSS군에 비해 유의적으로 낮은 질병활성도를 나타내었고, 당귀 추출물당귀추출물 50 ㎎/㎏ 투여군과 당귀 추출물 100㎎/㎏ 투여군은 농도 의존적으로 DSS군에 비해 유의적으로 낮은 질병활성도를 나타내는 것으로 확인되었다.
- DSS로 유도한 대장염 마우스의 대장 조직에서 사이토카인의 생성량에 대한 당귀추출물의 억제효과를 확인하기 위하여, 효소면역분석법(Enzyme immunoassay, EIA)을 이용하여 IL-6 사이토카인 생성량을 측정하였다. DSS군의 IL-6 사이토카인의 생성량은1,043.02 pg/ml로 Control군의 IL-6 사이토카인 생성량인 173.55pg/ml 대비 6.01배의 유의성 있는 증가율을 보였다. 5-ASA군의 IL-6 사이토카인 생성량은 857.
- 6B). DSS군의 장벽 근육층의 두께는 Control군에 비해 1.57배 유의적으로 증가하였고, 증가된 장벽 근육층의 두께는 5-ASA 투여에 의해 유의적으로 감소하였다. 당귀추출물 역시 5-ASA와 마찬가지로 DSS에 의해 유도된 장벽 근육층의 두께 증가를 Control군 수준으로 회복시키는 것으로 확인되었다.
- 또한 당귀 추출물의 경우 당귀 추출물 50㎎/㎏ 투여군에서는 체중 감소율에 억제효과가 있었지만 유의한 결과 값을 얻을 수 없었고, 100㎎/㎏ 투여군에서 실험기간 4일째까지는 유의한 체중 감소의 억제 효과를 관찰 할 수 있었으나, 실험 6일째에는 DSS군과 비슷한 체중 감소 경향을 보였다. DSS로 유도한 대장염 마우스의 대장 길이와 비장 무게변화를 측정한 결과, 당귀 추출물 투여군은 5-ASA 투여군과 마찬가지로 대장 길이가 유의성 있게 증가하였고(Fig. 2), DSS투여로 유도된 비장의 비대가 유의적으로 억제되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3). 또한 DSS로 유도한 대장염마우스의 혈변의 정도와 변의 묽기 정도를 합산하여 질병활성도를 수치화한 결과, DSS군에서는 시간에 따라 질병활성도가 증가하여 병변의 악화를 관찰할 수 있었고, 5-ASA 투여군과 당귀 추출물 투여군에서 질병활성도가 DSS군에 유의적으로 낮아지는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- DSS로 유도한 대장염 마우스의 체중의 변화를 측정한 결과(Fig. 1) DSS군은 Control에 비해 유의적인 체중의 감소를 보였고, 양성대조군인 5-ASA 투여에 따라 체중 감소의 억제를 확인 할수 있었다. 또한 당귀 추출물의 경우 당귀 추출물 50㎎/㎏ 투여군에서는 체중 감소율에 억제효과가 있었지만 유의한 결과 값을 얻을 수 없었고, 100㎎/㎏ 투여군에서 실험기간 4일째까지는 유의한 체중 감소의 억제 효과를 관찰 할 수 있었으나, 실험 6일째에는 DSS군과 비슷한 체중 감소 경향을 보였다.
- 본 실험에서는 궤양성 대장염에서의 대표적으로 과 생성되는 전 염증 사이토카인인 IL-6을 효소면역측정법 (Enzyme Immunoassay)을 이용해 측정하였다. DSS투여군은 Control군에 비해 사이토카인 IL-6 생성량이 유의적으로 증가하였다. 그러나 당귀추출물 투여군은 증가된 IL-6 생성을 유의적으로 감소시켰고, 이는 양성 대조군인 5-ASA 투여군이 감소시킨 IL-6 생성량보다 유의성이 더 큰 것으로 나타났다(Fig.
- 본 연구에서 DSS로 유도된 대장염 동물모델의 장조직을조직학적 분석한 결과, Control군과 비교하여 DSS군은 장벽 근육층의 두께가 확연히 두꺼워지고 직장부위에서 궤양성 염증의 발현을 관찰할 수 있었다. 그러나 당귀 추출물 투여군은 장벽 근육층의 두께가 회복될 뿐만 아니라, 상피세포의 침윤, 염증세포의 궤양화 및 막의 붕괴가 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6). 그러므로 본 실험에서 DSS로 유도한 대장염 동물모델의 대장염 병변의 관찰, 염증성 사이토카인 생성량의 측정 및 염증성 대장의 조직학적 분석 결과를 취합한 결과, 당귀 추출물은 현재 임상에서 사용 중인항염증 약제인 5-ASA와 마찬가지로 대장염의 완화 혹은 대장염생성 억제 효과를 나타내는 것으로 확인할 수 있었다.
- DSS투여군은 Control군에 비해 사이토카인 IL-6 생성량이 유의적으로 증가하였다. 그러나 당귀추출물 투여군은 증가된 IL-6 생성을 유의적으로 감소시켰고, 이는 양성 대조군인 5-ASA 투여군이 감소시킨 IL-6 생성량보다 유의성이 더 큰 것으로 나타났다(Fig. 5).
- 6). 그러므로 본 실험에서 DSS로 유도한 대장염 동물모델의 대장염 병변의 관찰, 염증성 사이토카인 생성량의 측정 및 염증성 대장의 조직학적 분석 결과를 취합한 결과, 당귀 추출물은 현재 임상에서 사용 중인항염증 약제인 5-ASA와 마찬가지로 대장염의 완화 혹은 대장염생성 억제 효과를 나타내는 것으로 확인할 수 있었다.
- 83%의 체중 감소율을 보였으나 유의성 있는 체중 감소의 억제효과를 보이지는 못했다. 당귀 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군은 대장염 유도 4일까지 유의성 있는 체중 감소의 억제를 보였으나, 대장염 유도 6일째에는 DSS군과 비슷한 체중 감소의 경향을 보였고, 첫 날 대비 5.06%의 체중 감소율을 보였다.
- 33%의 체중 감소율을 보이며, 유의성 있는 결과로 약물 투여에 의해 체중 감소가 억제됨을 나타내었다. 당귀 추출물 50 ㎎/㎏ 투여군은 첫 날 대비 6일째 2.83%의 체중 감소율을 보였으나 유의성 있는 체중 감소의 억제효과를 보이지는 못했다. 당귀 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군은 대장염 유도 4일까지 유의성 있는 체중 감소의 억제를 보였으나, 대장염 유도 6일째에는 DSS군과 비슷한 체중 감소의 경향을 보였고, 첫 날 대비 5.
- 8 cm로 대장염 발생에 따른 길이의 감소가 유의성 있게 억제됨을 확인할 수 있었다. 당귀 추출물 50 ㎎/㎏ 투여군의 대장 길이는 6.05 cm, 당귀 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군의 대장 길이는 5.82 cm로 DSS군 대비 대장 길이의 감소가 각 각 25.09%,20.38% 억제됨으로써, 당귀 추출물의 투여에 의해 대장 길이의 감소가 유의성 있게 억제됨을 확인할 수 있었다.
- 당귀 추출물 50㎎/㎏ 군과 100㎎/㎏ 군에서 모두 대장염 유발에 의해 나타나는 장벽의 비대, 염증세포의 침윤, 정상 상피세포장벽의 붕괴 및 궤양의 생성을 유의하게 억제시켰다.
- 당귀 추출물 50㎎/㎏ 군과 100㎎/㎏ 군에서 모두 대장염에 의해 나타나는 혈변, 묽은 변 및 체중 감소를 수치화한 질병활성도(DAI)를 감소시켰다.
- 당귀 추출물 50㎎/㎏ 군과 100㎎/㎏ 군에서 모두 대장염을 유도한 마우스 모델에서 증가된 염증성 사이토카인인 IL-6의 생성량을 유의적으로 억제시켰으며, 5-ASA 군에서는 사이토카인 IL-6 생성량에 유의성 있는 억제효과가 관찰되지 않았다.
- 당귀 추출물 50㎎/㎏ 군에서는 유의미한 체중 감소 억제효과가 없었으며, 당귀 추출물 100㎎/㎏ 군에서는 4일째까지 유의미한체중 감소 억제효과를 관찰할 수 있었다.당귀 추출물 50㎎/㎏ 군과 100㎎/㎏ 군에서 모두 대장 길이의 감소와 비장의 비대를 유의적으로 억제시켰다.
- 이에 반해 양성대조군인 5-ASA 투여군은 점막 조직에서 상피세포막의 붕괴가 회복되고, 염증 세포의 침윤이 줄어드는 것을 관찰할 수 있었고, 점막하 조직 역시 염증 세포의 침윤이 억제됨을 확인할 수 있었으나 유의한 억제 효과가 나타나지는 않았다(total score 7). 당귀 추출물 투여군 (50, 100 ㎎/㎏) 역시 5-ASA 투여군과 마찬가지로 점막 및 점막하 조직 상피세포 막의 붕괴가 회복되었고, 염증세포의 침윤이 유의적으로 감소된 것을 확인함으로써(total score 5, 6), 당귀 추출물에 의해 대장내 염증의 생성이 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.
- 78%의 억제율을 보였다. 당귀추출물 50 ㎎/㎏ 투여군의 IL-6 사이토카인 생성량은 563.23 pg/ml, 당귀추출물 100 ㎎/㎏ 투여군의 IL-6사이토카인 생성량은 509.55 pg/ml으로 각각 45.99%, 51.14%의 유의성 있는 억제율을 보였다.
- 14%의 억제율을 나타내었다. 당귀추출물 50 ㎎/㎏ 투여군의 비장의 무게는 0.10 g, 당귀추출물 100 ㎎/㎏ 투여군의 비장의 무게는 0.104 g으로 각 각 20.47%, 17.36%의 억제율을 보이며 유의성 있는 결과를 나타내었다.
- 57배 유의적으로 증가하였고, 증가된 장벽 근육층의 두께는 5-ASA 투여에 의해 유의적으로 감소하였다. 당귀추출물 역시 5-ASA와 마찬가지로 DSS에 의해 유도된 장벽 근육층의 두께 증가를 Control군 수준으로 회복시키는 것으로 확인되었다.
- 99%의 체중 증가율을 보였다. 대장염유도 6일째 DSS군은 첫날 대비 4.68%의 체중 감소율을 보이는데 반해, 양성대조군인 5-ASA 투여군은 첫날 대비 6일 째, 2.33%의 체중 감소율을 보이며, 유의성 있는 결과로 약물 투여에 의해 체중 감소가 억제됨을 나타내었다. 당귀 추출물 50 ㎎/㎏ 투여군은 첫 날 대비 6일째 2.
- 3). 대장염을 유도한 DSS 군의 비장 무게는 0.13 g으로 Control 군의 비장 무게 0.10 g에 비해 유의적으로 비장 무게가 증가함을 나타냈으며, 29.82%의 증가율을 나타내었다. 5-ASA군의 비장 무게는 0.
- 2). 대장염을 유도한 DSS군의 장의 길이는 4.84 cm으로 Control군의 장의 길이 8.04 cm에 비해 유의적으로 감소한 것으로 나타났으며, 59.62%의 감소율을 나타내었다. 5-ASA군의 대장의 길이는 5.
- 3). 또한 DSS로 유도한 대장염마우스의 혈변의 정도와 변의 묽기 정도를 합산하여 질병활성도를 수치화한 결과, DSS군에서는 시간에 따라 질병활성도가 증가하여 병변의 악화를 관찰할 수 있었고, 5-ASA 투여군과 당귀 추출물 투여군에서 질병활성도가 DSS군에 유의적으로 낮아지는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이러한 결과를 토대로, DSS 투여시간에 따른 체중의 감소, 묽은 변, 혈변, 장 길이의 감소 및 비장의 비대 증상이 당귀 추출물에 의해 완화됨을 제시할 수 있다.
- 1) DSS군은 Control에 비해 유의적인 체중의 감소를 보였고, 양성대조군인 5-ASA 투여에 따라 체중 감소의 억제를 확인 할수 있었다. 또한 당귀 추출물의 경우 당귀 추출물 50㎎/㎏ 투여군에서는 체중 감소율에 억제효과가 있었지만 유의한 결과 값을 얻을 수 없었고, 100㎎/㎏ 투여군에서 실험기간 4일째까지는 유의한 체중 감소의 억제 효과를 관찰 할 수 있었으나, 실험 6일째에는 DSS군과 비슷한 체중 감소 경향을 보였다. DSS로 유도한 대장염 마우스의 대장 길이와 비장 무게변화를 측정한 결과, 당귀 추출물 투여군은 5-ASA 투여군과 마찬가지로 대장 길이가 유의성 있게 증가하였고(Fig.
- 궤양성 대장염은 염증 혹은 궤양이 직장에서 시작하여 연속적으로 근위부로 진행하는 병변을 보인다. 또한 대장염이 유발된 장조직을 조직학적 분석으로 살펴보면, 직장 부위에서 염증 세포의활성화, 침윤, 상피세포에서의 궤양생성 및 장벽의 비대를 확인할 수 있다. 본 연구에서 DSS로 유도된 대장염 동물모델의 장조직을조직학적 분석한 결과, Control군과 비교하여 DSS군은 장벽 근육층의 두께가 확연히 두꺼워지고 직장부위에서 궤양성 염증의 발현을 관찰할 수 있었다.
- 또한 대장염이 유발된 장조직을 조직학적 분석으로 살펴보면, 직장 부위에서 염증 세포의활성화, 침윤, 상피세포에서의 궤양생성 및 장벽의 비대를 확인할 수 있다. 본 연구에서 DSS로 유도된 대장염 동물모델의 장조직을조직학적 분석한 결과, Control군과 비교하여 DSS군은 장벽 근육층의 두께가 확연히 두꺼워지고 직장부위에서 궤양성 염증의 발현을 관찰할 수 있었다. 그러나 당귀 추출물 투여군은 장벽 근육층의 두께가 회복될 뿐만 아니라, 상피세포의 침윤, 염증세포의 궤양화 및 막의 붕괴가 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- Control에 비해 대장염을 유도한 DSS군에서 시간경과에 따른 질병활성도가 유의적으로 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 양성대조군인 5-ASA군은 DSS군에 비해 유의적으로 낮은 질병활성도를 나타내었고, 당귀 추출물당귀추출물 50 ㎎/㎏ 투여군과 당귀 추출물 100㎎/㎏ 투여군은 농도 의존적으로 DSS군에 비해 유의적으로 낮은 질병활성도를 나타내는 것으로 확인되었다.
- 6A). 육안상 DSS 군에서 Control군 대비 장벽 근육층의 두께가 확연히 두꺼워짐을 확인할 수 있었고, 5-ASA군에서는 장벽 근육층의 두께가 다시 얇아짐을 확인 할 수 있었다. 이를 수치화하기 위하여 각 군의 조직에서 다섯 부분을 임의 추출하여 장벽 근육층의 두께를 측정하였고, 그 수치를 통계 처리하였다(Fig.
- 4). 이러한 결과를 토대로, DSS 투여시간에 따른 체중의 감소, 묽은 변, 혈변, 장 길이의 감소 및 비장의 비대 증상이 당귀 추출물에 의해 완화됨을 제시할 수 있다.
- 이상의 실험 결과를 통해 당귀 추출물이 궤양성 대장염에 있어 항염증효과가 있으며, 염증에 의한 대장의 조직학적 변화에 대해 억제효과를 갖는 것을 확인하였다.
- Control군은 정상 상피세포로 구성되어있고 부분적으로 염증세포에서 약간의 침윤을 관찰 할 수 있었으나(total score 3), DSS군은 점막 조직과 점막하 조직에서 전반적으로 염증세포의 심한 침윤을 볼 수 있었고, 점막 조직의 상피세포에서 주로 장벽의 붕괴와 궤양이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다(total score 8). 이에 반해 양성대조군인 5-ASA 투여군은 점막 조직에서 상피세포막의 붕괴가 회복되고, 염증 세포의 침윤이 줄어드는 것을 관찰할 수 있었고, 점막하 조직 역시 염증 세포의 침윤이 억제됨을 확인할 수 있었으나 유의한 억제 효과가 나타나지는 않았다(total score 7). 당귀 추출물 투여군 (50, 100 ㎎/㎏) 역시 5-ASA 투여군과 마찬가지로 점막 및 점막하 조직 상피세포 막의 붕괴가 회복되었고, 염증세포의 침윤이 유의적으로 감소된 것을 확인함으로써(total score 5, 6), 당귀 추출물에 의해 대장내 염증의 생성이 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.
후속연구
- 이상의 결과로 당귀 추출물의 항염증 및 대장조직의 보호작용이 궤양성 대장염의 치료 물질로의 가능성이 있음을 확인할 수 있었고, 향후 당귀 추출물의 항대장염 기전에 관한 심도 깊은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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