[논문]임상에서 분리된 희귀 비결핵 마이코박테리아 5종

박영길; 이영주; 유희경; 정미영; 류성원; 김창기; 김희진

doi:10.4046/trd.2010.69.5.331

임상에서 분리된 희귀 비결핵 마이코박테리아 5종
Five Rare Non-Tuberculous Mycobacteria Species Isolated from Clinical Specimens 원문보기

Tuberculosis and respiratory diseases : TRD = 결핵 및 호흡기 질환, v.69 no.5 = no.310, 2010년, pp.331 - 336

박영길 (대한결핵협회 결핵연구원) , 이영주 (대한결핵협회 결핵연구원) , 유희경 (대한결핵협회 결핵연구원) , 정미영 (대한결핵협회 결핵연구원) , 류성원 (대한결핵협회 결핵연구원) , 김창기 (대한결핵협회 결핵연구원) , 김희진 (대한결핵협회 결핵연구원)

Abstract ▼ AI-Helper

Background: Recently, the rate of infections with non-tuberculous mycobacteria (NTM) has been increasing in Korea. Precise identification of NTM is critical to determination of the pathogen and to target treatment of NTM patients. Methods: Sixty-eight unclassified mycobacteria isolates by rpoB PCR-RFLP assay (PRA) collected in 2008 were analyzed by National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) search after sequencing of 16S rRNA, hsp65, rpoB genes. Results: Nineteen strains of 68 isolates were specified as species after sequencing analysis of 3 gene types. We found 3 M. lentifulavum, 5 M. arupense, 4 M. triviale, 4 M. parascrofulaceum, and one M. obuense. One M. tuberculosis and another M. peregrinum were mutated at the Msp I recognition site needed for rpoB PRA. The remaining 49 isolates did not coincide with identical species at the 3 kinds genes. Conclusion: Sequencing analysis of 16S rRNA, hsp65, rpoB was useful for identification of NTM unclassified by rpoB PRA.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

. 본 연구에서는 PRA에서 균 동정이 되지 않았던 균들을 16S rRNA 유전자뿐 아니라, NTM 구별에 주로 사용되고 있는 rpoB 유전자와 hsp65 유전자 염기서열 분석을 통해 세 가지 유전자에서 같은 균종으로 분리된, 국내에서는 발표되지 않았던 균종을 발견하여 보고하고자 한다.
본 연구에서는 결핵연구원에서 주로 사용하는 rpoBPRA에서 동정할 수 없었던 NTM을 대상으로 16S rRNA, rpoB, hsp65 유전자 염기서열 분석을 실시한 바, 그 동안 발표되지 않았던 희귀종을 발견하게 되었다. 이러한 균종이 발견되지 않았던 이유로 생각할 수 있는 것은 결핵연구원에서 주로 사용했던 균 동정 방법인 rpoB PRA 방법을 확립할 당시에 표준균주 NTM이 충분하지 못하여 희귀종에 대한 대조를 할 수 있는 자료를 확보하지 못하였기 때문으로 본다⁷.

제안 방법

5% agarose gel에서 전기영동으로 확인 후 염기서열분석을 실시하였다. BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit를 이용하였으며, ABI Prism 3730XL DNA analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 그 결과 나타난 염기서열은 균 동정을 위하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 프로그램을 이용하여 염기서열을 비교하였다.
PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동으로 확인 후 염기서열분석을 실시하였다. BigDye Terminator v3.
PCR 혼합물 조성으로는 10 μL의 pre-mixture가 함유되어 있는 tube (Cosmogene tech, containing pfu DNA polymerase 1 U, dNTP 250 μM, 10×reaction buffer 2 μL)에 10 pmole의 primer 1 μL와 template DNA 1 μL, 증류수7 μL를 첨가하여 부피 20 μL가 되도록 한 후, PCR을 수행하였다.
결핵연구원에서 2008년에 실시한 균 동정검사에서 rpoB PRA 방법으로 균종 분류가 되지 않았던 임상 균주 68주를 16S rRNA, rpoB, hsp65 유전자의 염기서열 분석을 통해 균 동정을 실시하였다. 대상 균은 LowensteinJensen 배지에 접종하여 37℃로 4∼6주간 배양하였다.

대상 데이터

염색체 DNA는 boiling 방법으로 추출하였다. PCR 증폭을 위해, 16S rRNA primer는 g2R/rM582R을 사용하였고⁸, hsp65 primer는 Tb11/Tb12를 사용하였으며⁹, rpoB primer는 MF/MR을 사용하였다¹⁰. 각 primer의 염기서열, 조건, PCR 산물의 크기는 Table 1에 표시한 바와 같다.

데이터처리

1 Cycle sequencing Kit를 이용하였으며, ABI Prism 3730XL DNA analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 그 결과 나타난 염기서열은 균 동정을 위하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 프로그램을 이용하여 염기서열을 비교하였다.

이론/모형

염색체 DNA는 boiling 방법으로 추출하였다. PCR 증폭을 위해, 16S rRNA primer는 g2R/rM582R을 사용하였고⁸, hsp65 primer는 Tb11/Tb12를 사용하였으며⁹, rpoB primer는 MF/MR을 사용하였다¹⁰.

성능/효과

lentiflavum은 3균주가 발견되었다. 16S rRNA, hsp65, rpoB 유전자 염기서열에서 모두 97%이상 일치율을 보였다(Table 2). 균주의 색깔은 2균주는 white-yellow였고, 다른 한 균주는 yellow를 띠었다.
2008년도에 NTM으로 동정된 건수는 2,621건이었고, 그 중에서 M. intracellulare는 45%로 가장 많았고, M. avium이 18%, M. abscessus가 15.6%, M. kansasii가 6.6%, M. fortuitum complex가 5.7%, M. gordonae가 3.6%, M. terrae complex가 1.9%, M. chelonae가 1.2%, M. sulgai가 0.7% 순이었다. rpoB 유전자의 PRA 방법으로 동정된 균 중에서 그 빈도가 본 연구에서 나타난 균종들과 비슷한 빈도로 나타난 균종들은 M.
rpoB 유전자의 PRA 방법으로 동정된 균 중에서 그 빈도가 본 연구에서 나타난 균종들과 비슷한 빈도로 나타난 균종들은 M. marinum, M. wolinskyi, M. peregrinum, M. neoaurum, M. asiatcum, M.aubagnense, M. malmoense, M. parafortuitum, M. mucogenicum, M. scrofulaceum 등이며, 1∼6균주(0.04∼0.2%) 빈도로 발견되었다.
본 실험에 포함되었던 68균주 중에서 19균주는 3가지 유전자에서 같은 균종으로 나타나 균 동정이 가능하였지만, 나머지 49균주는 2가지 유전자만 같은 종으로 나타나는 경우도 있었고, 3가지 유전자 모두에서 다른 균종으로 나타나는 경우도 있어서 향후 이러한 균주에 대한 균종 분류에 대한 기준을 확립하는 것이 필요하다.
본 실험에서 M. lentiflavum은 3균주가 발견되었다. 16S rRNA, hsp65, rpoB 유전자 염기서열에서 모두 97%이상 일치율을 보였다(Table 2).
본 실험에서 발견된 희귀종 5종에 대한 염기서열에서 특히 종마다 뚜렷한 차이를 보이고 있는 부분이 있었다. 16S rRNA 염기서열 분석에서는 M.
균 집락의 형태를 구별하기가 쉽지 않았고, 색깔도 같은 종에서도 다르게 나타나 생화학적 구별의 어려움을 알 수 있었다. 본 실험에서는 rpoB PRA가 균 동정 비용이 저렴하기에 많은 균을 동시에 동정하기에는 적합하다. 그러나 일부 균종에 대한 PRA 자료가 없었고, 균의 제한효소 인식 부위에서 돌연변이가 발생할 경우 다른 양상으로 나타나 정확하게 균종을 분류할 수가 없다.
본 연구 결과, 세 가지 유전자에서 동일한 균종으로 분류된 균 중에서 희귀한 5종 17균주를 발견하였다. 본 연구는 보건소 환자 및 일반 병의원 환자에 대한 의뢰서정보 이외에 추가정보를 얻기 위해 추적조사는 하지 않았다.
arupense는 5균주가 발견되었는데, 집락 색깔은 모두 white-yellow였다. 세 가지 유전자 염기서열 분석에서 일치율은 92% 이상이었다. 이 균주는 스페인에서 처음으로 흙이나 객담에서 발견된 신속발육군이며, M.
parascrofulaceum은 4균주가 발견되었는데, 균주의 색깔은 2균주는 yellow, 하나는 orange, 다른 하나는 white-yellow였다. 세 가지 유전자에서 모두 98% 이상의 일치율을 보였다. M.

후속연구

본 실험에서 발견된 희귀종 5종은 그 동안 발표되었던 균종들과²⁶ 더불어 우리나라 임상에서 분리된 자원으로서, 향후 우리나라 임상 NTM의 진단 및 치료 발전에 기여하는 자료로 역할을 하게 될 것이다.
. 향후 더욱 활발한 균종 분류의 노력으로 NTM 희귀종을 확보하며, 아울러 균종에 따른 임상환자의 증상이나 질병이환 여부, 치료 여부 등의 연구가 지속되어야 한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	우리나라에서 몇 년도 이후에 NTM의 분리율이 증가하고 있는가?	우리나라에서도 1990년 이후 NTM의 분리율이 증가하고 있으며4최근 발표에서는 도말양성자에서 10% 내외로 나타나고 있다4,5. NTM은 결핵균에 유효한 항결핵제들이 효과가 없는 경우가 많고, NTM의 종류에 따라 치료가 다른 경우가 많으므로6, 임상검체에서 NTM의 신속한 균 동정은 환자의 적절한 진단과 치료방침 수립에 매우 중요하다.
	비결핵항산균은 무엇으로 간주되어왔는가?	leprae를 제외한 항산균으로서 사람 및 동물에서 질병을 일으킬 수있는 균이다. NTM은 토양과 물에 존재하고 있어 임상검체에서 분리되었을 때 대부분 오염균으로 간주되어왔다1. 그러나 후천성 면역결핍증 환자뿐만 아니라 면역기능이 정상적인 사람에서도 M.
	비결핵항산균이란?	비결핵항산균(non-tuberculous mycobacteria, NTM)은 Mycobacterium tuberculosis complex와 M. leprae를 제외한 항산균으로서 사람 및 동물에서 질병을 일으킬 수있는 균이다. NTM은 토양과 물에 존재하고 있어 임상검체에서 분리되었을 때 대부분 오염균으로 간주되어왔다1.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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