[논문]선퇴가 인간의 THP-1 단핵구에서 사이토카인 유전자 발현에 미치는 영향

안종현; 김경준

선퇴가 인간의 THP-1 단핵구에서 사이토카인 유전자 발현에 미치는 영향
Effects of Cryptotympana pustulata on the expression of cytokine genes in human monocytes of THP-1 원문보기

韓方眼耳鼻咽喉皮膚科學會誌 = The journal of Korean Medicine Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology, v.23 no.1 = no.41, 2010년, pp.94 - 110

안종현 (경원대학교 한의과대학 안이비인후피부과학 교실) , 김경준 (경원대학교 한의과대학 안이비인후피부과학 교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objective : This study was performed to evaluate the effect of immune reaction inductive substances such as phorbol-myristate-acetate(PMA), lipopolysaccharide(LPS), dermato-phagoides pteronyssus crude extract(DPE), dinitrochloro-benzene(DNCB) and Cryptotympana pustulata(CP), the Cryptotympana pustulata extracting substance at simultaneously on the translocation of nuclear factor-kappa B(NF-${\kappa}B$) towards to the nucleus and the mRNA expression patterns of various cytokine genes in Human acute monocytic leukemia cell line(THP-1 cells), monocytes of human. Experiment : To analyze cytokine genes expression patterns, the RT-PCR method was used, measuring tumor necrosis factor(TNF)-$\alpha$ that had been secreted during cell culture in the ELISA method. The morphological change in the cell observed during THP-1 cell culture was observed using a scanning electron microscope (SEM) and the quantitative distribution in the cell NF-${\kappa}B$ was analyzed through immunocytochemistry and a confocal microscopy. Result : CP showed different influences onto the mRNA expression patterns of cytokine genes with PMA, LPS. DPE and DNCB according to the types of immune inductive substances in the THP-1 cells. The expressions of inter-leukin(IL)-10, interferon(INF)-$\gamma$, TNF-$\alpha$ and monocyte chemoattractantant protein(MCP)-1 induced by PMA were suppressed by CP while the expression of transforming growth factor(TGF)-$\beta$ was promoted. Regarding the secretion pattern of TNF-$\alpha$ according to PMA processing, its secretion amount was increased by CP concurrent processing, in case of processing CP onto PMA and LPS, We discovered that the secretion amount of TNF-$\alpha$ was increased. Upon processing PMA and LPS on the THP-1 cell strain at the same time or either additionally processing CP thereon, the movement increase towards the nucleus from the NF-${\kappa}B$ cell cytoplasm, a transcription factor was able to be observed. Conclusion : In this study, Cryptotympana pustulata extracting substance was confirmed that it had an influence on expression patterns of cytokine genes according to the actions of a variety kinds of immune reaction inductive substances processed on the monocyte THP-1 cell of humans. Therefore, additional studies as for the immune adjusting function of Cryptotympana pustulata are considered to be able to offer important materials for curing immune abnormal diseases such as atopy dermatitis afterward.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

에 “治風寒暑濕外搏肌膚發爲恩津遍身瘙痒或赤或白口苦咽乾或作寒熱”이라 하여 風寒暑濕의 邪氣가 肌膚에 울체된 피부질환을 치료하는 처방으로 아토피 피부염에 응용할 수 있는 처방이다. 따라서 각 처방에 포함되어 있는 선퇴가 아토피피부염에 효과가 있음을 추측해볼 수 있으며, 이에 약재선정을 하여 연구하였다.
본 연구에서는 아토피 피부염 관련 면역 반응의 기전 연구를 위한 병리모델에서 유용하게 사용되고 있는 인간의 단핵세포주인 Human acute monocytic leukemia cell line(THP)-1에 세포분화 유도인자인 phorbol-myristate-acetate(PMA)를 처리하면서 면역반응 유발물질인 lipopolysaccharide(LPS), 먼지진드기 추출물 dermato-phagoides pteronyssus crude extract(DPE), 화학물질인 dinitrochloro-benzene(DNCB)을 사용하여 면역반응을 유발한 후 다양한 사이토카인의 발현시킨 결과를 비교 분석하였다. 특히, 알레르기 반응을 억제하는 것으로 알려져 있는 선퇴추출물(CP)을 각각 처리하여 사이토카인 유전자 발현에 관련된 효과와 염증 반응의 중요한 조절인자로 알려져 있는 TNF-α 분비량을 측정하고 다양한 사이토카인의 유전자 발현을 조절하는 전사조절인자인 nuclear factor-kappa B(NF-κB)의 세포질에서 핵으로의 전이 정도를 확인하고자 하였다.
본 연구에서는 아토피 피부염 관련 면역 반응의 기전 연구를 위한 병리모델에서 유용하게 사용되고 있는 인간의 단핵세포주인 THP-1을 이용하여 다양한 면역반응 유발물질(LPS, DPE, DNCB)을 처리하고 그 결과를 비교 분석하였다. 특히, 알레르기 반응을 억제하는 것으로 알려져 있는 CP를 처리하여 사이토카인 유전자 발현에 관련된 효과를 확인하여 CP가 아토피피부염에 효과가 있는지 확인하고자 하였다.
본 연구에서는 아토피 피부염 관련 면역 반응의 기전 연구를 위한 병리모델에서 유용하게 사용되고 있는 인간의 단핵세포주인 THP-1을 이용하여 다양한 면역반응 유발물질(LPS, DPE, DNCB)을 처리하고 그 결과를 비교 분석하였다. 특히, 알레르기 반응을 억제하는 것으로 알려져 있는 CP를 처리하여 사이토카인 유전자 발현에 관련된 효과를 확인하여 CP가 아토피피부염에 효과가 있는지 확인하고자 하였다.
특히, 알레르기 반응을 억제하는 것으로 알려져 있는 선퇴추출물(CP)을 각각 처리하여 사이토카인 유전자 발현에 관련된 효과와 염증 반응의 중요한 조절인자로 알려져 있는 TNF-α 분비량을 측정하고 다양한 사이토카인의 유전자 발현을 조절하는 전사조절인자인 nuclear factor-kappa B(NF-κB)의 세포질에서 핵으로의 전이 정도를 확인하고자 하였다.

제안 방법

처리 농도는 기존의 연구 결과들과 세포 독성 실험 결과를 참고하였다^20,21). CP의 처리 농도는 세포 독성 시험에서 대조군에 비해 60% 이상의 세포증식률을 나타낸 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 각각의 면역 반응 유발물질들이 처리된 세포들에서 분비된 TNF-α의 단백질량을 측정하기 위해 면역 반응 유발물질을 처리한 후 0, 6, 12, 24, 48 시간에 배양 중인 배지를 수획하였으며, 각각의 처리 시간에 lysis buffer와 분리 시약을 이용하여 total RNA를 추출하였다.
합성된 cDNA 1 ㎕과 각각의 유전자에 대한 primers(Table Ⅰ)를 PreMix PCR tube에 넣고 초기 denaturation(94℃에서 5분) 후에, 증폭을 위해 94℃에서 1분, 55～59℃에서 1분, 72℃에서 1분의 주기를 각각의 유전자의 특성에 따라 30～38주기 시행하였다. PCR 산물은 2% agarose gel 상에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV light 하에서 densitometer(Vilber Lourmat, France)를 이용하여 relative intensity를 측정하였다. 비교정량적인 분석을 위하여 GAPDH를 internal control로 사용하였으며, GAPDH PCR 산물 intensity에 대한 각각의 유전자들의 PCR 산물 intensity의 비율로 양적인 비교를 실시하였다.
22 ㎛ filter로 여과멸균 후 Bradford 시약을 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다. 각각의 면역 반응 유발물질들이 처리된 세포들에서 total RNA는 Trizol reagent(Invitrogen, Germany)를 사용하여 분리하였으며, 사이토카인 유전자들의 발현 양상을 확인하기 위한 RT-PCR primers 는 Table Ⅰ에 나타낸 염기서열로 합성하였으며, AccuPower RT-PCR PreMix는 Bioneer(Korea) 제품을 사용하였다. 면역 반응 유발물질 처리 후 PMA에 의해 분화된 THP-1 세포에서 분비된 TNF-α 양을 측정하기 위한 ELISA kit은 Koma Biotech(Korea) 제품을 사용하였다.
각각의 면역 반응 유발물질들이 처리된 세포들에서 분비된 TNF-α의 단백질량을 측정하기 위해 면역 반응 유발물질을 처리한 후 0, 6, 12, 24, 48 시간에 배양 중인 배지를 수획하였으며, 각각의 처리 시간에 lysis buffer와 분리 시약을 이용하여 total RNA를 추출하였다.
처리 농도는 기존의 연구 결과들을 참고하여 고, 중 저 농도의 3단계로 처리하였다^20,21). 각각의 물질을 48시간 동안 처리한 후 증식된 세포의 수를 비교하여 세포 독성 결과를 확인하였다.
각각의 시료에서 세포질 내에서 활성화된 NF-κB의 핵 내부로의 이동(translocation) 여부를 알아보기 위해 mouse monoclonal NF-κB p65(F-6) antibody(Santacruz, sc-8008)를 1차 항체로 사용하고, 2차 항체로는 goat anti-mouse IgG Rhodamine-conjugate antibody(Invitro-gen, USA)를 사용하여 공초점 현미경(Zeiss, Germany)을 통하여 관찰하였다.
각각의 시료에서 추출된 total RNA의 양은 spectrophotometer로 정량하였으며, 그 상태는 2% agarose gel 전기영동 후 18s와 28s rRNA band를 전기영동을 통해 관찰하였다. 추출한 total RNA 300 ng을 reverse transcription mixture(5X PrimeScriptTM Buffer, PrimeScript-TM RT Enzyme Mix I, 50 μM Oligo dT Primer, 100 uM Random 6 mers, RNase Free dH2O)에 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA에 대한 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다.
관찰된 형광이미지를 세포질과 핵질로 구분하여 NF-κB의 intensity ratio를 Zeiss image analy-sing program(Germany)으로 정량화하여 비교하였다.
4, 4℃)로 1시간 동안 후 고정 하였다. 동일 완충액(0.1M phosphate buffer)으로 10분씩 3회 세척한 후, 50%-70%-90%-95% 에탄올로 각각 10분씩 처리하고, 100% 에탄올로 10분씩 3회 처리하였다. 탈수 처리가 끝난 시료는 isoamyl acetate로 치환 후 액체이산화탄소에 의한 임계점 건조(HCP-2, Hitachi, Japan)과정으로 건조시킨 후 aluminum stub에 고정하여, 이온코팅기(E-1030, Hitachi, Japan)를 이용하여 약 5～10 ㎚ 두께로 Pt-Pd ion particle 코팅 처리 후, 전계방사형 주사전자현미경(S-4700, Hitachi, Japan)을 이용하여 가속전압 10 ㎸상에서 관찰하였다.
배양된 세포를 4-well plate에 각각의 세포주를 일정량(5×104/㎖) 접종한 후에 면역 반응 유발물질을 각각 LPS(1 ㎍/㎖), DPE(10 ㎍/㎖), DNCB(5 ㎍/㎖)의 농도로 처리하였다.
배양된 세포를 96-well plate에 THP-1을 일정량(1×104/㎖) 접종한 후에 면역 반응 유발물질을 각각 LPS(0, 0.1, 1, 10 ㎍/㎖), DPE(0, 1, 10, 50 ㎍/㎖), DNCB(0, 1, 5, 20 ㎍/㎖), CP(0, 0.1, 1, 10 ㎍/㎖) 등의 농도로 처리하였다.
본 연구에서는 THP-1 세포주에 PMA처리를 하고 면역반응 유발물질인 LPS, DPE, DNCB를 각각 처리한 뒤 추가로 선퇴추출물(CP)을 처리하여 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다.
1, 1 , 1 0 ㎍/㎖) 등 을 처 리 한 결과, 저농도에서 77~93%, 중간 농도에서 65~78%, 고농도에서 45~61%정도의 세포가 증식하는 독성을 나타내었다(Table Ⅱ). 본 연구에서는 세포가 증식하는 중간 정도의 독성을 나타내는 농도를 선정하여, 1 ㎍/㎖의 LPS, 10 ㎍/㎖의 DPE, 5 ㎍/㎖의 DNCB, 1 ㎍/㎖의 CP 등을 실험에 사용하였다.
PCR 산물은 2% agarose gel 상에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV light 하에서 densitometer(Vilber Lourmat, France)를 이용하여 relative intensity를 측정하였다. 비교정량적인 분석을 위하여 GAPDH를 internal control로 사용하였으며, GAPDH PCR 산물 intensity에 대한 각각의 유전자들의 PCR 산물 intensity의 비율로 양적인 비교를 실시하였다.
시료의 TNF-α 농도는 흡광도에 대한 표준농도곡선을 이용하여 계산하였다.
CP는 막자사발을 이용하여 분말을 만들어 100 ㎎을 칭량하여 1 ㎖의 dimethylsulfoxide(DMSO)로 용해한 후 실온에서 2시간 동안 전탕하여 4000 RPM에 10분간 원심분리하였다. 원심분리된 시약의 상청(supernatant)을 취하여 0.22 ㎛ filter로 여과멸균 후 Bradford 시약을 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다. 각각의 면역 반응 유발물질들이 처리된 세포들에서 total RNA는 Trizol reagent(Invitrogen, Germany)를 사용하여 분리하였으며, 사이토카인 유전자들의 발현 양상을 확인하기 위한 RT-PCR primers 는 Table Ⅰ에 나타낸 염기서열로 합성하였으며, AccuPower RT-PCR PreMix는 Bioneer(Korea) 제품을 사용하였다.
05% Tween-20이 포함된 PBS를 사용하여 2번 수세하였다. 제조사의 사용방법에 따라 negative control과 positive control 그리고 시료를 96-well plate에 1시간 동안 처리하였으며, 발색 반응 결과를 Genios ELISA reader(Tecan, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 시료의 TNF-α 농도는 흡광도에 대한 표준농도곡선을 이용하여 계산하였다.
1, 1, 10 ㎍/㎖) 등의 농도로 처리하였다. 처리 농도는 기존의 연구 결과들을 참고하여 고, 중 저 농도의 3단계로 처리하였다^20,21). 각각의 물질을 48시간 동안 처리한 후 증식된 세포의 수를 비교하여 세포 독성 결과를 확인하였다.
추출한 total RNA 300 ng을 reverse transcription mixture(5X PrimeScriptTM Buffer, PrimeScript-TM RT Enzyme Mix I, 50 μM Oligo dT Primer, 100 uM Random 6 mers, RNase Free dH2O)에 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA에 대한 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다.
1M phosphate buffer)으로 10분씩 3회 세척한 후, 50%-70%-90%-95% 에탄올로 각각 10분씩 처리하고, 100% 에탄올로 10분씩 3회 처리하였다. 탈수 처리가 끝난 시료는 isoamyl acetate로 치환 후 액체이산화탄소에 의한 임계점 건조(HCP-2, Hitachi, Japan)과정으로 건조시킨 후 aluminum stub에 고정하여, 이온코팅기(E-1030, Hitachi, Japan)를 이용하여 약 5～10 ㎚ 두께로 Pt-Pd ion particle 코팅 처리 후, 전계방사형 주사전자현미경(S-4700, Hitachi, Japan)을 이용하여 가속전압 10 ㎸상에서 관찰하였다.
추출한 total RNA 300 ng을 reverse transcription mixture(5X PrimeScriptTM Buffer, PrimeScript-TM RT Enzyme Mix I, 50 μM Oligo dT Primer, 100 uM Random 6 mers, RNase Free dH2O)에 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA에 대한 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA 1 ㎕과 각각의 유전자에 대한 primers(Table Ⅰ)를 PreMix PCR tube에 넣고 초기 denaturation(94℃에서 5분) 후에, 증폭을 위해 94℃에서 1분, 55～59℃에서 1분, 72℃에서 1분의 주기를 각각의 유전자의 특성에 따라 30～38주기 시행하였다. PCR 산물은 2% agarose gel 상에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV light 하에서 densitometer(Vilber Lourmat, France)를 이용하여 relative intensity를 측정하였다.
각각의 시료에서 세포질 내에서 활성화된 NF-κB의 핵 내부로의 이동(translocation) 여부를 알아보기 위해 mouse monoclonal NF-κB p65(F-6) antibody(Santacruz, sc-8008)를 1차 항체로 사용하고, 2차 항체로는 goat anti-mouse IgG Rhodamine-conjugate antibody(Invitro-gen, USA)를 사용하여 공초점 현미경(Zeiss, Germany)을 통하여 관찰하였다. 핵은 DAPI로 염색하여 관찰하였다. 관찰된 형광이미지를 세포질과 핵질로 구분하여 NF-κB의 intensity ratio를 Zeiss image analy-sing program(Germany)으로 정량화하여 비교하였다.

대상 데이터

THP-1 세포주에 중간 정도의 세포독성을 나타내는 농도를 선정하여, 1 ㎍/㎖의 LPS, 10 ㎍/㎖의 DPE, 5 ㎍/㎖의 DNCB, 1 ㎍/㎖의 CP를 실험에 사용하였다. 이는 고농도에서의 세포사멸을 막고, 저농도에서의 반응저하를 피하기 위해 적당한 농도를 선정하였다.
계대배양 과정에서는 10% FBS 조건을 유지하였다. THP-1을 분화시키기 위하여 Phorbol-myristateacetate(PMA; Sigma, St Louis, USA)를 사용하였다.
면역 반응 유발물질 처리 후 PMA에 의해 분화된 THP-1 세포에서 분비된 TNF-α 양을 측정하기 위한 ELISA kit은 Koma Biotech(Korea) 제품을 사용하였다.
면역 반응 유발물질로 알려져 있는 lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma (St Louis, USA)에서, 먼지진드기 추출물 dermatophagoides pterony-ssus crude extract(DPE)는 Cosmo Bio(Japan)에서, 화학물질인 dini-trochlorobenzene(DNCB)은 Fisher Scientific(USA)에서 구입하였다. CP는 막자사발을 이용하여 분말을 만들어 100 ㎎을 칭량하여 1 ㎖의 dimethylsulfoxide(DMSO)로 용해한 후 실온에서 2시간 동안 전탕하여 4000 RPM에 10분간 원심분리하였다.
실험에 사용한 인간 단핵구 세포주인 THP-1은 한국세포주연구재단(KCLB, Korea)에서 구입하였으며, RPMI 1640에 10% fetal bovine serum(FBS), 100 U/㎖ penicillin과 100 ㎍/㎖ streptomycin을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 배양액은 2일 마다 교환해 주었으며, 계대배양은 배양 중인 세포들이 플라스크의 80% 정도 자랐을 때 각 세포주의 기본 배지로 수세한 후 새로운 플라스크에 분주하였다.
실험에서 사용한 선퇴(CP)는 허브팜에서 구입하였고, 신흥무역에서 중국으로부터 2005년 12월 22일 검사하여 수입한 것을 구입하여 사용하였다.
性은 寒하고 質이 輕하여 肺와 肝經에 들어가 肺經의 風熱을 宣散하여 解表透疹에 효능이 있고, 또한 肝經에 들어가 凉肝息風시켜 止痙退翳의 효능이 있어 風疹瘙痒의 증에 많이 응용된다⁹⁾. 아토피 피부염에 효과적이라 연구된 淸肌散, 加味敗毒散, 消風散 등에 포함되어 있어 아토피 피부염의 원인인 風, 濕, 熱을 효과적으로 치료할 것이라고 생각되어 약재 선정을 하였다.

이론/모형

THP-1에서 다양한 사이토카인의 유전자 발현을 조절하는 전사조절인자인 NF-κB의 세포질에서 핵으로의 이동을 면역형광 세포조직화학적 염색 방법(immunofluorescent cytochemistry)으로 관찰하였다(Fig. 5).
THP-1에서 전사조절인자인 NF-κB의 세포질에서 핵으로의 이동을 면역형광 세포조직화학적 염색 방법(immunofluorescent cytochemistry)으로 관찰하였다.

성능/효과

1. THP-1 세포에 PMA 처리 후 DPE 처리 시에 CP는 TGF-β의 mRNA 발현을 증가시켰으나, TNF-α와 MCP-1의 mRNA 발현을 감소시켰다.
2. THP-1에 PMA, LPS, CP를 처리한 경우에는 PMA와 LPS를 처리 한 경우보다 TNF-α의 분비량이 현저히 증가하였다.
3. THP-1에 다양한 면역반응 유발물질과 CP를 처리하였을 때, 전형적인 구형의 단핵구 세포들이 시간 경과에 따라 집합되고 세포돌기를 갖춘 대식세포로의 변화가 관찰되었다.
4. THP-1에서 CP는 PMA, LPS를 동시에 처리한 경우에 NF-κB의 이동을 현저하게 증가시켰다.
CP는 대식세포에 영향으로 주어 면역 반응에 변화가 있는 것으로 확인이 되나 각각 LPS, DPE, DNCB로 면역반응이 유발된 상태에서 각각 다른 형태의 결과를 보였다. 유발된 물질에 따라 각기 다른 사이토카인의 mRNA 발현 증감을 보였다.
LPS로 면역 반응이 유발된 경우에는 CP가 TNF-α의 분비량이 증가시켰고, NF-κB의 이동을 증가시켰다. CP는 인간의 THP-1 단핵구에서 사이토카인 유전자들의 발현 양상에 다양한 영향을 미치는 것으로 확인하였으며 면역반응 유발 물질에 대한 다양한 영향도 확인하였다. 각기 다른 부분에 작용하는 영향에 대한 기전에 대해서는 차후 더 깊은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
CP와 면역 반응 유발물질이 THP-1에 각기 다른 유전자 변화와 형태변화를 유도함을 확인하였다.
DNCB에 CP 처리한 경우에는 DNCB만 처리한 경우에 비해 IFN-γ의 mRNA 발현이 감소되었으나 TGF-β의 mRNA 발현이 증가되었다. LPS와 CP를 동시에 처리한 경우에는 LPS만 처리한 경우에 비해 전체적으로 유사한 양상을 보였으나, MCP-1의 mRNA 발현이 다소 감소되는 양상이 관찰되었다(Fig. 2).
PMA, DPE, CP를 동시에 처리한 경우에는 PMA와 DPE를 처리한 경우보다 NF-κB의 이동이 감소하였다(Fig. 6).
PMA, LPS, CP를 동시에 처리한 경우에는 PMA, LPS에 의해 유발되는 TNF-α의 분비량에 비해 현저히 증가하였다(Table Ⅲ).
PMA와 DPE를 동시에 처리하였을 때와 PMA, LPS, CP를 동시에 처리한 경우에 NF-κB의 이동이 현저하게 증가하였다.
PMA와 DPE를 동시에 처리하였을 때와 PMA, LPS, CP를 동시에 처리한 경우에 NF-κB의 핵으로의 이동이 현저하게 증가함을 알 수 있으며, NF-κB가 작용하는 것을 확인할 수 있었다.
PMA와 DPE를 동시에 처리한 경우에는 PMA에 의해 유발되는 TNF-α의 분비량보다 현저하게 감소되었으나, PMA와 DNCB를 동시에 처리한 경우에는 PMA에 의해 유발되는 TNF-α의 분비량보다 증가하였다.
PMA와 LPS 처리 시 증가하는 TNF-α의 분비량은 CP를 동시에 처리한 경우에 현저히 증가하였다.
THP-1 세포를 PMA처리 한 후에 DPE와 CP를 동시에 처리한 경우에는 DPE만을 처리한 경우에 비해 TGF-β의 mRNA 발현이 증가되었으나, TNF-α와 MCP-1의 mRNA 발현은 감소되는 양상을 나타내었다.
THP-1 세포주를 PMA처리를 하여 대식세포로 분화시키는 과정에서 DPE, DNCB, LPS 각각과 CP를 추가로 동시에 처리한 경우에 나타나는 사이토카인 유전자들의 변화 양상을 살펴보면, PMA와 DPE 처리 상태에서 CP는 TGF-β의 mRNA 발현을 증가시켰으나, TNF-α와 MCP-1의 mRNA 발현을 감소시키는 양상을 나타내었다.
THP-1에 10 ng/㎖의 PMA를 처리하여 대식세포로의 분화를 유도하였을 때, 전형적인 구형의 단핵구 세포들이 시간 경과에 따라 집합되고, 세포돌기가 생긴 대식세포로의 변화가 관찰되었으며, LPS를 동시에 처리한 경우에는 48시간에 세포돌기를 갖는 대식세포로의 변화 빈도가 높게 나타났다. 처리한 면역반응 유발물질들에 따라 그 형태적인 변화들이 다양하게 관찰되었다(Fig.
THP-1에 PMA를 처리하여 대식세포로의 분화를 유도하였을 때, 전형적인 구형의 단핵구 세포들이 시간 경과에 따라 집합되고 세포돌기를 갖춘 대식세포로의 변화가 관찰되었으며, 면역반응 유발 물질들과 CP를 같이 처리 하였을 때에도 광학현미경으로 관찰된 형태학적 변화는 주사전자현미경(SEM)을 이용한 미세구조 관찰에서도 다양한 형태로 변화함을 확인하였다(Fig. 4). 이로 인해 면역반응 유발물질과 CP를 처리한 경우에 다양한 유전자 발현을 일으키고 있음을 확인 할 수 있었으며, CP가 대식세포의 면역반응에 영향을 주고 있음을 확인 할 수 있다.
THP-1에서 PMA 처리에 의해 증가되는 TNF-α의 분비량은 DPE 처리 시 감소되었으나, DNCB와 CP를 처리 시에는 TNF-α의 분비량이 48 시간에 2배 정도 증가되었다.
THP-1에서는 IL-8, IL-10, IFN-γ, lymphotoxin(LT)-α, transforming growth factor(TGF)-β, TNF-α, monocyte chemoattractantant protein(MCP)-1 등의 발현이 관찰되었으며, THP-1에 10 ng/㎖의 PMA를 처리하여 대식세포로의 분화를 유도하였을 때, IL- 1α의 발현이 유발되었으며, IL-10, IFN-γ, LT-α TGF-β, TNF-α, MCP-1, IL-8, IFN-γ, TGF-β, TNF-α, MCP-1 등의 mRNA 발현이 다소 증가되었다.
각각의 시료에서 배양액으로 분비된 TNF-α을 효소결합 면역흡착분석법(ELISA)으로 측정하기 위해 실험 과정에서 배양액을 수획하여 측정 전까지 -70℃에서 보관하였다.
광학현미경으로 관찰된 형태학적 변화는 주사전자현미경(SEM)을 이용한 미세구조 관찰에서도 다양한 형태로 변화함을 확인하였다(Fig. 4).
4). 이로 인해 면역반응 유발물질과 CP를 처리한 경우에 다양한 유전자 발현을 일으키고 있음을 확인 할 수 있었으며, CP가 대식세포의 면역반응에 영향을 주고 있음을 확인 할 수 있다. 하지만 각각 다른 형태에 대한 추가적인 연구는 필요할 것으로 사료된다.
이상의 결과를 바탕으로 선퇴추출물인 CP는 인간의 THP-1 단핵구에서 사이토카인 유전자들의 발현 양상에 다양한 영향을 미치는 것으로 확인하였으며 면역반응 유발 물질에 대한 다양한 영향도 확인하였다.
인간 단핵구 세포주인 THP-1에 면역 반응 유발물질인 LPS(0, 0.1, 1, 10 ㎍/㎖), DPE(0, 1, 10, 50 ㎍/㎖), DNCB(0, 1, 5, 20 ㎍/㎖), CP(0, 0.1, 1 , 1 0 ㎍/㎖) 등 을 처 리 한 결과, 저농도에서 77~93%, 중간 농도에서 65~78%, 고농도에서 45~61%정도의 세포가 증식하는 독성을 나타내었다(Table Ⅱ). 본 연구에서는 세포가 증식하는 중간 정도의 독성을 나타내는 농도를 선정하여, 1 ㎍/㎖의 LPS, 10 ㎍/㎖의 DPE, 5 ㎍/㎖의 DNCB, 1 ㎍/㎖의 CP 등을 실험에 사용하였다.

후속연구

CP는 인간의 THP-1 단핵구에서 사이토카인 유전자들의 발현 양상에 다양한 영향을 미치는 것으로 확인하였으며 면역반응 유발 물질에 대한 다양한 영향도 확인하였다. 각기 다른 부분에 작용하는 영향에 대한 기전에 대해서는 차후 더 깊은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이는 NF-κB가 아닌 다른 경로에서의 TNF-α의 분비가 감소가 된 것으로 보이며 차후 더 깊은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이로 인해 면역반응 유발물질과 CP를 처리한 경우에 다양한 유전자 발현을 일으키고 있음을 확인 할 수 있었으며, CP가 대식세포의 면역반응에 영향을 주고 있음을 확인 할 수 있다. 하지만 각각 다른 형태에 대한 추가적인 연구는 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

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	아토피 피부염의 병인은 무엇인가?	아토피 피부염은 심한 소양감을 동반하는 만성, 재발성의 피부염증을 특징으로 하는 질환으로4,5), 주로 유․소아기에 발병하며, 후에 기관지 천식이나 알레르기성 비염 등이 발생하게 되는 경우가 많다. 정확한 병인은 알려져 있지 않지만 유전적 배경부터 음식에 대한 알레르기, 면역학적 이상, 피부장벽의 이상, 환경적 사회적 인자 및 심리적 연관성 등이 제기되고 있으며, 그 중에서도 면역학적인 장애는 Th2 림프구의 활성화로 알려져 있으며 급성기에 피부림프구항원을 높게 발현하는 CD4(+) 기억/작동 Th2 세포의 현저한 혈관주위의 침윤, 병변부위의 Th2 사이토카인의 분비증가와 IL-4에 대한 말초혈액 단핵구의 고반응성 등을 특징적으로 보인다. 환자의 말초 혈액은 Th2 표현세포가 증가되어 있고 Th1 표현세포는 감소되어 있으며, IL-13의 표현이 증가되어 있어 전신적인 Th2 환경이다.
	아토피 피부염이란 무엇인가?	아토피 피부염은 심한 소양감을 동반하는 만성, 재발성의 피부염증을 특징으로 하는 질환으로4,5), 주로 유․소아기에 발병하며, 후에 기관지 천식이나 알레르기성 비염 등이 발생하게 되는 경우가 많다. 정확한 병인은 알려져 있지 않지만 유전적 배경부터 음식에 대한 알레르기, 면역학적 이상, 피부장벽의 이상, 환경적 사회적 인자 및 심리적 연관성 등이 제기되고 있으며, 그 중에서도 면역학적인 장애는 Th2 림프구의 활성화로 알려져 있으며 급성기에 피부림프구항원을 높게 발현하는 CD4(+) 기억/작동 Th2 세포의 현저한 혈관주위의 침윤, 병변부위의 Th2 사이토카인의 분비증가와 IL-4에 대한 말초혈액 단핵구의 고반응성 등을 특징적으로 보인다.
	면역계는 무엇으로 나눌 수 있는가?	인체의 면역계는 인체에 해가 될 수 있는 세균, 박테리아, 기생충 등의 외부로부터 침입을 방어하는 것을 목표로 하고 있다. 면역계를 크게 나누면 자연면역과 특이면역으로 나눌 수 있는데, 자연면역은 외부 침입에 대한 1차 방어를 담당하고, 특이면역은 자연면역만으로는 해결할 수 없는 상황을 대비하여 존재하는 것으로 볼 수 있다. 대부분의 외부 물질은 피부와 점막표면을 통해 들어오기 때문에 대부분의 감염은 피부점막표층에서 일어나는데 피부점막 면역은 자연면역이 어느 인체부위보다도 고도로 잘 발달되어 있다1).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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