갈조류 유래 alginate 성분은 간이식술에 있어서 cell microencapsulation시키는 matrix로써 임상적인 응용이 시도되고 있다. 이에 본 연구에서는 alginate의 간세포에 대한 안전성을 평가하기 위하여, 간세포를 자극하는 NO, iNOS, TGF-${\beta}1$, IL-$1{\beta}$의 분비 및 발현량을 측정하였으며, 실험 결과 모두 증가시켰다. Alginate가 간세포를 자극하여 이러한 요소들을 증가시키는 것은 간염 및 간섬유화 등의 간질환을 일으킬 수 있다는 가능성을 제시하고 있으며, 이러한 결과는 간에 적용하는 alginate를 사용시에는 안전성이 요구되는 농도 조절 및 alginate의 자극 효과를 억제할 수 있는 새로운 재료의 첨가 등에 대한 고려를 제시할 수 있을 것으로 사료된다.
갈조류 유래 alginate 성분은 간이식술에 있어서 cell microencapsulation시키는 matrix로써 임상적인 응용이 시도되고 있다. 이에 본 연구에서는 alginate의 간세포에 대한 안전성을 평가하기 위하여, 간세포를 자극하는 NO, iNOS, TGF-${\beta}1$, IL-$1{\beta}$의 분비 및 발현량을 측정하였으며, 실험 결과 모두 증가시켰다. Alginate가 간세포를 자극하여 이러한 요소들을 증가시키는 것은 간염 및 간섬유화 등의 간질환을 일으킬 수 있다는 가능성을 제시하고 있으며, 이러한 결과는 간에 적용하는 alginate를 사용시에는 안전성이 요구되는 농도 조절 및 alginate의 자극 효과를 억제할 수 있는 새로운 재료의 첨가 등에 대한 고려를 제시할 수 있을 것으로 사료된다.
Alginates are polysaccharides isolated from brown algae with gel-forming properties composed of 1,4-linked beta-D-mannuronic acid (M), alpha-L-guluronic acid (G), and alternating (MG) blocks. In this study, we have examined the toxic effects of high M-alginate to activate HepG2 human liver cells. Al...
Alginates are polysaccharides isolated from brown algae with gel-forming properties composed of 1,4-linked beta-D-mannuronic acid (M), alpha-L-guluronic acid (G), and alternating (MG) blocks. In this study, we have examined the toxic effects of high M-alginate to activate HepG2 human liver cells. Alginate enhanced the NO production and iNOS protein expression in HepG2 cells. In addition, alginates stimulated the HepG2 to induce IL-1 release and expression of TGF-beta1, which could influence the liver inflammation and chirrhosis. These findings suggest that high M-alginate form brown algae may have toxic effects on liver cells.
Alginates are polysaccharides isolated from brown algae with gel-forming properties composed of 1,4-linked beta-D-mannuronic acid (M), alpha-L-guluronic acid (G), and alternating (MG) blocks. In this study, we have examined the toxic effects of high M-alginate to activate HepG2 human liver cells. Alginate enhanced the NO production and iNOS protein expression in HepG2 cells. In addition, alginates stimulated the HepG2 to induce IL-1 release and expression of TGF-beta1, which could influence the liver inflammation and chirrhosis. These findings suggest that high M-alginate form brown algae may have toxic effects on liver cells.
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문제 정의
그러나 해조에서 추출되는 alginate는 mannuronic acid부위에 -O acetyl기를 가지고 있지 않아 구조적인 면에서 미생물이 생산하는 alginate와는 또 다른 새로운 면역학적 효과가 기대된다. 따라서 본 연구에서는 국내 자원이 풍부하여 고부가가치의 기능성 소재로 인식되고 있는 해조류 유래 alginate에 대한 효능 연구를 진행하기로 하였다.
, 1998), NO는 간질환을 유발하는 second messenger로서의 역할도 보고되고 있다(Hartsfield, 2002). 본 연구에서는 alginate 가 HepG2 간세포에 영향을 미치는 독성효과를 알아보기 위하여 NO 및 iNOS 조절을 측정하였는데, 세포독성을 나타내지 않는 농도 범위에서 NO 분비의 증가와 iNOS의 발현 증가를 나타내었다(Fig 1). NO 및 iNOS의 발현이 농도 의존적으로 증가하였으며, 이는 alginate가 iNOS-NO system을 자극하는 것으로 사료된다.
이에 따라 본 연구는 high-M alginate의 간세포 자극에 대한 독성효과를 확인하고자 human liver cell HepG2 세포를 이용하여 간염증 유발에 주된 역할을 나타내는 NO-iNOS와 IL-1의 증가효과를 확인하고, 간섬유화 진행에 중요한 cytokine인 TGF-β1의 발현을 mRNA 및 단백질 수준에서의 증가 효과를 확인함으로써, high-M alginate의 간세포에 대한 안전성을 평가하고자 하였다.
이에 본 연구에서는 alginate의 간세포에 대한 안전성을 평가하기 위하여, 간세포를 자극하는 NO, iNOS, TGF-β1, IL-1β의 분비 및 발현량을 측정하였으며, 실험 결과 모두 증가시켰다.
제안 방법
Alginate를 Dulbecco’s phosphate buffered saline(D-PBS)(Gibco, Grand Island, NY) 용액에 완전히 녹여 0.22 ㎛ filter에 여과하여 100, 10, 1 ㎍/ml 농도로 만들었다.
Alginate를 농도별로 처리하고 20시간 배양한 HepG2 상층액을 모아서 Interleukin-1[(h)IL-1] human, ELISA system(Amersham Life Science, England)을 이용하여 IL-1β의 분비량을 측정하였다.
HepG2 간세포의 독성 정도를 측정하기 위하여 alginate의 처리에 의해 간세포가 분비하는 nitric oxide의 생성량을 측정하였다. HepG2를 96 well plate에 4×104/well이 되도록 분주하고 alginate를 농도별로 20시간 처리하였다.
TRIzol reagent(Invitrogen Co., Carlsbad, CA)를 이용하여, total RNA를 세포로부터 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리된 total RNA를 정량한 뒤, 다음과 같은 TGF-beta1(TGF-beta1, sense: GCCCTGGACACCAAC TATTGCT, antisense: AGGCTCCAAATGTAGGGGCAGG)의 primer를 이용하여 RT-PCR를 실시하였다.
다시 3회 이상 세척 후에 detection reagent(Amersham™)를 가한 후 Kodak scientific imaging film(Biomax Light)에 노출 시켜 각 protein의 발현량을 확인하였다.
본 연구에서는 NO-iNOS system을 자극하는 alginate가 IL-1β 분비 조절에도 관여하는지와 이들의 상관 관계를 알아보고자 IL-1β를 측정하였으며, Fig. 3에서 나타낸 바와 같이 IL-1β를 유의적으로 증가시켰다.
, Carlsbad, CA)를 이용하여, total RNA를 세포로부터 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리된 total RNA를 정량한 뒤, 다음과 같은 TGF-beta1(TGF-beta1, sense: GCCCTGGACACCAAC TATTGCT, antisense: AGGCTCCAAATGTAGGGGCAGG)의 primer를 이용하여 RT-PCR를 실시하였다. 먼저 1 ㎍ total RNA, 1 mM dNTP mix, 50 ng/ml Oligo(dT)12-18, DEPC-treated water를 10 ㎕가 되도록 혼합하였으며 65℃에서 5분간 반응한 후 4℃에서 2분간 방치하였다.
그 다음 1 ㎕(50 units)의 SuperScript™ II RT를 첨가한 후 42℃에서 50분간 추가 반응시킨 다음 70℃ 에서 15분간 방치하여 반응을 종료하였다. 여기에 1 ㎕의 RNase H를 각 시료에 첨가하고 37℃에서 20분간 반응하여 template mRNA를 제거하였으며, 생성된 cDNA mixture의 2 ㎕를 PCR 반응에 이용하였다. 이때 각각의 RT-PCR에서 동량의 RNA가 사용되었음을 확인하기 위하여 house keeping gene인 β-actin에 대한 RT-PCR을 함께 진행하였다.
이때 각각의 RT-PCR에서 동량의 RNA가 사용되었음을 확인하기 위하여 house keeping gene인 β-actin에 대한 RT-PCR을 함께 진행하였다.
이어 streptavidine-HRP 용액 100 ㎕를 넣고 실온에서 30분간 방치한 다음 TMB substrate 용액 100 ㎕를 추가하여 반응시킨 후 정지용액을 넣고 450nm에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 작성하여 IL-1β 농도를 산출하였으며, 세 번 반복실험을 실시하였다.
대상 데이터
HepG2(human hepatocellular carcinoma) 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 구입하여, 10% FBS, 2% penicillin-streptomycin (10,000 U pen/㎖, 10,000 ㎍ strep/㎖)을 첨가한 DMEM(GIBCO BRL, Grand Island, NY) 성장배지에 부착 배양하였으며 37℃, 5% CO2 조건을 유지하였다. Alginat는 Macrocystis pyrifera(Kelp)에서 추출한 sodium salt 형태로(Sigma, A0682) anhydro-β-D-mannuronic acid residue(1→4)를 가진 친수성 콜로이드 형태의 polyuronic acid이다.
22 ㎛ filter에 여과하여 100, 10, 1 ㎍/ml 농도로 만들었다. 사용된 시약들은 특별한 언급이 없으면 모두 Sigma사(St Louis, MO)에서 구입하였다.
데이터처리
실험 결과는 3회 반복하였으며, 가장 대표적인 실험결과를 평균 ± 평균오차(mean ± S.E.)로 나타내었고, 유의 수준은 * p<0.05와 ** p<0.01로 Student t’-test를 실시한 결과를 표시하였다
이론/모형
HepG2 세포를 lysis하여 30 ㎍의 단백질을 얻은 후, Bradford’s protein assay법으로 단백질을 정량하였다(Bradford, 1976).
성능/효과
, 1985). 위의 연구들을 종합해보면, alginate가 가지는 D-mannuronic acid 부위는 면역증강작용을 나타낼 가능성이 매우 크다.
후속연구
이에 본 연구에서는 alginate의 간세포에 대한 안전성을 평가하기 위하여, 간세포를 자극하는 NO, iNOS, TGF-β1, IL-1β의 분비 및 발현량을 측정하였으며, 실험 결과 모두 증가시켰다. Alginate가 간세포를 자극하여 이러한 요소들을 증가시키는 것은 간염 및 간섬유화 등의 간질환을 일으킬 수 있다는 가능성을 제시하고 있으며, 이러한 결과는 간에 적용하는 alginate를 사용시에는 안전성이 요구되는 농도 조절 및 alginate의 자극 효과를 억제할 수 있는 새로운 재료의 첨가 등에 대한 고려를 제시할 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Alginate는 성분비율에 따라 무엇이 달라지는가?
Alginate는 성분비율에 따라 물성-특히 viscosity가 달라진다. 해조에서 추출한 alginate도 추출하는 시기나 종(species)에 따라서, 또는 동일한 종이라도 부위별에 따라서 추출물의 특성이 달라지기 때문에 β-(1→4)-D-mannosyluronic acid(M)와 α-(1→4)-L- gulosyluronic acid(G)의 함량 정도에 따라서 크게 high-G alginate와 high-M alginate, MG-alginate로 분류하고 있다.
Sodium alginate란 무엇인가?
Sodium alginate(이하 alginate)는 β-1,4-linked D-mannuronic acid와 α-1,4-L-guluronic acid가 선상 중합체로 되어 있는 polysaccharide로 주로 미생물이나 해양조류에서 얻어진다. 미생물로부터 얻어지는 polysaccharide가 생체의 면역기능을 증강시키거나 억제된 면역 기능을 정상으로 회복시킴으로써 면역조절작용을 나타낸다는 것은 많은 연구결과에 의하여 밝혀진 바 있다(Seljelid et al.
Alginate는 β-(1→4)-D-mannosyluronic acid(M)와 α-(1→4)-L- gulosyluronic acid(G)의 함량 정도에 따라서 무엇으로 분류하는가?
Alginate는 성분비율에 따라 물성-특히 viscosity가 달라진다. 해조에서 추출한 alginate도 추출하는 시기나 종(species)에 따라서, 또는 동일한 종이라도 부위별에 따라서 추출물의 특성이 달라지기 때문에 β-(1→4)-D-mannosyluronic acid(M)와 α-(1→4)-L- gulosyluronic acid(G)의 함량 정도에 따라서 크게 high-G alginate와 high-M alginate, MG-alginate로 분류하고 있다.
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