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문제 정의
- 2A). Curcumin을 비롯한 curcuminoid의 정량 분석은 일반적으로 HPLC를 통하여 이루어져 왔으나(20), 본 연구에서는 이들이 공통적으로 황색을 띠고 있음에 착안하여 분광광도계를 이용한 신속한 정량 방법을 시도하였다. PBS에 제조된 curcuminoid 용액을 37℃ 배양기에 저장하면서 시간에 따른 흡수 스펙트럼의 변화를 조사하였을 때, 이 조건에서 가시광선 파장 전 영역에서 흡광도가 감소하는 것으로 나타났으며 특히 황색과 관계된 400-450 nm 흡광 영역에서의 감소를 확인하였다(Fig.
- 따라서 저장 온도의 증가는 curcuminoid의 화학안정성을 감소시키는 것으로 나타났다. 실제 식품 첨가물로는 정제된 curcumin이 아닌 강황 추출물이나 curcuminoid mixture가 널리 사용되고 있으며 이들의 서로 다른 pH 및 온도에서의 화학안정성을 본 연구에서 확인하였다.
- 5% 잔류하였다. 본 연구는 생리활성 증강의 목적으로 식품 중에 첨가된 curcuminoid가 다양한 가공, 조리 과정을 통해 화학적 변화 및 활성의 변화를 가져올 수 있음을 보여주며, 이와 같은 생리활성 물질의 안정화를 위한 적절한 가공, 조리 방법들이 신중하게 고려되어야 함을 제시하고 있다.
제안 방법
- 이와 같이 curcuminoid는 식품의 가공 및 조리 중에 다양한 방법으로 첨가되고 있으나, 이러한 과정에서 발생할 수 있는 화학안정성 및 생리활성의 변화에 대해서는 거의 연구된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 가능한 가공 및 조리 조건, 특히 고압가열조건에서 curcuminoid mixture를 처리하여 curcumin, DMC 및 BMC 각각에 대한 화학안정성의 변화를 조사하였고, curcuminoid 처리 산물에 대한 항산화 효과를 처리 전과 비교 분석하였다.
- 고압멸균기 내에서의 처리 시간은 승온 및 냉각 시간을 포함하여 총 2시간으로 하였고, 이에 대한 대조구는 37℃ 배양기에서 동일시간(2시간) 동안 보관하여 비교하였다.
- 증류수 또는 50 mM pH 6, 7 또는 8 인산 완충용액에 제조된 40 µM curcuminoid 용액을 고압멸균기를 이용하여 121℃, 1.2 기압에서 15분간 가열하였다.
- 서로 다른 pH 조건에 따른 화학안정성 변화를 측정하기 위하여 pH 6, 7 또는 8로 조정된 1 M 인산 완충용액에 최종 농도가 40 µM이 되도록 curcuminoid 용액을 제조하고 저장시간에 따른 시간별 흡광도의 변화를 405 nm에서 측정하였다.
- Nitric oxide 소거능 측정을 위하여 curcuminoid 용액 50 µL에 100 µM NaNO2 100 µL을 가한 다음, 37℃ 배양기 내에서 1시간 반응시켰다.
- DPPH 라디칼 소거능은 DPPH 라디칼에 대한 시료의 환원력으로 측정하였으며(18), 제조한 curcuminoid 용액 100 µL과 600 µM DPPH methanol 용액 100 µL을 혼합하여 상온의 암소에서 30분간 반응시킨 후 microplate reader(Spectra Max 250, Molecular device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 각 조건에서 처리된 curcuminoid의 항산화 효과는 2,2-diphenyl1-picryl-hydrazyl(DPPH) 라디칼, 2,2'-azobis-(3-ethyl-benz-thiazoline6-sulfonic acid(ABTS) 라디칼 및 nitric oxide에 대한 소거능을 근거로 분석하였다.
- Column은 HPLC packed column C18(4.6 mm ID×150 mm×5 µm, Shiseido, Tokyo, Japan)을 사용하였고, 20 µL를 주입하여 분당 1 mL 유속으로 분석하였다.
- Phosphate-buffered saline(PBS)에 40 µM curcuminoid 용액을 제조한 후 37℃에서 보관하면서 저장시간 경과에 따른 200-600 nm 파장에서의 흡수스펙트럼 변화를 조사하였고(UV-3450, SHIMADZU, Kyoto, Japan), 405 nm의 흡광도에서 curcuminoid의 양이 정량적으로 변화됨을 HPLC 분석결과와 비교하여 확인하였다.
- 처리한 분말은 각각 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 50 mM stock solution을 제조하였고, 이를 다시 40 µM이 되도록 증류수에 희석하여 8시간까지 상온에 저장하면서 화학안정성의 변화를 측정하였다.
- , Seoul, Korea)에서 저장하면서 측정하였다. Curcuminoid의 고압가열처리는 고압멸균기(KMC-1221, Vision Scientific Co., Ltd.)를 사용하여 통상적인 멸균처리조건에서 실시하였다. 증류수 또는 50 mM pH 6, 7 또는 8 인산 완충용액에 제조된 40 µM curcuminoid 용액을 고압멸균기를 이용하여 121℃, 1.
- 고압멸균기 내에서의 처리 시간은 승온 및 냉각 시간을 포함하여 총 2시간으로 하였고, 이에 대한 대조구는 37℃ 배양기에서 동일시간(2시간) 동안 보관하여 비교하였다. 각 조건에서 처리된 curcuminoid 용액은 흡광도 및 항산화능 측정, HPLC 분석시료로 사용하였다. 분말상태에서의 고압가열처리에 대한 영향을 알아보기 위해, 5 mg의 curcuminoid 분말을 1.
- 각 조건에서 처리된 curcuminoid 용액은 흡광도 및 항산화능 측정, HPLC 분석시료로 사용하였다. 분말상태에서의 고압가열처리에 대한 영향을 알아보기 위해, 5 mg의 curcuminoid 분말을 1.5 mL microtube에 분주하여 고압멸균기에서 위와 동일한 조건으로 처리하였으며, 대조구는 동일한 양의 분말을 상온의 암소에서 2시간 보관하였다. 처리한 분말은 각각 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 50 mM stock solution을 제조하였고, 이를 다시 40 µM이 되도록 증류수에 희석하여 8시간까지 상온에 저장하면서 화학안정성의 변화를 측정하였다.
- 분광광도계를 이용한 curcuminoid의 화학안정성 측정을 위하여 저장 시간에 따른 흡광도 변화를 조사하였다. Phosphate-buffered saline(PBS)에 40 µM curcuminoid 용액을 제조한 후 37℃에서 보관하면서 저장시간 경과에 따른 200-600 nm 파장에서의 흡수스펙트럼 변화를 조사하였고(UV-3450, SHIMADZU, Kyoto, Japan), 405 nm의 흡광도에서 curcuminoid의 양이 정량적으로 변화됨을 HPLC 분석결과와 비교하여 확인하였다.
- 6 mm ID×150 mm×5 µm, Shiseido, Tokyo, Japan)을 사용하였고, 20 µL를 주입하여 분당 1 mL 유속으로 분석하였다. 이동상은 THF-water(40:60, v/v)에 1% citric acid를 첨가한 후 농축 KOH를 이용하여 pH 3으로 조정하였으며, 여과와 가스 제거 처리를 하였다. 각 조건에서 처리된 curcuminoid 시료는 처리 직후 이동상과 동량으로 혼합하여 화학 변화를 정지시킨 후, −20℃에서 분석 시까지 보관하였다.
- ABTS 라디칼 소거활성은 Dewanto 등(19)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉 10 mM ABTS와 10 mM potassium persulfate를 각각 7.4:2.6의 비율로 혼합한 후, 37℃의 암소에서 24시간 동안 반응시켜 ABTS 라디칼을 형성하도록 하였다. 이를 PBS로 5배 희석한 용액 150 µL을 curcuminoid 시료 50 µL과 혼합하여 상온의 암소에서 30분간 반응시키고 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Curcuminoid의 화학안정성에 영향을 미치는 조건들을 탐색하기 위하여 서로 다른 pH에서 curcuminoid 용액을 제조하고 37℃ 배양기에 저장하면서 시간에 따라 405 nm에서 흡광도를 측정하여 안정성 변화를 조사하였다(Fig. 3).
- 2B). 대표적 황색 검출파장인 405 nm에서 측정된 황색도가 실제 curcuminoid의 양과 비례하는지 확인하기 위해 여러 농도의 curcuminoid 용액이 405 nm에서 나타내는 흡광도를 측정하고 동일한 시료 용액을 HPLC로 분석하여 얻은 curcuminoid 총량과의 상관관계를 분석하였다. Fig.
- 증류수에 제조된 curcuminoid를 4, 25 및 37℃의 온도에서 저장하고 시간에 따른 흡광도를 405 nm에서 측정하였다(Fig. 3B). 증류수에 희석된 curcuminoid는 pH 6, 7 또는 8의 인산완충용액 (1 M)에 제조된 시료보다 황색도의 감소가 훨씬 지연되었으며(Fig.
- 단순 가열에 의한 curcuminoid 양의 변화가 보고된 바 있으나(22) 실생활에서 식품의 가공, 조리 시의 살균이나 steaming 과정을 고려하였을 때, autoclave를 이용한 고압가열조건도 빈번히 접할 수 있는 환경으로 예상된다. 따라서 본 연구에서는 증류수 및 각 pH별 인산완충용액(50 mM)에서 제조한 curcuminoid에 대하여 1.2기압, 121℃에서 15분간의 일반적인 멸균조건으로 고압멸균기에서 처리한 후 화학안정성 변화를 조사하였다. 고압가열처리는 가열과 냉각 시간을 포함하여 총 2시간 동안 고압멸균기 내에 방치하였으며, 동일한 증류수 또는 각 pH별 인산완충용액에서 2시간 동안 37℃ 배양기에서 저장한 curcuminoid를 대조구로 사용하였다.
- 다양한 온도 및 pH 조건에서 curcuminoid의 안정성이 크게 영향을 받음에 따라 이에 따른 활성의 변화도 수반되는지 알아보기 위해 각 조건에서 처리된 curcuminoid 산물의 DPPH와 ABTS 라디칼, nitric oxide에 대한 소거능을 처리 전과 비교하였다(Fig. 5). 처리 전 fresh curcuminoid(40 µM)는 36.
- 고압가열처리 등에 의한 curcumin, DMC 및 BMC 각각의 화학안정성 변화를 HPLC를 사용하여 분석하였다. 고압가열처리와 37℃ 배양기에서 2시간 동안 보관한 시료의 curcuminoid 양을 HPLC로 분석하였을 때 fresh 시료에 비해 전체적으로 각각 6.
- 생리활성 물질로 알려진 curcuminoid의 다양한 가공조건에서의 화학안정성 및 항산화능의 변화를 조사하였다. Curcuminoid의 화학안정성은 pH와 온도에 의해 크게 영향 받았으며, 온도 및 pH의 증가는 curcuminoid의 황색도 및 화학안정성을 감소시켰다.
- 항산화능 분석에 사용된 curcuminoid는 증류수에 40 µM이 되도록 제조하여 고압가열처리 하거나 2시간 동안 37℃에서 보관하였고, 동일농도의 fresh curcuminoid와 비교하여 활성을 분석하였다.
- 고압가열처리는 가열과 냉각 시간을 포함하여 총 2시간 동안 고압멸균기 내에 방치하였으며, 동일한 증류수 또는 각 pH별 인산완충용액에서 2시간 동안 37℃ 배양기에서 저장한 curcuminoid를 대조구로 사용하였다.
- Scavenging activities of DPPH (A), ABTS (B) radical and nitric oxide (C) by fresh curcuminoid (40 µM), curcuminoid after incubation at 37℃ for 2 hr or autoclave treatment were analyzed.
대상 데이터
- Curcuminoid mixture는 Acros organics(Morris Plans, NJ, USA)사에서 구입하였다. HPLC 이동상으로 사용된 tetrahydrofuran(THF)은 J.
이론/모형
- Curcumin, BMC 및 DMC의 각 curcuminoid에 대한 분석은 HPLC(L-6200, Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan)를 이용한 Pan 등(17)의 방법으로 분석하였다. Column은 HPLC packed column C18(4.
성능/효과
- 본 연구에 사용된 curcuminoid mixture를 현재의 HPLC 조건에서 분석하였을 때 curcumin, DMC, BMC의 순으로 피크가 검출되었고 각각 79.4±2.0, 16.8±0.9 및 3.8±0.7%(w/w)의 비율로 함유되어 있었다(Fig. 2A).
- Fig. 2C에서 나타난 바와 같이 HPLC로 분석한 세 가지 curcuminoid 양과 405 nm에서 측정한 흡광도는 밀접한 상관관계를 가지고 있었으며(R2 = 0.992), 405 nm에서의 흡광도 변화는 총 curcuminoid 양의 변화와 거의 일치함을 확인하였다.
- PBS에 제조된 curcuminoid 용액을 37℃ 배양기에 저장하면서 시간에 따른 흡수 스펙트럼의 변화를 조사하였을 때, 이 조건에서 가시광선 파장 전 영역에서 흡광도가 감소하는 것으로 나타났으며 특히 황색과 관계된 400-450 nm 흡광 영역에서의 감소를 확인하였다(Fig. 2B).
- 인산완충용액 (pH 6, 7, and 8, 1 M)에 희석된 모든 curcuminoid 시료들은 저장 후 2시간 내에 급격히 황색도가 저하되어 파괴되었으며 이후 24시간까지도 점차적으로 감소하였다. Curcuminoid의 화학안정성은 pH가 증가할수록 더욱 감소하였으며, 특히 pH 8에 저장된 curcuminoid는 2시간 이내에 80% 이상 파괴되었다. Curcumin이 산성의 환경에서 안정하다고 보고된 바 있으며(21), 본 연구에서는 curcumin과 DMC, BMC를 포함한 curcuminoid mixture의 화학안정성 또한 pH에 영향받는다는 것을 확인하였다.
- 3B). 증류수에 희석된 curcuminoid는 pH 6, 7 또는 8의 인산완충용액 (1 M)에 제조된 시료보다 황색도의 감소가 훨씬 지연되었으며(Fig. 3A vs. Fig. 3B results at 37℃), 통상적으로 pH 5.5-6.0인 증류수에서의 저장시료가 pH 6 인산 완충염에서의 저장 시료보다 안정한 것으로 보아 pH의 영향뿐만 아니라 인산염 자체도 curcuminoid의 안정성에 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다. 한편 4℃에서 보관한 curcuminoid는 24시간까지 405 nm에서 흡광도의 변화가 거의 없이 안정하였으나, 25℃와 37℃에서 보관한 경우 저장 시간이 증가함에 따라 흡광도의 감소를 보였고 37℃에서 저장 시에 흡광도의 감소가 더욱 두드러졌다.
- 한편 4℃에서 보관한 curcuminoid는 24시간까지 405 nm에서 흡광도의 변화가 거의 없이 안정하였으나, 25℃와 37℃에서 보관한 경우 저장 시간이 증가함에 따라 흡광도의 감소를 보였고 37℃에서 저장 시에 흡광도의 감소가 더욱 두드러졌다. 따라서 저장 온도의 증가는 curcuminoid의 화학안정성을 감소시키는 것으로 나타났다. 실제 식품 첨가물로는 정제된 curcumin이 아닌 강황 추출물이나 curcuminoid mixture가 널리 사용되고 있으며 이들의 서로 다른 pH 및 온도에서의 화학안정성을 본 연구에서 확인하였다.
- 처리 전 fresh curcuminoid(40 µM)는 36.8%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었고, 이를 37℃ 배양기에 저장하였을 때와 고압가열처리 하였을 때 약 10% 정도 활성이 유의적으로 감소하여 각각 33.6과 33.0%의 소거능을 보였다(Fig. 5A).
- 고압가열처리와 37℃ 배양기에서 2시간 동안 보관한 시료의 curcuminoid 양을 HPLC로 분석하였을 때 fresh 시료에 비해 전체적으로 각각 6.3%와 48.9%가 잔류하는 것으로 나타났다(Fig. 6A & B).
- 4B). 따라서 분말상태 curcuminoid가 액상의 경우보다 고압가열처리에 훨씬 안정한 것으로 나타났으며, 열처리를 거치는 가공식품 등에 첨가할 경우 분말상태의 첨가가 바람직할 것으로 사료된다.
- 5B). 각 처리 후 curcuminoid의 DPPH와 ABTS 라디칼에 대한 소거능은 fresh curcuminoid에 비해 더 낮은 활성을 나타내었으며, ABTS 라디칼 소거능이 DPPH 라디칼에 비하여 더 큰 활성의 감소를 보였다. Curcuminoid의 nitric oxide 소거능은 DPPH와 ABTS와는 달리 열처리에 의해 활성이 약간 증가하는 경향을 보였으나 전체적으로 10% 이하의 매우 미미한 활성을 나타내었다(Fig.
- 각 처리 후 curcuminoid의 DPPH와 ABTS 라디칼에 대한 소거능은 fresh curcuminoid에 비해 더 낮은 활성을 나타내었으며, ABTS 라디칼 소거능이 DPPH 라디칼에 비하여 더 큰 활성의 감소를 보였다. Curcuminoid의 nitric oxide 소거능은 DPPH와 ABTS와는 달리 열처리에 의해 활성이 약간 증가하는 경향을 보였으나 전체적으로 10% 이하의 매우 미미한 활성을 나타내었다(Fig. 5C). 제시된 결과는 고압가열처리 시 대부분의 curcuminoid 양이 감소하는데 반해, 항산화능은 크게 감소하지 않으며 열처리에 의한 curcuminoid 변환 산물들도 상당한 항산화능을 가지고 있음을 시사한다.
- 5C). 제시된 결과는 고압가열처리 시 대부분의 curcuminoid 양이 감소하는데 반해, 항산화능은 크게 감소하지 않으며 열처리에 의한 curcuminoid 변환 산물들도 상당한 항산화능을 가지고 있음을 시사한다. 열에 의한 curcuminoid의 변환 산물의 종류와 활성에 대하여 차후 계속적인 관련 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 6C). 고압가열처리 후 각 curcuminoid 잔류량을 HPLC로 분석한 결과, curcumin은 99% 이상 파괴되어 0.7%만이 검출되었고, 반면 DMC와 BMC는 각각 6.8%와 16.5%가 잔류하는 것으로 나타났다(Fig. 6C). 이상의 결과에서 DMC 및 BMC와 비교하였을 때 curcumin이 고압가열처리에 가장 민감한 것으로 나타났다.
- 6C). 이상의 결과에서 DMC 및 BMC와 비교하였을 때 curcumin이 고압가열처리에 가장 민감한 것으로 나타났다.
- 생리활성 물질로 알려진 curcuminoid의 다양한 가공조건에서의 화학안정성 및 항산화능의 변화를 조사하였다. Curcuminoid의 화학안정성은 pH와 온도에 의해 크게 영향 받았으며, 온도 및 pH의 증가는 curcuminoid의 황색도 및 화학안정성을 감소시켰다. 특히 일반적인 멸균조건(121℃, 1.
- 하지만 분말상태 curcuminoid 시료의 고압가 열처리 시는 10% 미만의 감소가 있었다. 고압가열처리 후 curcumonoids의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능은 각각 10.3 및 33.4%의 활성 감소를 보였으며, nitric oxide 소거능은 약간 증가하였다. 고압가열처리 후 각 curcuminoid의 잔류량의 분석 결과, curcumin이 99% 이상 감소하여 고압가열처리에 가장 민감한 것으로 나타났고 BMC는 16.
- 4%의 활성 감소를 보였으며, nitric oxide 소거능은 약간 증가하였다. 고압가열처리 후 각 curcuminoid의 잔류량의 분석 결과, curcumin이 99% 이상 감소하여 고압가열처리에 가장 민감한 것으로 나타났고 BMC는 16.5% 잔류하였다. 본 연구는 생리활성 증강의 목적으로 식품 중에 첨가된 curcuminoid가 다양한 가공, 조리 과정을 통해 화학적 변화 및 활성의 변화를 가져올 수 있음을 보여주며, 이와 같은 생리활성 물질의 안정화를 위한 적절한 가공, 조리 방법들이 신중하게 고려되어야 함을 제시하고 있다.
- 각 curcuminoid의 잔류량을 조사하였을 때, 37℃ 배양기에서 2시간 보관한 시료에서 curcumin, DMC, BMC는 fresh 시료와 비교하여 각각 49.6, 48.8 및 31.7%가 잔류하는 것으로 나타났다(Fig. 6C).
후속연구
- 제시된 결과는 고압가열처리 시 대부분의 curcuminoid 양이 감소하는데 반해, 항산화능은 크게 감소하지 않으며 열처리에 의한 curcuminoid 변환 산물들도 상당한 항산화능을 가지고 있음을 시사한다. 열에 의한 curcuminoid의 변환 산물의 종류와 활성에 대하여 차후 계속적인 관련 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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