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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 건조 수산물의 위생화를 위하여 시판되고 있는 진미채, 건멸치, 건톳, 건홍합 및 마른김의 오염미생물을 평가하고 감마선 조사에 의한 미생물 사멸 효과를알아보았다.
가설 설정
- 1) Viable colony was not detected at detection limit < 101 CFU/g.
제안 방법
- 3 〃L (20 pmol)를 취하여 premix (Bioneer, Daejon, Republic of Korea)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행조건은 PC-808 (ASTEC, Fukuoka, Japan) 을 사용하여 denaturatione 94 ℃ 에서 30초, annealinge 50℃ 에서 30초, extensione 72℃에서 1분씩 총 30회를 반복 실시하고 마지막으로 72 ℃ 에서 3분간 last extension을 실시하였다. PCR 증폭산물의 확인을 위하여 1.
- PCR 수행조건은 PC-808 (ASTEC, Fukuoka, Japan) 을 사용하여 denaturatione 94 ℃ 에서 30초, annealinge 50℃ 에서 30초, extensione 72℃에서 1분씩 총 30회를 반복 실시하고 마지막으로 72 ℃ 에서 3분간 last extension을 실시하였다. PCR 증폭산물의 확인을 위하여 1.2% (w/v) agarose gel을 이용하여 전기영동장치 (Advance, Tokyo, Japan)로 분석하였다. Agarose 1.
- 각 시료를 멸균 식염수에 희석하여접종한 다음 30℃에서 48시간 배양한 후 생성된 colony를 취하여 순수 분리하였다. 각 건조수산물에서 30개 이상의 순수분리된 균주들을 수거하여 16S rDNA 분석을 이용한 균주 동정을 하였다. PCR에 사.
- 각각의 건조 수산물 내의 미생물로부터 확보한 PCR product 는 정제한 후 염기서열의 확인을 통해 세균 동정과 함께 건조수산물 내 오염 미생물의 군집을 조사하였다. 이때 확인된염기서열은 NCBI의 Blast search를 통하여 유사도가 높은 gene 을 검색한 결과, 시료에 따라 서로 다른 오염 미생물이 동정되었다 (Table 2).
- 시험 균주로는 각각의시료 내의 오염 미생물 동정 결과 각 시료에서 검출된 미생물을 대상으로 접종시험을 진행하였다. 각각의 미생물들은 이들이 접종된 tryptic soy agar (Difco Laboratories, Sparks, MD, US A) 에서 1 백금이를 취해 같은 tryptic soy broth (Difco Laboratories) 10 2에 접종하여 24시간 배양시킨 배양액 0.1 mL를 취해 새로운 배지 10 血에 접종하여 18시간 동안 2차배양한 후 그 배양액을 실험에 사용하였다. 균주 접종 시 배양배지에서 오는 오차를 줄이기 위해 2차 배양액을 원심분리 (698.
- 감마선 조사는 한국원자력연구원 방사선과학연구소 (Jeongeup, Republic of Korea) 내 선원 11.1 PBq, Co-60 감마선조사시설 (point source AECL, IR-79, MDS Nordion International Co. Ltd., Ottawa, ON, Canada)을 이용하여 시간당 10 kGy의선량율로 각각 0, 1, 3 및 5 kGy의 총 흡수선량을 얻도록 하였다. 동정된 미생물의 감마선 감수성 평가를 위해서는 0, 0.
- 감마선 조사한 건조 수산물의 미생물 오염도를 측정하기위하여 시료 10 g에 멸균된 식염수 (0.85% NaCl) 90 mL를첨가한 다음 혼합하여 10진 희석법으로 희석한 희석 a를 total plate count agar 및 potato dextrose agar (Difco Laboratories, Sparks, MD, USA)에 도말하였다. 미생물의 증식은 표준한천배양방법으로 각각 30℃에서 48 및 120 시간 배 도말후 30-300 개의 집락을 형성한 배지만 계수하여 시료 1 g당 colony forming unit (CFU)로 나타내었다.
- 건조수산물 유래 미생물의 방사선 감수성을 측정하기 위하여 각 시료를 멸균시킨 후 미생물을 접종하였다. 시료는 각각 10 g씩 PE nylon bag에 넣은 다음 함기 포장한 후 40 kGy 선량의 감마선을 조사하여 멸균하였다.
- , Ottawa, ON, Canada)을 이용하여 시간당 10 kGy의선량율로 각각 0, 1, 3 및 5 kGy의 총 흡수선량을 얻도록 하였다. 동정된 미생물의 감마선 감수성 평가를 위해서는 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 및 5 kGy의 총 흡수선량을 얻도록하였다. 흡수선량 확인은 alanine dosimeter (5 mm, Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)를 사용하였다.
- 시료 내 오염 미생물의 유전자를 증폭하기 위해 2종의 PCR primer를 이용하여 실험하였다. 목적 염기서열로는 16S rDNA 를 선정하였다.
- 각 시료를 멸균시킨 후 미생물을 접종하였다. 시료는 각각 10 g씩 PE nylon bag에 넣은 다음 함기 포장한 후 40 kGy 선량의 감마선을 조사하여 멸균하였다. 시험 균주로는 각각의시료 내의 오염 미생물 동정 결과 각 시료에서 검출된 미생물을 대상으로 접종시험을 진행하였다.
- 시료는 각각 10 g씩 PE nylon bag에 넣은 다음 함기 포장한 후 40 kGy 선량의 감마선을 조사하여 멸균하였다. 시험 균주로는 각각의시료 내의 오염 미생물 동정 결과 각 시료에서 검출된 미생물을 대상으로 접종시험을 진행하였다. 각각의 미생물들은 이들이 접종된 tryptic soy agar (Difco Laboratories, Sparks, MD, US A) 에서 1 백금이를 취해 같은 tryptic soy broth (Difco Laboratories) 10 2에 접종하여 24시간 배양시킨 배양액 0.
- 세척은 2회 실시하였다. 실험에 사용된 균주의초기농도는 IoLio1* CFU/mL 수준이 되도록 하였으며 균주를멸균된 시료에 2% (v/w)농도로 접종하였다.
- PCR에 사.용될 template DNA는 Genomic DNA kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 추출하였다.
- Size marker로는 1000 bp DNA ladder (Takara, Shiga, Japan)를 사용하였다. 전기영동이 끝난 후 gel 은 SYBR으로 염색하였으며 증폭된 DNA는 Gel image analyser (Bio-rad, Hercules, CA, USA)로 관찰하였다. 증폭된 PCR product는 PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정제하였으며, 증폭된 DNA 는 SolGent 사 (Daejeon, Republic of Korea)에 sequencing을 의뢰하였다.
- 16S rDNA PCR 분석은 Keyser 등의 논문에기술된 primer로 5' -CCC GCA TCT CTG CAG GAT TCT C-3' 과 5' -CTA ATA CCG CAT AAC GTC TAC G-3' 을사용하였다. 중합효소연쇄반응 용액은 총 20 이며 증류수 19.2 nL, Template DNA 0.5 (100 ng/〃L)와 각각의 primer 는 0.3 〃L (20 pmol)를 취하여 premix (Bioneer, Daejon, Republic of Korea)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행조건은 PC-808 (ASTEC, Fukuoka, Japan) 을 사용하여 denaturatione 94 ℃ 에서 30초, annealinge 50℃ 에서 30초, extensione 72℃에서 1분씩 총 30회를 반복 실시하고 마지막으로 72 ℃ 에서 3분간 last extension을 실시하였다.
- 전기영동이 끝난 후 gel 은 SYBR으로 염색하였으며 증폭된 DNA는 Gel image analyser (Bio-rad, Hercules, CA, USA)로 관찰하였다. 증폭된 PCR product는 PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정제하였으며, 증폭된 DNA 는 SolGent 사 (Daejeon, Republic of Korea)에 sequencing을 의뢰하였다.
대상 데이터
- 5 〃L를 섞어서 gel에 loading하고 100 Volt에서 40분 전기영동 시켰다. Size marker로는 1000 bp DNA ladder (Takara, Shiga, Japan)를 사용하였다. 전기영동이 끝난 후 gel 은 SYBR으로 염색하였으며 증폭된 DNA는 Gel image analyser (Bio-rad, Hercules, CA, USA)로 관찰하였다.
- 이용하여 실험하였다. 목적 염기서열로는 16S rDNA 를 선정하였다. 16S rDNA PCR 분석은 Keyser 등의 논문에기술된 primer로 5' -CCC GCA TCT CTG CAG GAT TCT C-3' 과 5' -CTA ATA CCG CAT AAC GTC TAC G-3' 을사용하였다.
- 실험에 사용된 건조 수산물은 전라북도 정읍에서 시판되고있는 진미채, 건멸치, 건톳, 건홍합 및 마른김을 구입하여 실험에 사용하였다.
- 확보된 염 기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (Blast)와 Ribosomal Database Project II tool (RDP)에 등록되어있는 database를 사용하여 검색하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복 실시하였으며, 얻어진 결과들은 SPSS software (SPSS, 1997)에서 프로그램에 의한 ANOVA test를 이용하여 분산분석을 한 후 Duncan의 다중위검정을 실시하였다.
이론/모형
- 목적 염기서열로는 16S rDNA 를 선정하였다. 16S rDNA PCR 분석은 Keyser 등의 논문에기술된 primer로 5' -CCC GCA TCT CTG CAG GAT TCT C-3' 과 5' -CTA ATA CCG CAT AAC GTC TAC G-3' 을사용하였다. 중합효소연쇄반응 용액은 총 20 이며 증류수 19.
- 흡수선량 확인은 alanine dosimeter (5 mm, Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)를 사용하였다. Dosimetry 시스템은 국제원자력기구 (IAEA)의 규격에 준용하여 표준화한후 사용하였으며, 총 흡수선량의 오차는 2% 이내였다.
성능/효과
- 또한 김에서는 방사선에 대한저항성이 강한 것으로 알려진 Dienococcus sp.가 검출되었음을 확인되어, 건조 수산물에 대한 위생화가 절실히 요구되었다. Feldhussen (2000)의 연구논문에 의하면 수산물에서 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Shigella sp.
- Table 3에 나타냈다. 그 결과 미생물의 종류 및 시료에따라 방사선 감수성이 다른 것으로 나타났다. 전체적인 경향을 보았을 때, 진미채, 건톳 및 건홍합이 다른 시료에 비해감마선 저항성이 낮은 것으로 나타났다.
- 26 kGy의값을 가졌다. 또한 건멸치와 건홍합에서 공통적으로 확인된 Staphylococcus eqnormns는 접종된 건조 수산물에 따라 0.59 kGy와 0.30 kGy의 다른 *값이 확인되어졌다. 하지만.
- 내 오염 미생물의 군집을 조사하였다. 이때 확인된염기서열은 NCBI의 Blast search를 통하여 유사도가 높은 gene 을 검색한 결과, 시료에 따라 서로 다른 오염 미생물이 동정되었다 (Table 2). 김을 제외한 모든 시료에서 병원성 미생물인 Staphylococcus sp.
- 전체 유전체 서열은 1999년에 밝혀졌으며 (White et al, 1999), 최근이를 활용하여 발현체 분석연구가 진행되고 있다. 이러한 김에서 유래한 D. radiodwans의 높은 방사선 저항성으로 다른건조 수산물에 비하여 김에서 감마선 조사에 의한 사멸 효과가 떨어지는 것으로 사료된다.
- 그 결과 미생물의 종류 및 시료에따라 방사선 감수성이 다른 것으로 나타났다. 전체적인 경향을 보았을 때, 진미채, 건톳 및 건홍합이 다른 시료에 비해감마선 저항성이 낮은 것으로 나타났다. 진미채에서 동정된 Staphylococcus sp.
- 1에 제시하였다. 진미채 (dried salted squid), 건멸치 (dried Engraulis japonica), 건톳 (dried Hlzikia fusiformis), 건홍합 (dried Mytilus coruscus) 및 김 (dried Porphyra 의일반호기성 미생물 측정 결과 각각 6.29, 4.31, 4.71, 3.40 및 6.59 Log CFU/g이 검출되었으며 감마선 조사에 의해 유의적으로 감소하였다. 그러나 5 kGy 조사처리 시 김의 경우 2.
- 91 Log CFU/g이 검출된 반면 다른 시료는 검출한계 이하로 확인되었다. 효모 및 곰팡이의 경우 진미채, 멸치, 톳, 홍합 및김에서 각각 3.98, 2.57, 4.56, 2.21 및 4.12 Log CFU/g이 검출되었으며 조사에 의해 유의적으로 감소하는 경향을 보였으며, 김을 제외한 모든 시료에서 3 kGy 처리 시 검출한계이하로나타났다. 수산물에서 Listeria sp.
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