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문제 정의
- 본 논문에서는 HPLC/ESI-MS/MS를 이용하여 먹는 물(정수) 중에 잔류하는 의약물질 4종(버지니아마이신, 에리스로마이신, 타이로신 및 시메티딘)을 동시에 분석하는 방법을 확립하였다. 정수에는 염소성분이 다량 존재하는데 ascorbic acid와 sodium thiosulfate anhydrous를 첨가함으로써 시료 채취 후 추가적인 분해나 분석시 방해를 막을 수 있었다.
- 본 논문에서는 먹는물(정수) 중에 잔류하는 마크로라이드계열 약물인 버지니아마이신, 에리스로마이신, 타이로신 등 3종 의약물질과 시메티딘(Fig. 1)을 LC/MS/MS를 사용하여 효과적이고 감도가 좋고 정밀성이 높게 동시에 분석하는 방법(시료전처리 및 기기분석)을 확립하고자 하였다. 지금까지 발표된 문헌들에서는 이들 4종의 의약물질을 물 환경시료에서 동시 분석하는 방법이 발표된 적이 없기 때문에, 확립된 분석법은 먹는물(정수)은 물론이며 하천수 중에 잔류하는 의약물질의 모니터링에 있어서 기여할 것으로 본다.
제안 방법
- 각 의약물질의 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 바탕정수에 표준물질을 소량 첨가함으로 구하였으며 그 절차는 다음과 같다. 먼저, 추정한 검출한계에 해당하는 농도로 표준물질을 각 물질이 검출된 이력이 없는 바탕 정수(n=7)에 소량첨가한 후 확립된 시료전처리방법에 따라서 전처리 한 후 검량선으로부터 농도를 측정하였다.
- 측정한 값으로부터 표준편차(s)를 구하고, 검량선으로부터 얻은 기울기(m) 값을 바탕으로 검출한계(LOD)는 3 s/m, 정량한계(LOQ)는 10 s/m으로 계산하여 구하였다. 계산된 농와 LOQ에 해당하는 농도를 다시 바탕 정수에 소량 첨가 하여 피이크를 확인하였다. 에리스로마이신의 경우 LOD와 LOQ가 1.
- 정수장 시료 중 먹는물(정수)에는 잔류 염소가 존재하여 분석물질의 추출에 방해 또는 분해요소로 작용한다. 따라서 먹는물 중에 잔류하는 염소를 효과적으로 제거하기 위해서 4 L의 무균 채수병에 시료를 채취한 후 즉시 ascorbic acid와 sodium thiosulfate anhydrous를 각각 250 mg/L, 100 mg/L가 되도록 넣어 주었다. 채취한 시료는 4 ℃ 이하가 유지되고 유기용매의 오염이 없는 냉암소에 보관하였다.
- 텐뎀 질량분석기에서 의약물질들의 정량이온과 정성이온들을 얻기 위해서 다음과 같은 절차가 수행되었다. 먼저, ESI 양이온(+) 모드를 사용하여 full scan을 통해서 질량스펙트럼을 얻은 후, 기준이온(base ion)을 선구이온(precursor ion)으로 선택하였다. 선택된 선구이온에 최적의 충돌 에너지(collision energy)를 가함으로써 안정되고 감도 좋은 생성이온(product ion)을 만들어서 정량 및 정성확인에 사용할 수 있었다.
- 각 의약물질의 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 바탕정수에 표준물질을 소량 첨가함으로 구하였으며 그 절차는 다음과 같다. 먼저, 추정한 검출한계에 해당하는 농도로 표준물질을 각 물질이 검출된 이력이 없는 바탕 정수(n=7)에 소량첨가한 후 확립된 시료전처리방법에 따라서 전처리 한 후 검량선으로부터 농도를 측정하였다. 측정한 값으로부터 표준편차(s)를 구하고, 검량선으로부터 얻은 기울기(m) 값을 바탕으로 검출한계(LOD)는 3 s/m, 정량한계(LOQ)는 10 s/m으로 계산하여 구하였다.
- 바탕 정수에서의 농도가 0.1~2.0 ng/mL 되도록 의약물질 표준용액을 소량 첨가한 후, 시료 전처리를 거친 값과 거치지 않은 표준물질 농도의 절대치를 비교 함으로써 절대 회수율을 측정하였다. 세 가지 농도에서 측정한 회수율은 37.
- 시료 분리를 위한 HPLC의 이동상은 20 mM 암모늄아세테이트(pH 6.5)와 아세토나이트릴이었으며 기울기 용리방법을 사용하였는데 초기 유기용매는 5%이었고 3분 동안에 85%로 선형적으로 변화시킨 후 85%에서 6분 동안 유지하였다. 이동상의 유속은 0.
- 이 용리액에 내부표준물질인 터부틸라진(10 µg/mL) 25 µL를 넣고 0.45 µm 여과지에 여과시킨 후 1 mL 갈색 바이알에 옮겨 LC/ESI-MS/MS에 주입하여 분석하였다(Fig. 2).
- 정수 중에 잔류하는 의약물질의 양을 측정하기 위해서, 시료 중에서 농도가 0.005~2.0 ng/mL의 범위가 되도록 표준물질을 바탕 정수에 소량 첨가(spike)하여 시료 전처리 과정을 거친 후 LC/ESI-MS/MS로 분석하였으며 내부표준법을 사용하여 검량선을 작성하였다. 검량선의 범위는 의약물의 정량한계에 따라 다르게 작성되었으며, 0.
- 본 논문에서는 HPLC/ESI-MS/MS를 이용하여 먹는 물(정수) 중에 잔류하는 의약물질 4종(버지니아마이신, 에리스로마이신, 타이로신 및 시메티딘)을 동시에 분석하는 방법을 확립하였다. 정수에는 염소성분이 다량 존재하는데 ascorbic acid와 sodium thiosulfate anhydrous를 첨가함으로써 시료 채취 후 추가적인 분해나 분석시 방해를 막을 수 있었다.
대상 데이터
- 고체상 추출(SPE) 카트리지는 Oasis HLB (Hydrophilic-Lipophilic Balance, 60 mg, 3 cc)로 Waters사(Milford, Massachusetts, USA)의 제품을 사용하였고 vacuum manifold는 Supelco사(Bellefonte, PA, USA)의 제품을 사용하였다. 질소농축기는 Caliper Lifescience사(Seattle, WA, USA)의 TurboVap LV 농축기를 사용하였으며, vortex mixer는 Vision Scientific사(Bucheon, Korea)의 제품을 사용하였다.
- 메탄올과 아세토나이트릴은 J.T. Baker사(NJ, USA)의 HPLC 등급 시약을 사용하였고, 황산은 Junsei사(Tokyo, Japan), 암모늄아세테이트는 Merck사(Darmstadt, Germany) 제품을 사용하였으며, 증류수는 Milli-Q system을 통과한 3차 증류수를 사용하였다.
- 분석물질인 버지니아마이신, 에리스로마이신, 타이로신, 시메티딘은 Sigma-Aldrich사(St Louis, MO, USA)에서 구입하였으며 정제용 내부표준물질(surrogate standard)인 에리스로마이신-2-13C은 Cambridge isotope laboratories사(Andover, MA, USA) 제품을 사용하였고, 내부표준물질로 사용된 터부틸라진은 Fluka사(Seelze, Germany)의 고순도 시약을 사용하였다.
- 원심분리기는 한일과학사(Seoul, Korea)의 Supra 22K를 사용하였으며 Whatman사(Maidstone, UK)의 GF/B glass 여과지와 Life Sciences사(UK)의 실린지 디스크 필터(0.45 µm, 13 mm)를 사용하였다.
- 고체상 추출(SPE) 카트리지는 Oasis HLB (Hydrophilic-Lipophilic Balance, 60 mg, 3 cc)로 Waters사(Milford, Massachusetts, USA)의 제품을 사용하였고 vacuum manifold는 Supelco사(Bellefonte, PA, USA)의 제품을 사용하였다. 질소농축기는 Caliper Lifescience사(Seattle, WA, USA)의 TurboVap LV 농축기를 사용하였으며, vortex mixer는 Vision Scientific사(Bucheon, Korea)의 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 먼저, 추정한 검출한계에 해당하는 농도로 표준물질을 각 물질이 검출된 이력이 없는 바탕 정수(n=7)에 소량첨가한 후 확립된 시료전처리방법에 따라서 전처리 한 후 검량선으로부터 농도를 측정하였다. 측정한 값으로부터 표준편차(s)를 구하고, 검량선으로부터 얻은 기울기(m) 값을 바탕으로 검출한계(LOD)는 3 s/m, 정량한계(LOQ)는 10 s/m으로 계산하여 구하였다. 계산된 농와 LOQ에 해당하는 농도를 다시 바탕 정수에 소량 첨가 하여 피이크를 확인하였다.
이론/모형
- 질량분석기는 전기분무이온화(ESI) 양이온(+) 모드와 MRM (multiple reaction monitoring) 방법을 사용하였으며, capillary voltage는 4 kV, 분무기체(질소)의 온도는 350 ℃, 기체 유량은 10 L/min이었으며, MRM 분석을 위한 이온들은 Table 1에 나타내었다.
성능/효과
- 4종 의약물질 모두가 [M+H]+이 선구이온으로 선택되었는데 시메티딘은 m/z 253, 에리스로마이신은 m/z 734.4, 타이로신은 m/z 917, 버지니아마이신은 m/z 526이었다. 생성이온들 중에서 가장 세기가 큰 이온이 정량이온(quantitation ion)으로 선택되었으며, 차순 크기의 이온들이 확인이온(confirmation ion)으로 선택되어 정성확인을 하는데 사용되었다(Fig.
- 0 ng/mL의 범위가 되도록 표준물질을 바탕 정수에 소량 첨가(spike)하여 시료 전처리 과정을 거친 후 LC/ESI-MS/MS로 분석하였으며 내부표준법을 사용하여 검량선을 작성하였다. 검량선의 범위는 의약물의 정량한계에 따라 다르게 작성되었으며, 0.005-2.0 ng/mL 농도를 작업구간으로 설정하였으며 상관계수(r2)가 0.995이상으로 좋은 직선성을 나타내었다(Table 2).
- 먼저, ESI 양이온(+) 모드를 사용하여 full scan을 통해서 질량스펙트럼을 얻은 후, 기준이온(base ion)을 선구이온(precursor ion)으로 선택하였다. 선택된 선구이온에 최적의 충돌 에너지(collision energy)를 가함으로써 안정되고 감도 좋은 생성이온(product ion)을 만들어서 정량 및 정성확인에 사용할 수 있었다.
- 0 ng/mL 되도록 의약물질 표준용액을 소량 첨가한 후, 시료 전처리를 거친 값과 거치지 않은 표준물질 농도의 절대치를 비교 함으로써 절대 회수율을 측정하였다. 세 가지 농도에서 측정한 회수율은 37.7~118.1%의 값을 나타내었지만, 시메티딘의 경우 대체적으로 낮은 회수율(37.7~48.1%)을 나타내었다. 정밀도를 나타내는 상대표준편차(RSD)는 6.
- 1%)을 나타내었다. 정밀도를 나타내는 상대표준편차(RSD)는 6.6~17.7%로써 낮은 농도이지만 대체적으로 양호한 정밀도를 보여주었다. Table 3에 4종 의약물질의 정수 중의 검출한계와 정량한계, 절대 회수율 및 정밀도를 나타내었다.
- 확립된 분석방법은 감도(5.5~249.7 pg/mL)가 좋고, 정밀도가 높은 방법으로써 정수 중에 잔류하는 의약물질의 효과적인 분석방법이며, 전국의 대표적인 정수장에서 채취한 실제 먹는물을 분석한 결과 모두 정량한계 이하이었다.
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