서로 다른 두 작용기를 이용한 결합법에 의한 접합체: 도파민 면역분석법 Bioconjugation by dual heterobifunctional coupling method: Use of the conjugates for the detection of dopamine원문보기
도파민은 카테콜아민류의 중요한 신경전달물질로서 부족하면 파킨스병과 정신분열증 등을 야기할 수 있다. 그러므로 조작이 비교적 간단하면서 감도가 우수한 분석법의 개발이 필요하다. 이에, 도파민에 대한 경쟁적인 효소면역분석법이 연구되었다. 경쟁적인 면역분석법의 분석감도는 일반적으로 두가지 요소에 의해 조절된다. 하나는 경쟁자의 특성과 농도이며, 다른 하나는 결합체, 즉 항체의 그것이다. 따라서, 경쟁자인 BSA-DA과 결합체인 항체-avidin 접합체의 최적화가 수행되었다. 두 접합체는 SATA와 SMCC를 이용한 dual heterobifunctional coupling법에 의해 합성되었으며, 최적화 과정을 통해 BSA-DA 접합체의 농도는 $6.66\;{\mu}g/mL$, 항체-avidin 접합체의 농도 $4.17{\times}10^{-10}\;M$로 결정되었다. 도파민에 대한 doseresponse curve와 calibration curve의 결과로써 도파민에 대한 검출 한계는 $2.3{\times}10^{-2}\;{\mu}g/mL$ 이고 검출 영역은 $1.0{\times}10^{-3}\;M\sim1.0{\times}10^{-7}\;M$ 이다. 직선성을 갖는 검출영역에서의 검정선을 얻은 결과 [Absorbance = -0.1098 log[DA]+0.0353 ($R^2$ = 0.9956)] 우수한 직선관계를 얻었다.
도파민은 카테콜아민류의 중요한 신경전달물질로서 부족하면 파킨스병과 정신분열증 등을 야기할 수 있다. 그러므로 조작이 비교적 간단하면서 감도가 우수한 분석법의 개발이 필요하다. 이에, 도파민에 대한 경쟁적인 효소면역분석법이 연구되었다. 경쟁적인 면역분석법의 분석감도는 일반적으로 두가지 요소에 의해 조절된다. 하나는 경쟁자의 특성과 농도이며, 다른 하나는 결합체, 즉 항체의 그것이다. 따라서, 경쟁자인 BSA-DA과 결합체인 항체-avidin 접합체의 최적화가 수행되었다. 두 접합체는 SATA와 SMCC를 이용한 dual heterobifunctional coupling법에 의해 합성되었으며, 최적화 과정을 통해 BSA-DA 접합체의 농도는 $6.66\;{\mu}g/mL$, 항체-avidin 접합체의 농도 $4.17{\times}10^{-10}\;M$로 결정되었다. 도파민에 대한 doseresponse curve와 calibration curve의 결과로써 도파민에 대한 검출 한계는 $2.3{\times}10^{-2}\;{\mu}g/mL$ 이고 검출 영역은 $1.0{\times}10^{-3}\;M\sim1.0{\times}10^{-7}\;M$ 이다. 직선성을 갖는 검출영역에서의 검정선을 얻은 결과 [Absorbance = -0.1098 log[DA]+0.0353 ($R^2$ = 0.9956)] 우수한 직선관계를 얻었다.
Dopamine (DA) is an important neurotransmitter molecule of catecholamines. Its deficiency could lead to brain disorder such as Parkinson's disease and schizophrenia. Therefore, it is necessary to establish a suitable analytical technique with sensitivity and simplicity. A competitive enzyme-linked i...
Dopamine (DA) is an important neurotransmitter molecule of catecholamines. Its deficiency could lead to brain disorder such as Parkinson's disease and schizophrenia. Therefore, it is necessary to establish a suitable analytical technique with sensitivity and simplicity. A competitive enzyme-linked immunosorbent assay for DA has been optimized and characterized. Assay sensitivity is controlled by two factors in competitive immunoassay. One is a nature and concentration of competitor, and the other is those of binder, antibody. Thus, optimization was performed: BSA-DA conjugate and antibody-avidin conjugate were prepared by dual heterobifunctional coupling method using SATA and SMCC. Assay condition was optimized with $6.66\;{\mu}gmL^{-1}$ of BSA-DA and $4.17{\times}10^{-10}\;M$ of antibody-avidin conjugate. A dose-response curve was constructed, and a limit of detection and a dynamic range for DA were accomplished to $2.3{\times}10^{-2}\;{\mu}g\;mL^{-1}$ and four orders of magnitude ($1.0{\times}10^{-7}\;M$ to $1.0{\times}10^{-3}\;M$), respectively. Calibration curve was constructed on dynamic range and least-squares regression of this data gave the following relationship: absorbance = -0.1098 log[DA]+0.0353 ($R^2$ = 0.9956).
Dopamine (DA) is an important neurotransmitter molecule of catecholamines. Its deficiency could lead to brain disorder such as Parkinson's disease and schizophrenia. Therefore, it is necessary to establish a suitable analytical technique with sensitivity and simplicity. A competitive enzyme-linked immunosorbent assay for DA has been optimized and characterized. Assay sensitivity is controlled by two factors in competitive immunoassay. One is a nature and concentration of competitor, and the other is those of binder, antibody. Thus, optimization was performed: BSA-DA conjugate and antibody-avidin conjugate were prepared by dual heterobifunctional coupling method using SATA and SMCC. Assay condition was optimized with $6.66\;{\mu}gmL^{-1}$ of BSA-DA and $4.17{\times}10^{-10}\;M$ of antibody-avidin conjugate. A dose-response curve was constructed, and a limit of detection and a dynamic range for DA were accomplished to $2.3{\times}10^{-2}\;{\mu}g\;mL^{-1}$ and four orders of magnitude ($1.0{\times}10^{-7}\;M$ to $1.0{\times}10^{-3}\;M$), respectively. Calibration curve was constructed on dynamic range and least-squares regression of this data gave the following relationship: absorbance = -0.1098 log[DA]+0.0353 ($R^2$ = 0.9956).
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문제 정의
12-14 특히, dual heterobifunctional coupling method15를 이용하여 항체-Avidin 그리고 BSA-DA 접합체를 합성하여 신호증폭과 구성 요소들간의 상호작용의 향상을 꾀하고자 하였다.
본 연구에서는 BSA-DA, antibody-avidin 접합체의 합성방법을 제시하였고, avidin/biotin system 을 도입함으로써 signal 의 증폭효과에 따른 분석 감도를 높이고자 설계하였다. 그 결과 antibody-avidin 접합체와 같은 protein-protein 간의 접합체의 합성은 proteinsmall molecule 접합체의 합성에 비해 반응 비율과 반응시간에 민감하게 작용한다는 반응조건을 확인할 수 있었다.
제안 방법
Competitor인 BSA-DA, binder인 antibody-avidin 접합체(4.17×10−10M과 2.78×10−10M) 그리고 assay buffer에 detergent로 사용되는 Tween20(0.00%, 0.01% 그리고 0.03% in 10 mM PBS)의 농도를 최적화 하였다.
03% in 10 mM PBS)의 농도를 최적화 하였다. 또한 buffer의 pH, 이온 강도 그리고 incubation time 및 temperature 등을 고려하였다.
본 연구에서는 이러한 면역분석법을 기초로 하여 DA에 대한 정량 분석에 강한 결합력(Ka=1015 M−1)을 가지는 결합단백질과, 리간드인 avidin과 biotin system을 도입하였다.
분석 감도에 영향을 주는 다양한 요소에 대하여 최적화 실험을 하였다. Competitor인 BSA-DA, binder인 antibody-avidin 접합체(4.
17×10−10M로 선택하였다. 최적화를 통해 결정된 조건하에서 DA의 dose-response curve와 calibration curve를 작성하였다(Fig. 5). 표준 검정 곡선은 1.
카테콜아민류에 대한 분석은 주로 시료 중의 분석물질을 선택적으로 추출하고, 이를 HPLC-MS11를 이용하여 분리한 후 다시 전기화학적 방법 등을 이용하여 검출하였다. 이 방법은 분석시간이 길고, 시료의 전처리가 필요하며 이로 인해 많은 양의 시료가 소모될 뿐 아니라, 고가의 장비와 숙련자가 요구된다.
대상 데이터
DA, avidin(from egg white), peroxidase-biotinamidocaproyl conjugate(biotin-HRP), DMSO, phosphatecitrate buffer with sodium perborate와 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine dihydrochloride(TMB)는 sigma(ST. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다.
Rabbit polyclonal to DA antibody(ab 8888)는 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구매하였고 imject Bovine Serum Albumin(imject BSA), biotin-free BSA, NSuccinimidyl-S-acetylthioacetate(SATA), succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)는 Pierce(Rockford, IL, USA)에서 구매하여 사용하였다. DA, avidin(from egg white), peroxidase-biotinamidocaproyl conjugate(biotin-HRP), DMSO, phosphatecitrate buffer with sodium perborate와 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine dihydrochloride(TMB)는 sigma(ST.
Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. Sodium bicarbonate, sodium carbonate, sodium phosphate monobasic, sodium phosphate dibasic과 sodium chloride는 Duksan Pure Chemical(Ansan, Kyonggido, Korea)에서 구매하였다. 모든 시약은 분석용 특급시약을 사용하였으며, 모든 용액은 탈이온수(Milli-Q water purification system, Millipore, Billerica, MA USA)로 제조하였다.
이러한 물질들이 체내에서 비정상적으로 작용할 경우 파킨슨병(Parkinson's disease), 기억력 감퇴, 치매, 우울증, 주의력 결핍 등과 같은 신경관련 질환들의 발병을 초래할 수 있으며,6-8 파킨슨병의 경우 뇌 속 중뇌의 흑질(Substantia nigra)에서 선구체 경로를 구성하는 DA성 신경 변성에 의해 발생한다. 병의 증상으로는 떨림증, 몸의 경직, 운동 느림증, 자세 불안정성 등의 비정상적인 운동성 장애와 우울증, 불안장애, 수면장애 등의 정신장애, 그리고 체온 조절 장애나 기립성 저혈압증 등의 자율신경계 기능장애를 들 수 있다. 이러한 경우 DA 자체는 뇌혈관 장벽을 직접적으로 통과할 수 없기 때문에 일차적인 치료제로 DA 전구체인 L-DOPA를 사용한다.
95×10−6M)이 되도록 stock solution을 만들어서 4 ℃에 보관하였다. 사용된 SATA는 BSA mol수의 약 50배를 사용하였고, SMCC와 DA과의 접합에서의 DA은 SMCC보다 50배 많은 mol수를 사용하였다. 마지막 step에서 사용된 SMCC-DA 접합체는 SMCC기준으로 BSA mol수보다 100배 과량 사용되었다.
, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다. 실험에 사용된 plate는 immulon 4 HBX Flat bottom microtiter plate(high binding)(Dynex technologies Inc., USA)이고, well plate에 결합되지 않은 반응시료는 Multiwasher III(Tricontinent, Grass vally, CA, USA)를 사용하여 제거하였다.
첫째는 고체상에 고착되어 있는 competitor (BSA-DA)이고, 둘째는 결합체인 antibodyavidin conjugate이다. 이들 conjugate를 합성하는 과정에서 heterobifuctional linker인 SATA와 SMCC를 사용하였다. Antibody와 avidin의 초기 반응 몰비와 반응시간은 antibody-avidin conjugate를 assay에 적용하였을 때, binding affinity 및 입체효과에 따른 분석 감도에 영향을 미치게 된다.
이론/모형
BSA-DA 접합체와 antibody-avidin 접합체는 아래의 방법과 같이 서로 다른 linker를 사용한 dual heterobifunctional coupling method에 의하여 합성하였다(Scheme 1).
성능/효과
3(a)와 (b)에서 동일하게 관찰된다. DA 분석에서 검출한계는 BSA-DA 접합체와 antibody-avidin 접합체의 상호작용에 의해 각각 영향을 받게 됨을 확인 할 수 있었다. 위의 두 결과를 종합하여 competitor, BSADA 접합체의 농도로 가장 감도가 뛰어나며 넓은 검출영역을 나타내는 6.
Protein-protein 접합체를 합성할 때 각각의 protein 에 linker를 접합시킬 때와 protein-linker간의 접합을 할 때 모두 4ºC에서 24 시간 동안 mild 한 condition 하에서 반응시켜야 균일한 접합체의 합성이 가능하였다.
검출 영역인 1.0×10−3M~1.0×10−7M 사이의 범위 내에서 calibration curve를 얻은 결과 absorbance = -0.1098 log[DA]+0.0353 (R2=0.9956)의 우수한 직선관계를 얻었다.
4에 나타내었다. 그 결과 0.01%의 Tween20 가 assay buffer에 첨가되었을 때 분석감도가 좋은 것으로 확인할 수 있다.
본 연구에서는 BSA-DA, antibody-avidin 접합체의 합성방법을 제시하였고, avidin/biotin system 을 도입함으로써 signal 의 증폭효과에 따른 분석 감도를 높이고자 설계하였다. 그 결과 antibody-avidin 접합체와 같은 protein-protein 간의 접합체의 합성은 proteinsmall molecule 접합체의 합성에 비해 반응 비율과 반응시간에 민감하게 작용한다는 반응조건을 확인할 수 있었다. Protein-protein 접합체를 합성할 때 각각의 protein 에 linker를 접합시킬 때와 protein-linker간의 접합을 할 때 모두 4ºC에서 24 시간 동안 mild 한 condition 하에서 반응시켜야 균일한 접합체의 합성이 가능하였다.
3×10−2 µg/mL 범위의 낮은 검출한계를 보였다. 또한 검정곡선 내의 모든 측정값의 상대표준편차는 3%미만으로 정밀도가 매우 뛰어나며 평균 98% 회수율을 나타내었다. 그러므로 본 연구에서 제시된 분석방법은 시료 내의 DA16의 정량분석을 가능하게 하여, DA 관련 질환의 치료적인 접근17에 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.
실험에서 얻은 검정곡선으로부터 검출 범위는 1.0×10−3M~1.0×10−7M이며, antibody-avidin 접합체의 농도가 4.17×10−10M 이고 BSA-DA 접합체의 농도가 6.66 µg/mL로 coating 되어 있을 때 2.3×10−2 µg/mL 범위의 낮은 검출한계를 보였다.
위의 두 결과를 종합하여 competitor, BSADA 접합체의 농도로 가장 감도가 뛰어나며 넓은 검출영역을 나타내는 6.66 µg/mL을 선택하였으며, antibody-avidin의 경우는 4.17×10−10M일 때 가장 적합한 assay 조건으로 선택하였다.
이때 SATA의 deacetylation에는 25배의 과량을 넣어주었다. 최종적으로 assay에 적용된 antibody-avidin접합체는 antibody-SMCC에서 SMCC가 antibody의 mol수보다 500배 사용되었고, SATA-avidin에서 SATA는 avidin의 양보다 250배 과량 사용되었다. 마지막 단계에서 사용된 SATA-Avidin의 양은 antibody-SMCC의 양보다 500배 과량 사용되었다(protein 기준의 mol수).
후속연구
또한 검정곡선 내의 모든 측정값의 상대표준편차는 3%미만으로 정밀도가 매우 뛰어나며 평균 98% 회수율을 나타내었다. 그러므로 본 연구에서 제시된 분석방법은 시료 내의 DA16의 정량분석을 가능하게 하여, DA 관련 질환의 치료적인 접근17에 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
도파민이란 무엇인가?
도파민은 카테콜아민류의 중요한 신경전달물질로서 부족하면 파킨스병과 정신분열증 등을 야기할 수 있다. 그러므로 조작이 비교적 간단하면서 감도가 우수한 분석법의 개발이 필요하다.
경쟁적인 면역분석법의 분석감도는 어떤 요소에 의해 조절되는가?
경쟁적인 면역분석법의 분석감도는 일반적으로 두가지 요소에 의해 조절된다. 하나는 경쟁자의 특성과 농도이며, 다른 하나는 결합체, 즉 항체의 그것이다. 따라서, 경쟁자인 BSA-DA과 결합체인 항체-avidin 접합체의 최적화가 수행되었다.
Biogenic amine이란 무엇인가?
Biogenic amine이란 생명체 내에 존재하는 저 분자량의 유기염기(organic base)를 총칭하는 것으로, 동·식물, 미생물 등 모든 생명체의 세포 내 대사과정에서 생성 또는 소멸되며, 생체 내의 대사를 조절하거나 신경전달물질로의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.1-5 Biogenic amine류의 대표적인 예로는 카테콜아민(catecholamine)과 인돌아민(indoleamine) 등이 있으며, Dopamine(DA), Norepinephrine, Epinephrine 그리고 serotonin 등은 카테콜아민류에 속한다.
참고문헌 (17)
P. Damier, E. C. Hirsch, Y. Agid and A. M. Grzaybiel, Brain, 122, 1437-1448(1999).
D. Wild, Immunoassay Handbook, 2nd ed Nature Publishing Group, U.K. 2001.
A. E. Sanchez-Rivera, S. Corona-Avendano, G. Alarcon-Angeles, A.Rojas-Hernandez, M. T. Ramirez-Silva and M. A. Romero-Romo, Spectrochim. Acta A., 59, 3193-3203(2003).
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