토마토 재분화 효율 향상 및 엽록체 형질전환 조건 Effect of cultivar and ascorbic acid on in vitro shoot regeneration and development of bombardment-mediated plastid transformation of tomato (Lycopersicon esculentum)원문보기
국립원예특작과학원에서 분양받은 토마토 18계통을 공시하여 재분화가 잘되는 적정 품종을 탐색한 결과, 계통번호 2001-58에서의 재분화율이 93%로 양호하였다. 또한 식물체로의 재분화 과정에서 보여 지는 갈변현상과 phenolic compound에 의한 식물조직의 괴사현상을 막기 위하여 항산화제인 ascorbic acid와 cystein을 단용 또는 혼용으로 첨가한 후 토마토 재분화에 미치는 영향을 살펴 본 결과, ascorbic acid $200{\sim}300\;{\mu}M/L$ 처리구에서 줄기형성율 및 생체중이 증가되는 현상을 관찰할 수 있었다. 토마토 엽록체 형질전환체 선발을 위해 spectinomycin의 적정 농도를 살펴본 결과, 재분화배지에 spectinomycin 20~25 mg/L 농도가 첨가되어진 처리구에서 재분화가 거의 이루어지지 않았다. 토마토 엽록체 형질전환을 위해 토마토 엽록체 게놈 일부를 분리하여 염기서열을 분석하여 담배와 비교 분석한 결과, homology가 매우 높음을 알 수 있었다. Homologous recombination에 의한 엽록체 형질전환이 되기 위해서 분리한 토마토 엽록체 게놈 일부를 border sequence로 이용하였고, transient assay를 위해 GFP 유전자가 포함된 토마토 엽록체 형질전환용 운반체 pKRT22-AG를 제작하였다. Bombardment을 한 후 원형질체를 나출하여 공초점 현미경하에서 관찰한 결과 엽록체 내에서만 GFP가 발현됨을 알 수 있었으며, DNA 농도 $1\;{\mu}g$, $0.6\;{\mu}m$ gold particle 1 mg, target distance 9 cm 조건이 가장 좋았다.
국립원예특작과학원에서 분양받은 토마토 18계통을 공시하여 재분화가 잘되는 적정 품종을 탐색한 결과, 계통번호 2001-58에서의 재분화율이 93%로 양호하였다. 또한 식물체로의 재분화 과정에서 보여 지는 갈변현상과 phenolic compound에 의한 식물조직의 괴사현상을 막기 위하여 항산화제인 ascorbic acid와 cystein을 단용 또는 혼용으로 첨가한 후 토마토 재분화에 미치는 영향을 살펴 본 결과, ascorbic acid $200{\sim}300\;{\mu}M/L$ 처리구에서 줄기형성율 및 생체중이 증가되는 현상을 관찰할 수 있었다. 토마토 엽록체 형질전환체 선발을 위해 spectinomycin의 적정 농도를 살펴본 결과, 재분화배지에 spectinomycin 20~25 mg/L 농도가 첨가되어진 처리구에서 재분화가 거의 이루어지지 않았다. 토마토 엽록체 형질전환을 위해 토마토 엽록체 게놈 일부를 분리하여 염기서열을 분석하여 담배와 비교 분석한 결과, homology가 매우 높음을 알 수 있었다. Homologous recombination에 의한 엽록체 형질전환이 되기 위해서 분리한 토마토 엽록체 게놈 일부를 border sequence로 이용하였고, transient assay를 위해 GFP 유전자가 포함된 토마토 엽록체 형질전환용 운반체 pKRT22-AG를 제작하였다. Bombardment을 한 후 원형질체를 나출하여 공초점 현미경하에서 관찰한 결과 엽록체 내에서만 GFP가 발현됨을 알 수 있었으며, DNA 농도 $1\;{\mu}g$, $0.6\;{\mu}m$ gold particle 1 mg, target distance 9 cm 조건이 가장 좋았다.
Eighteen cultivars of tomato were tested for their regeneration response. Lycopersicon esculentum cv. 2001-58 showed a very high frequency of regeneration (93%). We evaluated the effect of two compounds with known antioxidant activity (ascorbic acid and cystein). The use of ascorbic acid ($200\...
Eighteen cultivars of tomato were tested for their regeneration response. Lycopersicon esculentum cv. 2001-58 showed a very high frequency of regeneration (93%). We evaluated the effect of two compounds with known antioxidant activity (ascorbic acid and cystein). The use of ascorbic acid ($200\;-\;300\;{\mu}M/L$) has a positive effect on shoot regeneration. To develope a system for plastid transformation in tomato via homologous recombination, we constructed the tomato plastid expression vector (pKRT22-AG) harboring 2.2 kb flanking sequences cloned from intact plastid genome and gfp gene. To investigate the factors affecting the delivery system of the pKRT22-AG into chloroplast using bombardment, We assessed the optimal DNA concentration, gold particle volume and target distance. Expression of the GFP protein was observed within chloroplast on protoplast of cotyledon explant by confocal laser scanning microscopy, which indicates that the protocol developed in this study be useful for the production of plastid transgenic plants in tomato.
Eighteen cultivars of tomato were tested for their regeneration response. Lycopersicon esculentum cv. 2001-58 showed a very high frequency of regeneration (93%). We evaluated the effect of two compounds with known antioxidant activity (ascorbic acid and cystein). The use of ascorbic acid ($200\;-\;300\;{\mu}M/L$) has a positive effect on shoot regeneration. To develope a system for plastid transformation in tomato via homologous recombination, we constructed the tomato plastid expression vector (pKRT22-AG) harboring 2.2 kb flanking sequences cloned from intact plastid genome and gfp gene. To investigate the factors affecting the delivery system of the pKRT22-AG into chloroplast using bombardment, We assessed the optimal DNA concentration, gold particle volume and target distance. Expression of the GFP protein was observed within chloroplast on protoplast of cotyledon explant by confocal laser scanning microscopy, which indicates that the protocol developed in this study be useful for the production of plastid transgenic plants in tomato.
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문제 정의
본 연구는 생식 및 가공식품으로 이용성이 높은 토마토에서의 엽록체 형질전환 기술 확립을 위하여 적정품종, 재분화조건 및 유전자총조건을 구명하고자 하였다.
재분화 효율을 높이기 위하여 항산화제를 첨가하여 재분화능에 미치는 영향을 조사하였다. 국립원예특작과학원 육성 원홍1호 (계통번호 2001-58)를 공시품종으로 하였다.
제안 방법
0 mg/L + Sucrose 30 g/L + Phytagel 3 g/L)에 치상하였다. 2주 간격으로 계대배양을 하였으며, 치상 후 8주후에 재분화능을 조사하였다. 줄기 형성율은 전체 치상된 절편 중 줄기가 유도된 절편 수를 백분율로 계산하였다.
5, 2 mg/bombardment) 및 target distance (6, 9, 12 cm)를 달리하여 엽록체 형질전환을 위한 적정 유전자총 조건을 구명하고자 하였다. Bombardment를 실시한 후 자엽을 재분화배지에 치상하여 암 상태에서 배양한 후 이틀 후에 원형질체를 나출하여 공초점현미경을 이용하여 GFP 발현 여부를 관찰하였다.
GFP가 들어있는 토마토 엽록체 형질전환 벡터인 pKRT22-AG를 이용하여 DNA 농도 (0.5, 1, 1.5 ㎍/bombardment), 0.6 ㎛ gold particle (0.5, 1, 1.5, 2 mg/bombardment) 및 target distance (6, 9, 12 cm)를 달리하여 엽록체 형질전환을 위한 적정 유전자총 조건을 구명하고자 하였다. Bombardment를 실시한 후 자엽을 재분화배지에 치상하여 암 상태에서 배양한 후 이틀 후에 원형질체를 나출하여 공초점현미경을 이용하여 GFP 발현 여부를 관찰하였다.
Homologous recombination에 의한 엽록체 형질전환 메카니즘에 의해 토마토 엽록체 형질전환 벡터 작성 시 필요한 토마토 엽록체 게놈 flanking region을 분리하여 염기서열 (Fig. 3)을 결정하고 해당부위의 담배 엽록체 DNA sequence와 비교 분석하였다 (Staub and Maliga 1992; Maliga 1993; Maliga et al. 1994; Wakasugi 1998; Kavanagh et al. 1999). 그림 3에서 16S rRNA 와 tRNA (trnI and trnA) 유전자 sequence는 토마토와 담배 모두 동일하였으며 단, trnI 유전자 내에 존재하는 intron의 크기가 토마토에서는 723 bp, 담배에서는 707 bp였으며, trnA 유전자 내에 존재하는 intron의 크기는 토마토가 809 bp, 담배에서는 709 bp로 토마토 엽록체 DNA의 intron의 크기가 담배보다 크다는 것을 알 수 있었다.
토마토 엽록체 형질전환을 위해 토마토 엽록체 게놈 일부를 분리하여 염기서열을 분석하여 담배와 비교 분석한 결과, homology가 매우 높음을 알 수 있었다. Homologous recombination에 의한 엽록체 형질전환이 되기 위해서 분리한 토마토 엽록체 게놈 일부를 border sequence로 이용하였고, transient assay를 위해 GFP 유전자가 포함된 토마토 엽록체 형질전환용 운반체 pKRT22-AG를 제작하였다. Bombardment을 한 후 원형질 체를 나출하여 공초점 현미경하에서 관찰한 결과 엽록체 내에서만 GFP가 발현됨을 알 수 있었으며, DNA 농도 1 ㎍, 0.
PCR 반응은 94℃에서 5분간 반응 후, 94℃ 30초, 58.5℃ 30초, 72℃ 1분 30초간 30회 반복 실시하였다.
5X TAE agarose gel을 이용하여 전기영동하였다. pKRT22-A의 토마토 엽록체내 발현여부를 조사하기 위해 wild type pEGFP vector (clontech)를 Xba I으로 gfp 유전자를 분리한 후 토마토 엽록체 형질전환 벡터 pKRT22-A에 cloning 하여 pKRT22- AG를 작성하였다.
농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 육성한 토마토 18계통을 공시하여 재분화능을 조사하였다. 재분화 시험을 위한 기내에서의 식물체 육성을 위해 토마토 18계통의 종자를 70% 에탄올로 1분간 침지한 후 1.
2% NaOCl로 15분간 표면살균한 후 멸균수로 3회 수세하였다. 멸균된 토마토 종자를 30 g/L sucrose 와 3 g/L phytagel (Sigma) 가첨가된 MS (Murashige and Skoog, 1962) 배지에 치상하였다. 파종 후 7-9일 후 발아한 유식물체의 자엽과 하배축의 양쪽 끝을 잘라서 재분화배지 (T6; MS기본배지+ IAA 0.
항산화제는 멸균수에 녹인 후 filtering을 하여 사용하였으며, 멸균한 배지를 50℃정도가 되게 식힌 후 첨가하였다. 엽록체 형질전환을 위한 선발 항생제 적정 농도를 알아보기 위해 재분화 배지에 spectinomycin 5~25 mg/L을 각 각 첨가한 후 배양 4주후에 재분화능을 조사하였다.
엽록체 형질전환체 선발 효율이 높다고 알려져 있는 aadA (aminoglycoside 3"-adenylyltransferase)는 spectinomycin과 streptomycin에 내성 (Svab and Maliga 1993)을 보이는 특성을 가지고 있으며 이 유전자를 토마토 엽록체 형질전환 선발마커로 사용하고자 적정 선발 항생제 농도 실험을 수행하였다 (Fig. 2).
국립원예특작과학원에서 분양받은 18계통을 공시하여 자엽과 하배축에서의 재분화능을 조사한 결과 하배축에 비해 자엽에서의 재분화능이 좋았고, 특히 계통번호 2001-58과 2001-159의 자엽에서 재분화율이 각 각 93%와 69%로 양호하였다 (Table 1). 자엽에서 식물체로의 재분화 과정에서 보여지는 갈변현상과 phenolic compound에 의한 식물조직의 괴사현상을 막기 위하여 항산화제인 ascorbic acid와 cystein을 단용 또는 혼용으로 첨가한 후 식물체 재분화에 미치는 영향을 살펴보았다 (Fig. 1). 줄기 형성율에 있어서 항산화제 첨가 시 줄기 형성율이 높아지는 것을 관찰할 수 있었으며, 전체 처리구 중 ascorbic acid 단용처리구에서 효과가 좋았으며, 특히 ascorbic acid 200~300 μM/L 처리구에서 줄기형성율이 72~74%로 양호하였다.
재분화 배지에 항산화제인 ascorbic acid 100~400 μM/L 과 cystein 300~900 μM/L을 단용 또는 혼용으로 첨가하여 실험을 실시하였다.
농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 육성한 토마토 18계통을 공시하여 재분화능을 조사하였다. 재분화 시험을 위한 기내에서의 식물체 육성을 위해 토마토 18계통의 종자를 70% 에탄올로 1분간 침지한 후 1.2% NaOCl로 15분간 표면살균한 후 멸균수로 3회 수세하였다. 멸균된 토마토 종자를 30 g/L sucrose 와 3 g/L phytagel (Sigma) 가첨가된 MS (Murashige and Skoog, 1962) 배지에 치상하였다.
멸균된 토마토 종자를 30 g/L sucrose 와 3 g/L phytagel (Sigma) 가첨가된 MS (Murashige and Skoog, 1962) 배지에 치상하였다. 파종 후 7-9일 후 발아한 유식물체의 자엽과 하배축의 양쪽 끝을 잘라서 재분화배지 (T6; MS기본배지+ IAA 0.5 mg/L + BAP 1.0 mg/L + Sucrose 30 g/L + Phytagel 3 g/L)에 치상하였다. 2주 간격으로 계대배양을 하였으며, 치상 후 8주후에 재분화능을 조사하였다.
대상 데이터
재분화 효율을 높이기 위하여 항산화제를 첨가하여 재분화능에 미치는 영향을 조사하였다. 국립원예특작과학원 육성 원홍1호 (계통번호 2001-58)를 공시품종으로 하였다. 재분화 배지에 항산화제인 ascorbic acid 100~400 μM/L 과 cystein 300~900 μM/L을 단용 또는 혼용으로 첨가하여 실험을 실시하였다.
데이터처리
염기서열은 automatic DNA sequencer (ABI9700)를 이용하였다. 결정된 염기서열은 DNAStar 소프트웨어프로그램을 이용하여 담배 (Nicotiana tabacum) 엽록체 게놈과 비교분석하였다.
이론/모형
Daniell 등 (1998)의 방법을 이용하여 pUC18에 삽입한 후, 16S rRNA promoter와 psbA 3'terminator 사이에 aadA (aminoglycoside 3"- adenylyltransferase) 유전자가 들어있는 cassette를 Sma I으로 절단한 후 토마토 엽록체 flanking region내 존재하는 Pvu II (105,331 n.t.)를 이용하여 벡터를 구축하였다.
PCR primer는 M13 forward primer와 M13 reverse primer를 사용하였다. 염기서열은 automatic DNA sequencer (ABI9700)를 이용하였다. 결정된 염기서열은 DNAStar 소프트웨어프로그램을 이용하여 담배 (Nicotiana tabacum) 엽록체 게놈과 비교분석하였다.
토마토 엽록체 flanking region이 삽입된 pCR2.1-topo vector를 정제한 후, dideoxynucleotide chain termination 방법 (ABI prism dye terminator) 으로 PCR 반응을 실시하였다. PCR primer는 M13 forward primer와 M13 reverse primer를 사용하였다.
성능/효과
Ascorbic acid가 첨가되어진 배지에서의 식물체 재분화 특성은 대조구에 비해 생체중이 증가되는 현상을 나타내었으며, 자엽 절편당 형성되는 줄기수는 대조구와 비슷한 경향치를 보였고, 줄기신장 속도는 대조구에 비해 다소 빨라짐을 알 수 있었다 (Table 2).
Homologous recombination에 의한 엽록체 형질전환이 되기 위해서 분리한 토마토 엽록체 게놈 일부를 border sequence로 이용하였고, transient assay를 위해 GFP 유전자가 포함된 토마토 엽록체 형질전환용 운반체 pKRT22-AG를 제작하였다. Bombardment을 한 후 원형질 체를 나출하여 공초점 현미경하에서 관찰한 결과 엽록체 내에서만 GFP가 발현됨을 알 수 있었으며, DNA 농도 1 ㎍, 0.6 ㎛ gold particle 1 mg, target distance 9㎝ 조건이 가장 좋았다.
Cystein 첨가시 보여지는 재분화 특성 중 가장 두드려진 현상은 다른 처리구에 비해 줄기신장속도가 빨라서 대조구에 비해 cystein이 첨가된 단용 또는 혼용처리구 모두에서 줄기길이가 길어짐을 볼 수 있었으며, 생체중과 자엽 절편당 형성되는 줄기 수에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보여 진다.
국립원예특작과학원에서 분양받은 18계통을 공시하여 자엽과 하배축에서의 재분화능을 조사한 결과 하배축에 비해 자엽에서의 재분화능이 좋았고, 특히 계통번호 2001-58과 2001-159의 자엽에서 재분화율이 각 각 93%와 69%로 양호하였다 (Table 1). 자엽에서 식물체로의 재분화 과정에서 보여지는 갈변현상과 phenolic compound에 의한 식물조직의 괴사현상을 막기 위하여 항산화제인 ascorbic acid와 cystein을 단용 또는 혼용으로 첨가한 후 식물체 재분화에 미치는 영향을 살펴보았다 (Fig.
국립원예특작과학원에서 분양받은 토마토 18계통을 공시하여 재분화가 잘되는 적정 품종을 탐색한 결과, 계통번호 2001-58에서의 재분화율이 93%로 양호하였다. 또한 식물체로의 재분화 과정에서 보여 지는 갈변현상과 phenolic compound에 의한 식물조직의 괴사현상을 막기 위하여 항산화제인 ascorbic acid와 cystein을 단용 또는 혼용으로 첨가한 후 토마토 재분화에 미치는 영향을 살펴 본 결과, ascorbic acid 200～300 μM/L 처리구에서 줄기형성율 및 생체중이 증가되는 현상을 관찰할 수 있었다.
5). 그리고 GFP가 정확하게 엽록체 내에서만 발현되는 것을 관찰하였고, 이를 통해 토마토 엽록체 형질전환용 벡터가 잘 만들어졌음을 알 수 있었다. 또한 gold 양을 증가하였을 때 DNA 농도 증가와 비슷한 경향을 나타내었다(data not shown).
1999). 그림 3에서 16S rRNA 와 tRNA (trnI and trnA) 유전자 sequence는 토마토와 담배 모두 동일하였으며 단, trnI 유전자 내에 존재하는 intron의 크기가 토마토에서는 723 bp, 담배에서는 707 bp였으며, trnA 유전자 내에 존재하는 intron의 크기는 토마토가 809 bp, 담배에서는 709 bp로 토마토 엽록체 DNA의 intron의 크기가 담배보다 크다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Palmer 등 (1987, 1988)이 보고한 바와 같이 엽록체 DNA sequence 간의 homology가 높았으며, 특히 structural gene의 homology가 매우 높다는 것을 알 수 있었다.
Target distance가 6 ㎝인 경우 거의 터져서 죽는 것이 관찰되었고, 12 ㎝인 경우 GFP 발현이 거의 관찰되지 않았다 (data not shown). 따라서 토마토 엽록체 형질전환을 위한 적정 유전자총 조건으로는 1 bombardment의 경우 DNA 농도 1 ㎍, 0.6 ㎛ gold particle 1 mg, target distance 9 ㎝가 효과적이었다고 사료되었으며, 이 결과는 담배 엽록체 형질전환의 유전자 총 조건 (Lee et al. 2003; Roh et al. 2006) 과 같음을 알 수 있었다. 본 실험을 통해 얻어진 토마토 엽록체 형질전환용 벡터 및 형질전환 조건은 토마토 엽록체 형질전환체를 생산하는데 매우 효과적일거라 사료되었다.
Cystein 첨가시 보여지는 재분화 특성 중 가장 두드려진 현상은 다른 처리구에 비해 줄기신장속도가 빨라서 대조구에 비해 cystein이 첨가된 단용 또는 혼용처리구 모두에서 줄기길이가 길어짐을 볼 수 있었으며, 생체중과 자엽 절편당 형성되는 줄기 수에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보여 진다. 또한 대조구의 경우 배양 2주가 지나면서 갈변현상이 나타나는 것과 달리 항산화제 첨가 배지에서는 녹색의 캘러스가 배양 4주까지 유지되는 것으로 보아 형질전환 시 식물체 조직에 가해지는 상처부위의 활성산소의 산화력을 감소시키는 데 항산화제가 효과가 있다고 사료되었다. 실질적으로 토마토 형질전환 시 항산화제인 티아민을 첨가하였을 때 형질전환 효율이 높아졌다는 보고가 있으며 (Cortina and Culianez-Macia 2004), 항산화제인 tri-potassium citrate를 C.
또한 식물체로의 재분화 과정에서 보여 지는 갈변현상과 phenolic compound에 의한 식물조직의 괴사현상을 막기 위하여 항산화제인 ascorbic acid와 cystein을 단용 또는 혼용으로 첨가한 후 토마토 재분화에 미치는 영향을 살펴 본 결과, ascorbic acid 200～300 μM/L 처리구에서 줄기형성율 및 생체중이 증가되는 현상을 관찰할 수 있었다.
2). 본 실험에서는 spectinomycin을 재분화배지에 첨가한 후 토마토 자엽에서의 재분화능을 조사한 결과, spectinomycin 20～25 mg/L 첨가배지에서 재분화가 거의 이루어지지 않는 것으로 나타났기에 토마토 엽록체 형질전환체 선발 항생제 농도로 spectinomycin 25 mg/L이 적합하다고 사료되었다. Ruf 등 (2001)은 토마토 엽록체 형질전환체를 spectinomycin 500 mg/L에서 선발하였다고 보고한 바 있다.
2006) 과 같음을 알 수 있었다. 본 실험을 통해 얻어진 토마토 엽록체 형질전환용 벡터 및 형질전환 조건은 토마토 엽록체 형질전환체를 생산하는데 매우 효과적일거라 사료되었다.
엽록체 형질전환 벡터 pKRT22-AG (Fig. 4)를 토마토 자엽에 bombardment 할 때의 조건을 구명하고자 DNA농도, particle gold양, target distance를 달리하여 처리한 후, 48시간이 지난 후 자엽으로부터 원형질체를 나출하여 GFP 발현여부를 조사한 결과, DNA 농도가 0.5 ㎍/shot에서는 GFP 발현 엽록체 개수가 1-2개로 저조한 반면, DNA 농도가 2 ㎍/shot에서는 gold와 엉키어서 세포를 손상시켜 죽게 하는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 5). 그리고 GFP가 정확하게 엽록체 내에서만 발현되는 것을 관찰하였고, 이를 통해 토마토 엽록체 형질전환용 벡터가 잘 만들어졌음을 알 수 있었다.
줄기 형성율에 있어서 항산화제 첨가 시 줄기 형성율이 높아지는 것을 관찰할 수 있었으며, 전체 처리구 중 ascorbic acid 단용처리구에서 효과가 좋았으며, 특히 ascorbic acid 200~300 μM/L 처리구에서 줄기형성율이 72~74%로 양호하였다.
또한 식물체로의 재분화 과정에서 보여 지는 갈변현상과 phenolic compound에 의한 식물조직의 괴사현상을 막기 위하여 항산화제인 ascorbic acid와 cystein을 단용 또는 혼용으로 첨가한 후 토마토 재분화에 미치는 영향을 살펴 본 결과, ascorbic acid 200～300 μM/L 처리구에서 줄기형성율 및 생체중이 증가되는 현상을 관찰할 수 있었다. 토 마토 엽록체 형질전환체 선발을 위해 spectinomycin의 적정 농도를 살펴본 결과, 재분화배지에 spectinomycin 20～ 25 mg/L 농도가 첨가되어진 처리구에서 재분화가 거의 이루어지지 않았다. 토마토 엽록체 형질전환을 위해 토마토 엽록체 게놈 일부를 분리하여 염기서열을 분석하여 담배와 비교 분석한 결과, homology가 매우 높음을 알 수 있었다.
토 마토 엽록체 형질전환체 선발을 위해 spectinomycin의 적정 농도를 살펴본 결과, 재분화배지에 spectinomycin 20～ 25 mg/L 농도가 첨가되어진 처리구에서 재분화가 거의 이루어지지 않았다. 토마토 엽록체 형질전환을 위해 토마토 엽록체 게놈 일부를 분리하여 염기서열을 분석하여 담배와 비교 분석한 결과, homology가 매우 높음을 알 수 있었다. Homologous recombination에 의한 엽록체 형질전환이 되기 위해서 분리한 토마토 엽록체 게놈 일부를 border sequence로 이용하였고, transient assay를 위해 GFP 유전자가 포함된 토마토 엽록체 형질전환용 운반체 pKRT22-AG를 제작하였다.
후속연구
Ruf 등 (2001)은 토마토 엽록체 형질전환체를 spectinomycin 500 mg/L에서 선발하였다고 보고한 바 있다. 이러한 결과는 품종에 따른 항생제 민감도에서 기인한 것으로 생각되어지며, 추후 부가적인 실험을 할 예정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
엽록체란 무엇인가?
엽록체는 식물세포에서 독립적으로 자체 게놈을 가지고 있는 기관으로 모계유전을 한다. 이제까지 엽록체가 가지고 있는 두개의 막으로 인하여 식물세포기관으로의 유전자 형질전환은 불가능하게 여겨졌다.
식물세포기관으로의 유전자 형질전환이 불가능하게 여겨진 이유는 무엇인가?
엽록체는 식물세포에서 독립적으로 자체 게놈을 가지고 있는 기관으로 모계유전을 한다. 이제까지 엽록체가 가지고 있는 두개의 막으로 인하여 식물세포기관으로의 유전자 형질전환은 불가능하게 여겨졌다. 하지만 많은식물 생물학자들은 지난 1992년 Cerutti 등에 의해 처음으로 담배에서의 엽록체 형질전환체에 관한 연구가 보고된 이래 이 분야에 대해 많은 연구를 수행해 오고 있는 실정이다.
엽록체 형질전환체의 장점은 무엇인가?
하지만 많은식물 생물학자들은 지난 1992년 Cerutti 등에 의해 처음으로 담배에서의 엽록체 형질전환체에 관한 연구가 보고된 이래 이 분야에 대해 많은 연구를 수행해 오고 있는 실정이다. 엽록체 형질전환은 외래 유전자의 대량 발현 (Kota et al. 1999), 한번에 여러 개의 유전자를 엽록체내로 삽입(DeCosa et al. 2001), 모계유전 방식에 의한 유전자의 세대간 이동 (Daniell 2002) 및 유전자의 침묵현상이 일어나지 않는다는 (DeCosa et al. 2001; Lee et al. 2003) 등 많은장점을 가지고 있다. 식물 분자육종 학자들은 특히 엽록체 형질전환이 자연생태계에 친화적이고, T1세대에서 고정이 가능하다는 부문에서 매우 흥미를 느끼고 있다.
참고문헌 (29)
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Cerutti H, Osman M, Grandoni P, Jagendorf AT (1992) A homolog of Escherichia coli RecA protein in plastids of higher plants. Proc Natl Acad Sci USA 89:8068-8072
Daniell H, Datta R, Varma S, Gray S, Lee SB (1998) Containment of herbicide resistance through genetic engineering of the chloroplast genome. Nature Biotechnology 16:345-348
DeCosa B, Moar W, Lee SB, Miller M, Daniell H (2001) Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals. Nature Biotechnology 19:71-74
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