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문제 정의
- 1999). 본 연구에서는 과실에서 우세하게 발현하는 ascorbate oxidase (ASO) promoter (Ohkawa et al. 1994)를 이용하여 카사바의 CuZnSOD (Lee et al. 1999)를 과실에서 고발현시킨 SOD 고함유 토마토를 개발하고자 하였다.
제안 방법
- Agrobacterium을 매개로 하여 서광 및 꼬꼬 유식물체의 자엽 절편체를 형질전환하였다. 발아 7일째 유식물체의 자엽 절편체를 MS 기본 액체배지에 놓고 YEP에서 28℃ 40시간 생육한 Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 1 mL 을 넣은 후 25℃ 암조건에서 48시간 공동배양하였다.
- Kanamycin 저항성 소식물체를 대상으로 npt H 유전자 primer를 사용하여 PCR을 수행하여 형질전환 토마토 식물체를 선별하였다 (결과 미제시). PCR로 형질전환이 확인된 서광식물체(T1)와 꼬꼬 식물체 (T2와 T3)를 대상으로 Southern 분석을 실시한 결과 대조구 토마토 식물체에서는 어떤 밴드도 나타나지 않았고 형질전환체에서는 한 개 이상의 밴드가 관찰되었다 (Figure 3).
- 8% agarose gel에 전기영동한 후, Zeta Probe membrane (Bio-Rad 제품)으로 전이시켰다. Kanamycin 저항성 유전자인 nptll 유전자(700 bp) 및 mSODl 유전자의 특이부분 (260 bp)을 PCR로 합성하여 각각 probe로 이용하였다. DNA를 동위원소[a-32P] dCTP로 labelling시켜 prehybridization용액 (Zeta Probe membrane 용)에 첨가하여 60℃에서 24시간 동안 hybridization시켰다.
- Kanamycin 함유배지에 선발되어 PCR로 형질전환이 확인된 토마토 식물체 3개체를 대상으로 Southern분석을 실시하였다. 온실에서 생육중인 토마토 식물체의 잎으로부터의genomic DNA 분리는 Asemota (1995)의 방법에 따라 수행하였다.
- 8)]은 매번 조제하여 사용하였다. 반음액을 만든 후 cytochrome c의 농도를 일정하게 유지하기 위해 sodium dithionite로 보정하였다. 효소반응은 상기 반응액 1 mL과 효소액 (10 µL 전후)을 큐벳에 넣고, 0.
- DNA를 동위원소[a-32P] dCTP로 labelling시켜 prehybridization용액 (Zeta Probe membrane 용)에 첨가하여 60℃에서 24시간 동안 hybridization시켰다. 반응을 마친 membrane을 세척하고 X-ray 필름에 노출시켜 밴드를 확인 하였다.
- 1 mg/L)를 조합한 배지에 7일 동안 발아시킨 서광 유식물체의 자엽절편체를 배양하였다. 배양은 종자발아와 같은 조건에서 약 4주간 하였으며 각각의 배지에서 shoot 발생 빈도를 조사한 후 백분율로 표시하였다.
- 온실에서 생육중인 토마토 식물체의 잎으로부터의genomic DNA 분리는 Asemota (1995)의 방법에 따라 수행하였다. 분리한 DNA (30 #)를 EcoRI 및 H#dill로 각각 절 단하여 0.8% agarose gel에 전기영동한 후, Zeta Probe membrane (Bio-Rad 제품)으로 전이시켰다. Kanamycin 저항성 유전자인 nptll 유전자(700 bp) 및 mSODl 유전자의 특이부분 (260 bp)을 PCR로 합성하여 각각 probe로 이용하였다.
- 서광과 꼬꼬 토마토의 형질전환체 (To 세대)와 형질전환시키지 않은 식물체(이하 대조구로 함)의 열매를 재료로 하여 발달 정도에 따라 익지 않은 녹색 열매 (immature fruit: IM), 익기 시작한 열매 (middle-mature fruit: MF), 완전히 익은 열매 (well-mature fruit: WMF)의 3단계로 분류하였다 :Figure 4A). 토마토 열매 각 0.
- 1 mg/L IAA + 300 mg/L claforan +100 mg/L kanamycin)에서 배양하였다. 선발배지에서 유도된 shoote root 유도를 위해 뿌리유도배지 (MS + 1 mg/L IAA, 300 mg/L claforan + 100 mg/L kanamycin)로 옮기고 뿌리가발생하면 4~5일간 순화시켜 화분으로 옮겨 온실에서 재배하였다. 형질전환체 선발 및 배양은 종자발아시와 같은 조건에서 실시하였다.
- 재분화 조건 확립을 위해 BA (1, 2 mg/L)와 IAA (0, 0.1 mg/L)를 조합한 배지에 7일 동안 발아시킨 서광 유식물체의 자엽절편체를 배양하였다. 배양은 종자발아와 같은 조건에서 약 4주간 하였으며 각각의 배지에서 shoot 발생 빈도를 조사한 후 백분율로 표시하였다.
- 카사바 배양세포에서 분리한 cytosolic CuZnSOD cDNA, mSODl (Lee et al. 1999)을 토마토 과실에서 우세적으로 발현시킬 수 있는 AS프로모터 (Ohkawa et al. 1994)에 연결시킨 후 neomycin phosphotransferase (nptlF) 유전자를 선발 표지로 한 식물형질전환 벡터인 pBIlOl에 도입하여 ASOp ::mSODl/pBIl0l을 제작하였다 (Figure 1). 이것을 Agro- #acfer#m #NcMns LBA4404에 도입하여 형질전환에 이용하였다.
- 토마토 열매를 익지 않은 녹색 과실 (IF), 익기 시작한 과 실 (MF), 완전히 익은 과실 (WMF) 3단계로 나누어 단백질 함량과 SOD 비활성도 (units/mg protein)를 측정하였다 (Figure 4A). 단백질 함량은 서광과 꼬꼬에서 형질전환체와 대조구 모두 익지 않은 녹색 과실에서 완전히 익은 과실로 갈수록 감소하여 완전히 익은 단계에서 가장 낮았다 (Figure 4B).
- 형질전환된 서광과 꼬꼬의 과실을 SOD 활성 분석시와 같이 성숙단계별로 나누어서 SOD native gel 분석을 하였다 (Figure 5). 두 품종 모두 1개의 MnSOD, 2개의 FeSOD, 2개의 CuZnSOD isoenzyme 밴드가 나타났다.
- 반음액을 만든 후 cytochrome c의 농도를 일정하게 유지하기 위해 sodium dithionite로 보정하였다. 효소반응은 상기 반응액 1 mL과 효소액 (10 µL 전후)을 큐벳에 넣고, 0.1 mM EDTA를 포함한 50 mM 인산완충액 (pH 7.8)으로 25배 희석한 XOD 를 첨가하였다. 효소 활성의 1단위 (1 unit)는 25℃에서 반응을 시작하여 2분 30초간 550 nm에서 흡광도 변화를 조사하여 XOD 활성이 50% 억제된 것으로 정의하였다.
대상 데이터
- 소독한 종자는 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지에서 약 15 eM/m2 . s의 형광빛에서 16시간, 암 8시간의 광주기, 25℃의 조건으로 발아시키고 1주일 자란 유식물체의 자엽 절편체를 식물체 재분화 및 형질전환 재료로 사용하였다.
- 1994)에 연결시킨 후 neomycin phosphotransferase (nptlF) 유전자를 선발 표지로 한 식물형질전환 벡터인 pBIlOl에 도입하여 ASOp ::mSODl/pBIl0l을 제작하였다 (Figure 1). 이것을 Agro- #acfer#m #NcMns LBA4404에 도입하여 형질전환에 이용하였다.
- 토마토 (Lycopersicon esculentum Mill) 형질전환에는 대과종인 서광 (Pink forcer, Seminis Korea 흥농종묘)과 소과 종 (방울토마토)인 꼬꼬(Koko, 일본 Takii종묘) 2가지 품종을 사용하였다. 토마토 종자를 1차 증류수로 세척하고 70% 에탄올로 1차 표면 소독 후, 1% sodium hypochlorite 용액에 20분간 담가 2차 표면 소독 후 멸균수로 5회 세척하고 물기를 제거하였다.
이론/모형
- Native gel 전기영동은 Beauchamp와 Fridovich의 방법 : 1971)을 사용하였다. 추출한 효소액을 일정액 취해 동일량의 단백질 농도가 되도록 조정한 후, 12.
- SOD활성은 McCord와 Fridovich의 방법(1969)에 따라 xanthine oxidase (XOD)와 cytochrome c를 이용하여 측정하였다. 효소 측정에 사용되는 반응액[10 mM xanthine 2.
- 0)을 넣어 11,000 rpm에서 15쿤간 원심분리한 후 얻은 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 딘백질 정량은 Bradford (1976)의 방법을 사용하여 BSA 를 표준단백질로 하였다.
- Kanamycin 함유배지에 선발되어 PCR로 형질전환이 확인된 토마토 식물체 3개체를 대상으로 Southern분석을 실시하였다. 온실에서 생육중인 토마토 식물체의 잎으로부터의genomic DNA 분리는 Asemota (1995)의 방법에 따라 수행하였다. 분리한 DNA (30 #)를 EcoRI 및 H#dill로 각각 절 단하여 0.
성능/효과
- Kanamycin 저항성 소식물체를 대상으로 npt H 유전자 primer를 사용하여 PCR을 수행하여 형질전환 토마토 식물체를 선별하였다 (결과 미제시). PCR로 형질전환이 확인된 서광식물체(T1)와 꼬꼬 식물체 (T2와 T3)를 대상으로 Southern 분석을 실시한 결과 대조구 토마토 식물체에서는 어떤 밴드도 나타나지 않았고 형질전환체에서는 한 개 이상의 밴드가 관찰되었다 (Figure 3). nptll 유전자를 probe로 사용하였을 경우 서광(T1 식물체)은 4.
- 형질전환된 서광과 꼬꼬의 과실을 SOD 활성 분석시와 같이 성숙단계별로 나누어서 SOD native gel 분석을 하였다 (Figure 5). 두 품종 모두 1개의 MnSOD, 2개의 FeSOD, 2개의 CuZnSOD isoenzyme 밴드가 나타났다. 대조구와 비교하여 특이하게 다른 밴드는 나타나지 않았으나 서광과 꼬꼬 2 품종 모두 형질전환체는 과실의 익은 정도가 진행될수록 SOD 비활성도 분석 결과와 같이 경향을 나타내었다.
- 잎의 경우 두 품종 모두 형질 전환체와 대조구에서 3개의 SOD isoenzyme이 존재하였는데 증가된 밴드는 관찰되지 않았다 (결과 미제시). 따라서 토마토의 SOD isoenzymee 품종간에는 큰 차이가 없고, 과실 의 생장에 따라 조절됨을 알 수 있었다.
- 발아 7일째 서광 유식물체의 자엽절편체를 BA와 IAA가 조합된 배지에 치상한 다음 4주 후 shoot 발생률을 조사한 결과 2 mg/L BA + 0.1 mg/L IAA 배지에서 shoot 유도율이35.1%로 가장 높았다. BA 1 mg/L과 IAA 0.
- 4배 높았다. 완전히 익은 형질전 환 토마토 과실의 SOD 비활성도는 대조구에 비해 서광과 꼬꼬는 각각 약 1.6배와 약 2.2배 높았다. 이상으로 과실의 SOD 비활성도가 약 2배 높은 토마토 식물체를 개발할 수 있었다.
- 2배 높았다. 이상으로 과실의 SOD 비활성도가 약 2배 높은 토마토 식물체를 개발할 수 있었다.
- 이상의 결과로서 카사바 유래의 CuZuSOD 유전자가 토마토에 정상적으로 도입되어 발현됨이 확인되었으며, 특히 오이에서 분리된 ASO promoter가 오이과실뿐 아니라 토마토 과 실에도 강하게 발현됨이 확인되었다. ASO promoter를 이용하여 SOD 유전자를 오이과실에 과량 발현하는 형질전환체가 개발되고 있다.
- 5%로 나타났다. 즉 토마토 자엽절편체로부터 shoot 유도는 IAA가 첨가된 배지 에 BA 농도가 높을수록 더 높은 빈도를 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 또한 shoot 유도는 자엽절편의 절단면인 기저부에서 일어났으며 그 이외의 부분에서는 유도되지 않았다.
- SOD 비활성도는 서광은 익기 시작한 과실(MF)에서 증가하였으나, 꼬꼬에서는 녹색 과실에서부터 모든 단계에서 대조구보다 높았다 (Figure 4C). 형질전환 서광과 꼬꼬의 완전히 익은 과실의 SOD 비활성도는 각각 약 212 unit와 292 unit로 꼬꼬가 서광보다 약 1.4배 높았다. 완전히 익은 형질전 환 토마토 과실의 SOD 비활성도는 대조구에 비해 서광과 꼬꼬는 각각 약 1.
후속연구
- 그러나 SOD가 효소로서 안정하지 않고 고분자물질로서 생체내 수송의 문제 등으로 산업적 개발에 제약이 되고 있다. 따라서 먹는 백신 (edible vaccine) 바나나 혹은 비타민 A를 첨가시킨 쌀 (golden rice)과 같이 정제 과정이 필요 없이 SOD를 이용할 수 있는 식물조직에 과량 발현하는 식물생체반응기 (plant bioreactor)로서 개발의 가능성이 기대된다. (Goddijin and Pen 1995; Mason and Amtzen 1995).
- ASO promoter는 유용 유전자를 오이 토마토뿐 아니라 다양한 식물종의 과실에 발현시키고자 할 때 폭넓게 이용될 수 있는 가능성이 처음으로 시사되었다. 본 연구에서 획득한 SOD 고함유 토마토는 기능성 식품으로서 개발의 가능성이 있기 때문에 제품으로서 용도개발 및 품종육성에 관한 후속연구가 요구된다.
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