[논문]연자육 추출물의 항산화 및 산화적 DNA 손상억제 활성

박재호; 이병구; 변광인; 김도완

doi:10.6116/kjh.2010.25.4.055

연자육 추출물의 항산화 및 산화적 DNA 손상억제 활성
Antioxidant Activities and Inhibitory Effect on Oxidative DNA Damage of Nelumbinis Semen Extracts 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.25 no.4, 2010년, pp.55 - 59

박재호 (중원대학교 한방산업학부) , 이병구 (영남대학교 식품외식학부) , 변광인 (영남대학교 식품외식학부) , 김도완 (중원대학교 한방산업학부)

초록
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본 연구에서는 연자육의 항산화 활성을 평가하기 위해 EtOAC 분획물과 열수 추출물을 이용하여 DPPH, Hydroxyl 라디칼 소거활성과 $Fe^{2+}$ 킬레이팅 활성을 측정하였다. 또한 산화적 DNA 손상억제 효과는 ${\phi}X$-174 RF I plasmid DNA cleavage assay를 통해 평가하였다. EtOAC 분획물은 $200{\mu}g/m{\ell}$에서 DPPH, Hydroxyl 라디칼 소거활성과 $Fe^{2+}$ 킬레이팅 활성이 각각 96.54%, 55.27%, 66.17%의 활성이 나타났으며, 열추 추출물에서는 각각 21.25%, 15.72%, 30.52%로 열수 추출물에 비해 EtOAC 분획물의 항산화 활성이 높은 것으로 나타났다. 또한 ${\phi}X$-174 RF I plasmid DNA cleavage assay에서 EtOAC 추출물은 $200{\mu}g/m{\ell}$에서 76%의 높은 억제 효과가 나타난 반면, 열수 추출물은 6%의 낮은 DNA 산화적 손상억제 효과를 나타내었다. 각 추출물의 총 페놀 함량을 조사한 결과 열수 추출물에 비해 EtOAC 분획물이 높은 것으로 나타났다. 항산화 활성과 DNA 산화적 손상억제 효과가 높은 EtOAC 분획물을 GC/MS에 의해 분석한 결과, Benzeneethanol, 3-methyl-Benzoic acid, 4-ethyl-Phenol, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)Phenol 등 페놀성 화합물이 다수 동정되었다. 본 연구결과에 의해 연자육은 항산화 및 암 예방적 소재로써의 새로운 기능성 식품소재로서 충분한 가능성이 있다고 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Objective : This study was conducted to investigate the antioxidant activity and inhibitory effect on oxidative DNA damage of Nelumbinis Semen Extracts Methods : Nelumbins semen were extracted with hot-water and ethylacetate (EtOAC). The 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and hydroxyl radical scavenging assay and $Fe^{2+}$ chelating assay were performed for antioxidative effect and ${\phi}X$-174 RF I DNA cleavage assay and intracellular DNA damage assay were used for inhibitory effect on intracellular DNA damage. Results : In DPPH, Hydroxyl radical scavenging activity and $Fe^{2+}$ chelating activity of EtOAC extracts were 96.22%, 53.53%, 64.72%, while those of hot-water extracts were 20.86%, 10.72%, 29.74% at $200{\mu}g/m{\ell}$, respectively. In ${\phi}X$-174 RF I plasmid DNA cleavage assay, the protective effects of EtOAC and hot-water extracts against oxidative DNA damage were 76% and 6% at $200{\mu}g/m{\ell}$, respectively. Conclusion : These results indicated that the seed extracts of Nelumbo nucifera can be used as a natural antioxidants, which effectively inhibits the oxidative DNA damage.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 연자육 추출물의 항산화 및 산화적 DNA 손상 억제활성을 평가하고, 추출물 내 항산화 물질을 분석함으로써, 연자육의 항산화 및 암 예방적 소재로서의 이용 가능성을 탐색하고자 한다.
본 연구에서는 연자육의 항산화 활성을 평가하기 위해 EtOAC 분획물과 열수 추출물을 이용하여 DPPH, Hydroxyl 라디칼 소거활성과 Fe²⁺ 킬레이팅 활성을 측정하였다. 또한 산화적 DNA 손상억제 효과는 _φ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay를 통해 평가하였다.

제안 방법

30분 후 반응 혼합물 20 ㎕와 _φ X-174 RF I plasmid DNA 5 ㎕를 다시 혼합하여 37 ℃에서 약 30분간 재반응 시켰다. 5 ㎕ 버퍼(50% glycerol(v/v), 40 mM EDTA and 0.05% bromophenol blue)를 첨가하고 1% agarose gel로 전기영동을 실시한 후 ethidium bromide로 염색하여 UV하에서 사진 촬영하였다.
EtOAC 분획과 열수 추출에 의해 분리된 연자육 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH, Hydroxyl 라디칼 소거 활성과 Fe²⁺ 킬레이팅 활성을 측정하였다(Figure 1). DPPH 자유라디칼 소거법은 추출물 내 항산화 물질에 의해 전자나 수소를 받아 불가역적으로 안정한 분자를 형성하여 환원되어 짐에 따라 짙은 자색이 탈색되어지는 원리에 의해 측정 되었다.
. 각 추출물을 메탄올에 10 ㎎/㎖농도로 녹인 시료 1 ㎖와 Folin 시약 1 ㎖를 혼합하여 실온에서 3분간 정치한 뒤 10% Na₂CO₃ 용액 1 ㎖를 혼합한 후 실온에서 1시간 정치한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 화합물의 함량은 gallic acid를 이용하여 검량곡선을 작성하고 gallic acid에 대한 당량으로 환산하였다.
건조된 연자육 300 g을 분쇄한 후 80% methanol 1,000㎖을 가하여 3일간 침지한 후 여과하였다. 여과된 추출물은 200 ㎖로 농축한 다음 50 ㎖ 증류수를 첨가하고 이를 petroleum ether로 분획하였다.
또한 산화적 DNA 손상억제 효과는 φ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay를 통해 평가하였다.
메탄올로 조제된 시료(4 ㎎/㎖)를 2 μL주입하여 분석하였다.
5 : 5)의 37℃에서 Fenton 반응에 의해 생성된 hydroxyl 라디칼 760㎕와 농도별 시료 40 ㎕를 혼합한 후 37℃에서 약 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 200 mM sodium salicylate 200㎕를 첨가 한 후 UV/Visible spectrophotometer(Berkman, USA)을 이용하여 562 nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식으로 소거능(%)을 구하였다.
세포는 5일에 1번 계대배양 하였으며, 본 실험을 위해 배양중인 세포를 phosphate buffer saline(PBS)으로 세척한 뒤 0.05% trypsin-0.02% EDTA(Gibco CO, USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심분리 한 후 Coulter counter(Backman,USA)로 세포를 계수한 뒤 6 well plate에 일정수(2 × 106/㎖)를 분할하여 24시간 동안 배양하였다.
건조된 연자육 300 g을 분쇄한 후 80% methanol 1,000㎖을 가하여 3일간 침지한 후 여과하였다. 여과된 추출물은 200 ㎖로 농축한 다음 50 ㎖ 증류수를 첨가하고 이를 petroleum ether로 분획하였다. 분획된 수용층을 다시 ethyl acetate(EtOAC)로 분획한 다음, EtOAC 층을 sodium sulfate anhydrous로 탈수시킨 뒤 감압 농축하여 건조 하였다.
연자육 EtOAC 분획물의 항산화 물질을 동정하기 위하여 GC/MS(HP6890GC/5973MSD, USA)을 이용하여 분석하였다. Column은 Ultra 2(Crosslinked 5% PH ME siloxane, HP-19091B), Oven 조건은 100℃에서 분당 4℃씩 295℃까지 승온 하였다.
연자육 추출물의 산화적 DNA 손상 억제 활성은 φ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay를 이용한 비 세포적 시스템과 intracellular DNA migration assay(Figure 3)를 통한 세포적 시스템으로 평가 되었다.
05% bromophenol blue) 10 ㎕를 첨가한 후 70℃에서 10분간 방치 후 2% agarose 겔로 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV하에서 사진 촬영을 하였다.
세포 용해 후 원심분리를 통해 세포 잔해물을 제거하고 RNase 5 ㎕ 첨가 후 약 55℃에서 60분간 재 반응 시켰다. 주입버퍼(50% glycerol (v/v), 40 mM EDTA and 0.05% bromophenol blue) 10 ㎕를 첨가한 후 70℃에서 10분간 방치 후 2% agarose 겔로 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV하에서 사진 촬영을 하였다.
O 1,000 ㎖을 가하여 100℃에서 2시간 동안 추출하였다. 추출물을 여과한 뒤 동결건조기를 이용하여 건조 하였다.

대상 데이터

NIH3T3 세포는 10%의 fetal calf serum(FBS)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
대구약업주식회사(원산지 베트남, 제조번호 DA-67-3, 검사기관 광명생약실험실)에서 수입한 것을 경북 안동 한약재 도매상에서 구입하여 사용하였다.
Column은 Ultra 2(Crosslinked 5% PH ME siloxane, HP-19091B), Oven 조건은 100℃에서 분당 4℃씩 295℃까지 승온 하였다. 운반체는 He 가스를 사용하였으며, 유속은 0.8 ㎖/min으로 분석하였다. 각 분리된 peak는 mass spectrum으로부터 Library(Wiley7N)를 이용하여 동정되었다.
한국 세포주 은행에서 마우스 피부 섬유아세포(NIH 3T3, KCLB No. 21658)를 분양받아 배양하면서 본 연구에 사용하였다.

이론/모형

각 추출물의 DPPH에 대한 전자 공여능은 Bondet¹²⁾ 방법에 의해 측정하였다. 여러 농도의 추출물 40 ㎕를 300 μM DPPH/EtOH 760 ㎕에 첨가한 후 30분간 37℃에서 방치한후 UV/Visible spectrophotometer(Berkman, USA)을 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다.
각 추출물의 hydroxyl 라디칼 소거 능은 Smirnoff와 Cumbes¹³⁾ 방법에 따라 FeSO₄와 H₂O₂의 Fenton 반응에 의해 생성된 Hydroxyl 라디칼에 의해 가수분해 되는 정도를 통해 측정되었다. 1.
연자육 추출물의 산화적 φ X-174 RF I plasmid DNA cleavage 억제활성은 Jung(2001) 등의 방법으로 측정되었다.
연자육 추출물의 철-킬레이팅 활성은 Hus¹⁴⁾ 방법에 의해 측정되었다. 2 mM FeCl₂ 60 ㎕, 농도별 시료 40 ㎕와 증류수 700 ㎕를 혼합한 후 상온에서 약 10분간 반응 시켰다.
연자육 추출물의 총 페놀 화합물 함량은 Folin-denis 방법으로 비색 정량하였다¹⁶⁾. 각 추출물을 메탄올에 10 ㎎/㎖농도로 녹인 시료 1 ㎖와 Folin 시약 1 ㎖를 혼합하여 실온에서 3분간 정치한 뒤 10% Na₂CO₃ 용액 1 ㎖를 혼합한 후 실온에서 1시간 정치한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

성능/효과

또한 산화적 DNA 손상억제 효과는 _φ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay를 통해 평가하였다. EtOAC 분획물은 200 ㎍/㎖에서 DPPH, Hydroxyl 라디칼 소거활성과 Fe²⁺킬레이팅 활성이 각각 96.54%, 55.27%, 66.17%의 활성이나타났으며, 열추 추출물에서는 각각 21.25%, 15.72%, 30.52%로 열수 추출물에 비해 EtOAC 분획물의 항산화 활성이 높은 것으로 나타났다. 또한 _ψ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay에서 EtOAC 추출물은 200 ㎍/㎖에서 76%의 높은 억제 효과가 나타난 반면, 열수 추출물은 6%의 낮은 DNA 산화적 손상억제 효과를 나타내었다.
정상적인 plasmid DNA는 supercoiled(SC) 형태로 존재하나 추출물 처리 없이 H₂O₂와 철의 fenton 반응에 의해 생성된 hydroxyl radical 또는 iron 존재 하에서는 산화적 손상을 받아 open-circular(OC)형태로 전환된다. Intracellular DNA migration assay를 통한 연자육 추출물의 DNA 손상 억제 활성을 평가한 결과(Figure 3), hydroxyl radical 소거 활성이 높은 EtOAC 분획물은 200 ㎍/㎖와 40 ㎍/㎖ 농도에서 대조구와 비교하여 높은 DNA 손상 억제 활성을 나타내었고(Figure 3A), 열수 추출물에서는 200 ㎍/㎖ 농도에서만 DNA 손상 억제 활성을 나타나 열수 추출물의 DNA 손상 억제활성이 낮은 것으로 나타났다(Figure 3B).
또한 _ψ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay에서 EtOAC 추출물은 200 ㎍/㎖에서 76%의 높은 억제 효과가 나타난 반면, 열수 추출물은 6%의 낮은 DNA 산화적 손상억제 효과를 나타내었다. 각 추출물의 총 페놀 함량을 조사한 결과 열수 추출물에 비해 EtOAC 분획물이 높은 것으로 나타났다. 항산화 활성과 DNA 산화적 손상억제 효과가 높은 EtOAC 분획물을 GC/MS에 의해 분석한 결과, Benzeneethanol, 3-methyl-Benzoic acid, 4-ethyl-Phenol, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)Phenol 등 페놀성 화합물이 다수 동정되었다.
본 연구결과에 의하면 연자육 EtOAC 분획물이 열수 추출물에 비해 항산화 활성, DNA 손상 억제 효과 그리고 총 페놀의 함량이 월등이 높은 것으로 나타났다. 따라서 연자육 추출물의 항산화력은 산화적 DNA 손상억제에 매우 효율적이고, 이러한 결과는 추출물내 페놀성 화합물에 의한 것으로 사료된다.
또한 ψ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay에서 EtOAC 추출물은 200 ㎍/㎖에서 76%의 높은 억제 효과가 나타난 반면, 열수 추출물은 6%의 낮은 DNA 산화적 손상억제 효과를 나타내었다.
25%의 소거 활성을 나타내었다. 또한 Hydroxyl 라디칼 소거활성과 Fe²⁺킬레이팅 활성은 추출물 200 ㎍/㎖에서 EtOAC 분획물이 55.27%, 66.17%의 활성이 각각 나타났으며, 열수 추출물에서는 각각 15.72%, 30.52%로 열수 추출물에 비해 EtOAC 분획물의 항산화 활성이 매우 높은 것으로 나타났다.
이러한 결과는 각 추출물 내 페놀성 화합물 함량의 차이에 의한 것으로 사료되어진다. 또한 페놀성 화합물의 함량이 높은 EtOAC 분획물을 GC/MS에 의해 분석한 결과(Figure 5, Table 1), Benzeneethanol, 3-methyl-Benzoic acid, 4-ethyl-Phenol, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl) Phenol 등 페놀성 화합물이 다수 동정되었다.
본 연구결과에 의하면 연자육 EtOAC 분획물이 열수 추출물에 비해 항산화 활성, DNA 손상 억제 효과 그리고 총 페놀의 함량이 월등이 높은 것으로 나타났다. 따라서 연자육 추출물의 항산화력은 산화적 DNA 손상억제에 매우 효율적이고, 이러한 결과는 추출물내 페놀성 화합물에 의한 것으로 사료된다.
페놀성 화합물은 과일이나 채소가 분해될 때 그리고 녹차, 홍차 및 와인 등에서 주로 발견되는 화합물로서 항균, 항 알러지 효과와 천연 항산화 물질로서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 본 연구결과에 의하면 열수 추출물에 비해 EtOAC 분획물의 항산화 및 산화적 DNA 손상 억제 활성이 매우 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 각 추출물 내 페놀성 화합물 함량의 차이에 의한 것으로 사료되어진다.
연자육의 EtOAC 분획물과 열수 추출물의 총페놀 화합물의 함량을 조사한 결과(Figure 4), EtOAC 분획물의 총페놀 화합물의 함량은 31.8%였으며, 열수 추출물은 3.1%로 나타났다. 페놀성 화합물은 과일이나 채소가 분해될 때 그리고 녹차, 홍차 및 와인 등에서 주로 발견되는 화합물로서 항균, 항 알러지 효과와 천연 항산화 물질로서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.
각 추출물의 총 페놀 함량을 조사한 결과 열수 추출물에 비해 EtOAC 분획물이 높은 것으로 나타났다. 항산화 활성과 DNA 산화적 손상억제 효과가 높은 EtOAC 분획물을 GC/MS에 의해 분석한 결과, Benzeneethanol, 3-methyl-Benzoic acid, 4-ethyl-Phenol, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)Phenol 등 페놀성 화합물이 다수 동정되었다. 본 연구결과에 의해 연자육은 항산화 및 암 예방적 소재로써의 새로운 기능성 식품소재로서 충분한 가능성이 있다고 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	연자육이란?	연자육(Nelumbins semen)은 수련과에 속하는 연꽃 (Nelumbo nucifera)의 성숙한 종자로 가을에 수확하여 과피를 제거하고 말린 것으로 한방에서는 위장을 강화시켜 설사를 억제하고, 신장을 강화하여 강정작용이 있으며, 신경을 안정시키는 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다8). 한의학 측면에서 연자육은 맛이 달고 성질이 순하며, 歸經은 脾, 腎, 心이고, 비장강화, 설사완화, 신장보호, 사정억제 등의 효능 보고되고 있다9).
	식품과학 분야에서 천연 약용식물로부터 항산화력이 우수한 물질을 탐색하는 연구가 활발히 행해지고 있는 이유는?	예를 들어 기존에 많이 사용하고 있는 항산화제로는 butylated hydroxyanisole(BHA), butylated hydroxytoluene(BHT)와 같은 합성 항산화제와 토코페롤과 같은 천연 항산화 제가 있다. BHT와 BHA는 우수한 항 산화력을 지니고 있지만 과량 섭취 시 암유발 가능성 등 안정성이 논란이 되고 있으며, 토코페롤은 가격이 높아 이들을 대체할 수 있는 안전하고 경제적인 항산화제의 개발이 요구되고 있다3). 이에 식품과학 분야에서는 천연 약용식물로부터 항 산화력이 우수한 물질을 탐색하는 연구가 활발히 행해지고 있으며 나아가 이들 생리활성 소재를 추출하여 첨가한 기능성 식품의 개발에 대한 연구가 진행되고 있다4).
	연자육은 한방에서 어떠한 효능이 있는것으로 알려져 있는가?	연자육(Nelumbins semen)은 수련과에 속하는 연꽃 (Nelumbo nucifera)의 성숙한 종자로 가을에 수확하여 과피를 제거하고 말린 것으로 한방에서는 위장을 강화시켜 설사를 억제하고, 신장을 강화하여 강정작용이 있으며, 신경을 안정시키는 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다8). 한의학 측면에서 연자육은 맛이 달고 성질이 순하며, 歸經은 脾, 腎, 心이고, 비장강화, 설사완화, 신장보호, 사정억제 등의 효능 보고되고 있다9). 최근 연구결과에 의하면 연자육은 고혈압과 부정맥과 같은 심장혈관 질환 치료 작용10)과 항암제, 이뇨제, 피부질환 치료 효능이 있다고 보고되었다11).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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