In order to develop new skin whitening agents, we prepared the $CH_2Cl_2$ layer (NGC) and BuOH layer (NGB) of 75% EtOH extract of the Nelumbinis nucifera Gaertner. We measured their tyrosinase inhibitory activity in vitro and melanin synthesis inhibitory activity in B16-F1 melanoma cells....
In order to develop new skin whitening agents, we prepared the $CH_2Cl_2$ layer (NGC) and BuOH layer (NGB) of 75% EtOH extract of the Nelumbinis nucifera Gaertner. We measured their tyrosinase inhibitory activity in vitro and melanin synthesis inhibitory activity in B16-F1 melanoma cells. They did not show inhibitory activity against mushroom tyrosinase but showed melanin synthesis inhibitory activity in a dose-dependent manner. In a melanin synthesis inhibition assay, NGC and NGB suppressed melanin production up to 52% and 46% at a concentration of $100{\mu}g/mL$, respectively. To elucidate the mechanism of the inhibitory effects of NGC and NGB on melanogenesis, we measured the expression of melanogenesis-related proteins by western blot assay. As a result, NGC suppressed the expression of tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), phosphorylated cAMP responsive element binding (p-CREB) protein, and microphthalmia associated transcription factor (MITF). And NGB inhibited the protein expression of tyrosinase and MITF, but had no significant effect on TRP-1, TRP-2, and p-CREB expression. Moreover, NGB increased the expression of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK). In addition, we examined the inhibitory effect on the glycosylation of tyrosinase. As a result, NGC and NGB inhibited the activity of ${\alpha}$-glucosidase in vitro and the glycosylation of tyrosinase in B16-F1 melanoma cells. From these results, we concluded that NGC and NGB could be used as active ingredients for skin whitening.
In order to develop new skin whitening agents, we prepared the $CH_2Cl_2$ layer (NGC) and BuOH layer (NGB) of 75% EtOH extract of the Nelumbinis nucifera Gaertner. We measured their tyrosinase inhibitory activity in vitro and melanin synthesis inhibitory activity in B16-F1 melanoma cells. They did not show inhibitory activity against mushroom tyrosinase but showed melanin synthesis inhibitory activity in a dose-dependent manner. In a melanin synthesis inhibition assay, NGC and NGB suppressed melanin production up to 52% and 46% at a concentration of $100{\mu}g/mL$, respectively. To elucidate the mechanism of the inhibitory effects of NGC and NGB on melanogenesis, we measured the expression of melanogenesis-related proteins by western blot assay. As a result, NGC suppressed the expression of tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), phosphorylated cAMP responsive element binding (p-CREB) protein, and microphthalmia associated transcription factor (MITF). And NGB inhibited the protein expression of tyrosinase and MITF, but had no significant effect on TRP-1, TRP-2, and p-CREB expression. Moreover, NGB increased the expression of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK). In addition, we examined the inhibitory effect on the glycosylation of tyrosinase. As a result, NGC and NGB inhibited the activity of ${\alpha}$-glucosidase in vitro and the glycosylation of tyrosinase in B16-F1 melanoma cells. From these results, we concluded that NGC and NGB could be used as active ingredients for skin whitening.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 NGB와 NGC의 멜라닌 합성 억제효과가 이러한 신호전달 과정과 연관이 있는지 확인하기 위하여 α-MSH에 의해 멜라닌 합성이 활성화된 세포에 NGB와 NGC를 처리 후 이들 신호전달 과정에 관여하는 주요 단백질인 p-CREB과 MITF의 발현량을 western blot assay를 통하여 측정하였다.
본 실험에서는 NGB와 NGC의 멜라닌 합성 저해효과가 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2와 같은 멜라닌 합성 효소의 발현 억제와 관련된 영향인지 확인하기 위하여 western blot assay를 수행하였다. 즉, 100 µg/mL 농도의 NGB와 NGC를 B16-F1 melanoma cell에 처리한 후 멜라닌 합성에 관여하는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현량을 측정하였다.
본 실험에서는 NGB와 NGC의 멜라닌 합성 저해효과가 tyrosinase의 glycosylation 과정을 저해하는 것과 관련이 있는지확인하기 위하여 in vitro 상에서 α-glucosidase 활성 억제효과를 측정하였다.
본 연구에서는 연자육을 화장품의 새로운 미백소재로 이용하고자 연자육 에탄올추출물의 CH2Cl2 분획물인 NGC와 nBuOH 분획물인 NGB를 얻어 이들의 미백활성을 측정하고, 그 작용기전에 대해 확인하였다. NGC와 NGB는 B16-F1 melanoma cell을 이용한 멜라닌 합성 억제효과 측정 결과, 미백소재로 알려져 있는 알부틴과 유사한 정도의 미백 활성을 가지는 것으로 확인되었다.
본 연구에서는 연자육을 화장품의 새로운 미백소재로 이용하기 위해 in vitro 상의 tyrosinase 활성 억제효과와 B16-F1 melanoma cell에서의 멜라닌 합성 억제효과를 측정하여 미백효과를 평가하였고, 그 작용기전을 확인하기 위해 멜라닌합성 과정에 관여하는 단백질의 발현과 N-glycosylation 저해 효과 등을 측정하였다.
제안 방법
α-Glucosidase가 ρ-nitrophenyl (ρNP) glycoside의 glycoside 부분을 기질로 인식하여, ρNP와 glycoside를 효소반응으로 끊어주고 여기에서 끊어져 나온 ρNP의 양을 405 nm에서 흡광도를 측정하여 이것으로 α-glucosidase activity를 간접적으로 측정하였다 [55].
β-actin은 각각 의 시료에 동양의 단백질이 들어있는지 확인하기 위한 대조군으로 사용하였다.
B16-F1 melanoma cell을 10% FBS를 첨가한 DMEM에 1×106 cells의 밀도로 100 mm dish에 분주하여 37°C, 5% CO2 조건하에서 24 h 동안 배양하였다.
Membrane을 5% skim milk solution으로 1 h 동안 blocking한 뒤 primary antibody로 상온에서 3~4 h 동안 반응시키고, horseradish peroxidase가 결합된 secondary antibody로 처리하였다. Chemiluminescence kit을 이용하여 발색된 밴드의 강도를 확인하였다. β-actin은 각각 의 시료에 동양의 단백질이 들어있는지 확인하기 위한 대조군으로 사용하였다.
주로 세포의 증식, 분화에 관여하는 것으로 알려진 MAPK 경로에 속하는 ERK 신호는 MITF의 인산화를 유도하여 MITF의 ubiquitination이 이루어져 proteosomal degradation을 일으키게 됨으로써 멜라닌 합성을 감소시키는 것으로 알려져 있다 [13,57]. NGB와 NGC가 이러한 ERK pathway 활성에 영향을 미치는지 확인하고자 B16-F1 melanoma cell에 NGB와 NGC를 처리한 후 p-ERK의 발현을 측정하였으며 그 결과는 Fig. 5와 같다. NGB를 처리한 경우 ERK가 활성화되어 p-ERK가 증가되었으나, NGC를 처리한 경우에는 ERK의 활성화에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
Tyrosinase에 대한 활성은 각 농도별 시료 0.9 mL, 0.1 M 인산완충액 (pH 6.8) 1.0 mL, 1.5 mM L-tyrosine 용액 1.0 mL을 넣은 후, 37°C에서 10 min 간 반응시킨 뒤 mushroom tyrosinase(1,500 units/mL) 0.1 mL를 첨가하여 37°C에서 10 min 간 반응시킨 후 UV-Vis spectrophotometer를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.
흡광도 측정은 BIO-TEK Instruments (USA)의 EL800 microplate reader를 사용하였다. Western blot을 위해 Bio-rad (USA)의 western blot kit 및 semi-dry transfer system을 사용하였고 image analysis system (Bio-rad, USA)으로 결과를 확인하였다. 항체는 Santa Cruz Biotech (USA), Cell Signaling Technology (USA), Abcam Biochemicals (UK)로부터 구입하였다.
NGC와 NGB는 B16-F1 melanoma cell을 이용한 멜라닌 합성 억제효과 측정 결과, 미백소재로 알려져 있는 알부틴과 유사한 정도의 미백 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 그러나 in vitro 상의 mushroom tyrosinase의 활성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 tyrosinase의 활성을 직접적으로 저해하지 않고 멜라닌 합성신호전달 경로에 작용할 것으로 추정되어 NGC와 NGB에 의한 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현 양상을 분석하였다. 먼저 멜라닌 합성 경로에 작용하는 효소들 즉, tyrosinase와 TRP1, TRP-2의 발현 정도를 측정한 결과 NGC는 tyrosinase, TRP1, TRP-2의 발현을 모두 억제하였으며, NGB는 tyrosinase의 발현만을 억제하였다.
대조군은 α-MSH만 첨가한 것으로 하였으며 양성 대조군으로는 알부틴을 사용하였다.
대조군은 시료를 처리하지 않은 배양액으로 설정한 후 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존능력은 다음의 식에 따라 계산하였다.
따라서 100 µg/mL 농도 이하에서 멜라닌 합성 저해 및 단백질 발현 실험을 진행하였다.
이러한 결과로 보아 NGB와 NGC는 tyrosinase의 활성을 직접적으로 저해하지 않고 멜라닌 합성 신호전달 경로에 작용할 것으로 추정된다. 따라서 NGB와 NGC에 의한 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현 양상을 분석하였다.
멜라닌 함량 측정은 Oka 등의 방법 [54]을 변형하여 사용하였다. B16-F1 melanoma cell을 6-well plate에 1×105 cells/well이 되게 준비한 한 후, 24 h 동안 37°C, CO2 incubator에서 배양하였다.
Western blot 실험의 단백질 분리법과 같은 방법으로 단백질을 분리하고 정량한 후 100 µg의 단백질을 denaturing buffer와 섞어 100°C에서 10 min 동안 반응시킨 후 Endo H 효소 (New England BioLabs, USA)와 반응 버퍼를 첨가하여 37°C에서 1 h 동안 반응시켰다. 반응물은 western blot을 수행하여 fully glycosylated protein과 naked protein을 image analysis system으로 분석하였다.
배양 후 배양액을 제거하고 시료를 농도별로 배지에 희석하여 교체한 후, 최종 200 nM α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)가 되도록 첨가하여 48 h 동안 더 배양하였다. 배양 후 MTT assay를 통하여 세포 생존율을 확인하였다.
본 실험에서 B16-F1 melanoma cell에 대한 시료의 처리농도를 결정하기 위해 MTT [3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenytetrazolium bromide, Sigma] assay를 Mosmann의 방법[53]을 변형하여 실시하였다. 이 분석법은 노란색의 수용성 기질인 MTT를 진청색의 비수용성 formazan으로 변환시키는 살아있는 세포의 mitochondria dehydrogenase의 능력을 이용한 방법이다.
본 실험에서는 100 µg/mL 농도의 NGB와 NGC를 B16-F1 melanoma cell에 48 h 처리 후 단백질을 모아 Endo H로 1 h 처리하고 western blot assay를 실시하여 NGB와 NGC가 tyrosinase의 glycosylation을 저해하였는지 관찰하였다.
이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 housekeeping gene인 β-actin을 대조군으로 사용하였다.
이와 같이 본 실험에서도 NGB와 NGC가 α-glucosidase 활성을 저해하였으며, 이로써 tyrosinase의 glycosylation을 억제할 가능성이 있는 것으로 판단되어 이후 세포 수준에서의 N-glycosylation 저해효과를 측정하였다.
즉, 100 µg/mL 농도의 NGB와 NGC를 B16-F1 melanoma cell에 처리한 후 멜라닌 합성에 관여하는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현량을 측정하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 연자육은 국내산으로 경기도 파주의 (주)지유본초로부터 구입하여 사용하였다. 연자육의 추출과정 및 분획에 사용된 용매들은 시약급을 사용하였다.
연자육의 추출과정 및 분획에 사용된 용매들은 시약급을 사용하였다. 세포배양에 필요한 배지 및 시약은 Hyclone (USA), Sigma (USA)로부터 구입하여사용하였다. 흡광도 측정은 BIO-TEK Instruments (USA)의 EL800 microplate reader를 사용하였다.
세포주는 마우스 흑색종 세포주인 B16-F1 melanoma cell을 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양받아 사용하였으며, 세포배양에 사용된 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)는 10% fetal bovine serum (HyClone Lab., USA), 1% antibiotic antimycotic (100 U/mL penicillin and 50 µg/mL streptomycin, Life Tech Inc., USA)을 혼합한 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
Western blot을 위해 Bio-rad (USA)의 western blot kit 및 semi-dry transfer system을 사용하였고 image analysis system (Bio-rad, USA)으로 결과를 확인하였다. 항체는 Santa Cruz Biotech (USA), Cell Signaling Technology (USA), Abcam Biochemicals (UK)로부터 구입하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 평균±표준편차로 표기하였고 통계적 유의성은 SPSS를 이용한 Student's t-test를 시행하여 p-value를 구하였으며, p<0.05인 경우 *, p<0.01인 경우 **로 유의성이 있다고 표시하였다.
이론/모형
NGB와 NGC의 실험에 사용할 농도범위를 결정하기 위해 MTT assay를 시행하였다. 세포 수준의 연구에 많이 이용되고있는 MTT assay는 cell proliferation과 viability의 in vitro 분석에 매우 유용하게 사용되고 있다 [53].
The cells were treated with various concentration of NGB and NGC for 48 h. The cell viability was measured by the MTT method. The results were expressed as the mean±S.
본 실험에서는 100 µg/mL 농도의 NGB와 NGC를 B16-F1 melanoma cell에 48 h 처리 후 단백질을 모아 Endo H로 1 h 처리하고 western blot assay를 실시하여 NGB와 NGC가 tyrosinase의 glycosylation을 저해하였는지 관찰하였다. 이 때, 양성대조군으로는 NB-DNJ를 사용하였다. Fig.
성능/효과
또한 Fig. 3의 (b), (c)에서와 같이 TRP-1과 TRP-2의 경우, NGB를 처리한 군에서는 저해효과가 나타나지 않았으며 NGC를 처리한 군에서는 TRP-1과 TRP-2의 발현도 저해되었는데, TRP-1은 72%, TRP-2는 15%가 저해됨을 확인하였다. 알부틴을 처리한 경우, TRP-1의 발현은 약 20% 저해하였으며, TRP-2에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
따라서 본 연구에서는 NGB와 NGC의 멜라닌 합성 억제효과가 이러한 신호전달 과정과 연관이 있는지 확인하기 위하여 α-MSH에 의해 멜라닌 합성이 활성화된 세포에 NGB와 NGC를 처리 후 이들 신호전달 과정에 관여하는 주요 단백질인 p-CREB과 MITF의 발현량을 western blot assay를 통하여 측정하였다. Fig. 4에서와 같이 p-CREB의 경우 NGC를 처리한 군에서만 46%의 저해효과를 나타내었고, MITF의 경우 NGB와 NGC 처리군 모두에서 저해효과를 확인할 수 있었다. 즉, NGB를 처리한 군은 37%, NGC를 처리한 군은 62%의 MITF 발현저해율을 나타내었다.
NGB와 NGC에 의한 B16-F1 melanoma cell의 생존율을 확인한 결과 (Fig. 1), NGB와 NGC 모두 100 µg/mL 이하의 농도로 처리시 세포생존율이 80% 이상으로 나타났지만 200 µg/mL 이상의 농도로 처리시 둘 다 세포독성으로 인해 60% 이하로 급격히 생존율이 저하되었다.
분획물인 NGC와 nBuOH 분획물인 NGB를 얻어 이들의 미백활성을 측정하고, 그 작용기전에 대해 확인하였다. NGC와 NGB는 B16-F1 melanoma cell을 이용한 멜라닌 합성 억제효과 측정 결과, 미백소재로 알려져 있는 알부틴과 유사한 정도의 미백 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 그러나 in vitro 상의 mushroom tyrosinase의 활성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 tyrosinase의 활성을 직접적으로 저해하지 않고 멜라닌 합성신호전달 경로에 작용할 것으로 추정되어 NGC와 NGB에 의한 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현 양상을 분석하였다.
즉, NGB 를 처리한 군에서는 35%, NGC를 처리한 군에서는 63%의 tyrosinase 발현 저해효과를 확인하였다. 같은 농도의 알부틴을 처리한 군의 tyrosinase 발현 저해율은 2% 정도로, tyrosinase 단백질의 발현에는 거의 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 또한 Fig.
따라서 세포수준에서 Endo H 처리를 통해 tyrosinase의 glycosylation을 저해하는지 여부를 확인한 결과 NGB와 NGC 모두 tyrosinase의 glycosylation을 저해하는 것으로 확인되었다. 결과를 종합해보면 NGC는 멜라닌 합성의 신호전달 경로 중 cAMP / PKA 경로를 저해함으로써 전사인자인 p-CREB와 MITF의 발현을 저해하고, 그 결과 tyrosinase와 TRP-1, TRP2의 발현을 저해함으로써 멜라닌 합성을 억제하는 기전과 tyrosinase의 N-glycosylation 과정을 저해함으로써 tyrosinase 활성을 억제하는 기전이 복합적으로 작용하여 멜라닌 합성이 저해되는 것으로 판단된다. 또한 NGB는 ERK pathway의 활성화를 통해 MITF의 분해를 촉진시키고 이로 인해 tyrosinase의 발현을 감소시키는 기전과 역시 tyrosinase의 N-glycosylation 과정을 저해함으로써 tyrosinase 활성을 억제하는 2가지 기전이 복합적으로 작용함으로써 멜라닌 합성을저해하는 것으로 사료된다.
먼저 멜라닌 합성 경로에 작용하는 효소들 즉, tyrosinase와 TRP1, TRP-2의 발현 정도를 측정한 결과 NGC는 tyrosinase, TRP1, TRP-2의 발현을 모두 억제하였으며, NGB는 tyrosinase의 발현만을 억제하였다. 다음으로 NGC와 NGB의 멜라닌 합성 억제효과가 cAMP / PKA 경로에 작용한 결과인지를 확인하고자 p-CREB와 MITF의 발현 정도를 측정한 결과 NGC는 pCREB과 MITF의 발현을 모두 억제하였으며, NGB는 MITF의 발현만을 억제하는 것으로 확인되었다. 멜라닌 합성 기전중 ERK pathway 활성화에 미치는 영향을 측정한 결과, NGB가 p-ERK의 발현을 상당히 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 B16-F1 melanoma cell에 NGB와 NGC를 각각 0, 20, 50, 100 µg/mL의 농도로 처리하고 48 h이 지난 후 멜라닌 함량을 측정한 결과, 농도 의존적으로 멜라닌 합성이 저해됨을 확인하였다.
또한 tyrosinase glycosylation 저해효과를 확인하고자 먼저 in vitro 상에서 α-glucosidase 저해효과를 측정한 결과 NGC와 NGB 모두 상당한 정도의 저해 활성을 나타내었다. 따라서 세포수준에서 Endo H 처리를 통해 tyrosinase의 glycosylation을 저해하는지 여부를 확인한 결과 NGB와 NGC 모두 tyrosinase의 glycosylation을 저해하는 것으로 확인되었다. 결과를 종합해보면 NGC는 멜라닌 합성의 신호전달 경로 중 cAMP / PKA 경로를 저해함으로써 전사인자인 p-CREB와 MITF의 발현을 저해하고, 그 결과 tyrosinase와 TRP-1, TRP2의 발현을 저해함으로써 멜라닌 합성을 억제하는 기전과 tyrosinase의 N-glycosylation 과정을 저해함으로써 tyrosinase 활성을 억제하는 기전이 복합적으로 작용하여 멜라닌 합성이 저해되는 것으로 판단된다.
결과를 종합해보면 NGC는 멜라닌 합성의 신호전달 경로 중 cAMP / PKA 경로를 저해함으로써 전사인자인 p-CREB와 MITF의 발현을 저해하고, 그 결과 tyrosinase와 TRP-1, TRP2의 발현을 저해함으로써 멜라닌 합성을 억제하는 기전과 tyrosinase의 N-glycosylation 과정을 저해함으로써 tyrosinase 활성을 억제하는 기전이 복합적으로 작용하여 멜라닌 합성이 저해되는 것으로 판단된다. 또한 NGB는 ERK pathway의 활성화를 통해 MITF의 분해를 촉진시키고 이로 인해 tyrosinase의 발현을 감소시키는 기전과 역시 tyrosinase의 N-glycosylation 과정을 저해함으로써 tyrosinase 활성을 억제하는 2가지 기전이 복합적으로 작용함으로써 멜라닌 합성을저해하는 것으로 사료된다. 향후 활성 물질에 대한 분석과 인체실험을 통한 안정성및미백효능의검증이 필요하나연자육은화장품의 새로운 미백 소재로서의 활용가치가 큰 것으로 판단된다.
또한 tyrosinase glycosylation 저해효과를 확인하고자 먼저 in vitro 상에서 α-glucosidase 저해효과를 측정한 결과 NGC와 NGB 모두 상당한 정도의 저해 활성을 나타내었다.
그러나 in vitro 상의 mushroom tyrosinase의 활성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 tyrosinase의 활성을 직접적으로 저해하지 않고 멜라닌 합성신호전달 경로에 작용할 것으로 추정되어 NGC와 NGB에 의한 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현 양상을 분석하였다. 먼저 멜라닌 합성 경로에 작용하는 효소들 즉, tyrosinase와 TRP1, TRP-2의 발현 정도를 측정한 결과 NGC는 tyrosinase, TRP1, TRP-2의 발현을 모두 억제하였으며, NGB는 tyrosinase의 발현만을 억제하였다. 다음으로 NGC와 NGB의 멜라닌 합성 억제효과가 cAMP / PKA 경로에 작용한 결과인지를 확인하고자 p-CREB와 MITF의 발현 정도를 측정한 결과 NGC는 pCREB과 MITF의 발현을 모두 억제하였으며, NGB는 MITF의 발현만을 억제하는 것으로 확인되었다.
다음으로 NGC와 NGB의 멜라닌 합성 억제효과가 cAMP / PKA 경로에 작용한 결과인지를 확인하고자 p-CREB와 MITF의 발현 정도를 측정한 결과 NGC는 pCREB과 MITF의 발현을 모두 억제하였으며, NGB는 MITF의 발현만을 억제하는 것으로 확인되었다. 멜라닌 합성 기전중 ERK pathway 활성화에 미치는 영향을 측정한 결과, NGB가 p-ERK의 발현을 상당히 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 tyrosinase glycosylation 저해효과를 확인하고자 먼저 in vitro 상에서 α-glucosidase 저해효과를 측정한 결과 NGC와 NGB 모두 상당한 정도의 저해 활성을 나타내었다.
우선 in vitro 상에서 mushroom tyrosinase를 이용하여 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 측정한 결과, NGB와 NGC는 mushroom tyrosinase에 대한 저해 활성을 나타내지 않았다 (data not shown). 다음으로 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 B16-F1 melanoma cell에 NGB와 NGC를 각각 0, 20, 50, 100 µg/mL의 농도로 처리하고 48 h이 지난 후 멜라닌 함량을 측정한 결과, 농도 의존적으로 멜라닌 합성이 저해됨을 확인하였다.
즉, NGB를 처리한 군은 37%, NGC를 처리한 군은 62%의 MITF 발현저해율을 나타내었다. 이러한 결과는 NGB와 NGC가 미백에 관련된 전사인자의 발현에도 효과가 있음을 나타내며, 특히 NGC의 경우 cAMP/PKA 경로에 영향을 미침으로써 전사인자인 MITF 발현과 상위 신호전달 인자인 CREB의 활성화를 조절함으로써 tyrosinase 및 TRPs (TRP-1, TRP-2)의 발현을 저해하고 결과적으로 멜라닌 합성을 억제하는 것으로 사료된다.
이는 100 µg/mL의 농도에서 45%의 멜라닌 합성 억제효과를 나타낸 양성대조군으로 사용한 알부틴과 유사한 정도의 효과였다. 이러한 결과로 보아 NGB와 NGC는 tyrosinase의 활성을 직접적으로 저해하지 않고 멜라닌 합성 신호전달 경로에 작용할 것으로 추정된다. 따라서 NGB와 NGC에 의한 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현 양상을 분석하였다.
NGB를 처리한 경우 ERK가 활성화되어 p-ERK가 증가되었으나, NGC를 처리한 경우에는 ERK의 활성화에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 보아 NGB의 멜라닌 합성 저해효과는 ERK pathway 활성화를 통해 MITF의 분해를 촉진함으로써 MITF 발현이 억제되었고, 그 결과 tyrosinase 발현 역시 억제되었으며 최종적으로 멜라닌 합성이 억제된 것으로 사료된다.
알부틴을 처리한 경우, TRP-1의 발현은 약 20% 저해하였으며, TRP-2에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 이상의 결과, NGB는 멜라닌 합성에 직접적으로 관여하는 효소인 tyrosinase의 발현을 저해함으로써, NGC는 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 발현을 모두 저해함으로써 멜라닌 합성을 저해하는 것임을 확인할 수 있었다. Nakamura 등 [56]은 연꽃봉오리와 연잎의 methanol 추출물이 강력한 melanogenesis 저해효과를 나타내었으며 이는 연꽃봉오리와 연잎의 methanol 추출물로부터 분리한 alkaloid 류 중 nuciferine과 N-methylasimilobine이 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 발현을 저해함에 따른 것으로 보고한 바 있다.
이상의 실험 결과, NGB와 NGC는 B16-F1 melanoma cell에서 α-glucosidase를 억제하여 tyrosinase의 glycosylation을 저해하는 것으로 사료되며 이로 인해 tyrosinase 발현 저해 및 멜라닌 합성 억제효과에 영향을 미친 것으로 생각되어진다.
즉, α-glucosidase를 50% 억제하는 농도인 IC50이 NGB는 1.1±0.1 µg/mL, NGC는 14.6±1.0 µg/mL로 468.6±16.1 µg/mL의 IC50치를 나타낸 positive control인 acarbose에 비해 월등히 높은 저해 효과를 나타내었다.
3 (a)에서와 같이 NGB와 NGC를 처리한 군에서의 tyrosinase 발현이 처리하지 않은 군보다 감소하였다. 즉, NGB 를 처리한 군에서는 35%, NGC를 처리한 군에서는 63%의 tyrosinase 발현 저해효과를 확인하였다. 같은 농도의 알부틴을 처리한 군의 tyrosinase 발현 저해율은 2% 정도로, tyrosinase 단백질의 발현에는 거의 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
4에서와 같이 p-CREB의 경우 NGC를 처리한 군에서만 46%의 저해효과를 나타내었고, MITF의 경우 NGB와 NGC 처리군 모두에서 저해효과를 확인할 수 있었다. 즉, NGB를 처리한 군은 37%, NGC를 처리한 군은 62%의 MITF 발현저해율을 나타내었다. 이러한 결과는 NGB와 NGC가 미백에 관련된 전사인자의 발현에도 효과가 있음을 나타내며, 특히 NGC의 경우 cAMP/PKA 경로에 영향을 미침으로써 전사인자인 MITF 발현과 상위 신호전달 인자인 CREB의 활성화를 조절함으로써 tyrosinase 및 TRPs (TRP-1, TRP-2)의 발현을 저해하고 결과적으로 멜라닌 합성을 억제하는 것으로 사료된다.
후속연구
또한 NGB는 ERK pathway의 활성화를 통해 MITF의 분해를 촉진시키고 이로 인해 tyrosinase의 발현을 감소시키는 기전과 역시 tyrosinase의 N-glycosylation 과정을 저해함으로써 tyrosinase 활성을 억제하는 2가지 기전이 복합적으로 작용함으로써 멜라닌 합성을저해하는 것으로 사료된다. 향후 활성 물질에 대한 분석과 인체실험을 통한 안정성및미백효능의검증이 필요하나연자육은화장품의 새로운 미백 소재로서의 활용가치가 큰 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
멜라닌의 역할은 무엇인가?
멜라닌은 태양광선 중 유해한 자외선으로부터 생체를 보호하는 중요한 방어수단이나 멜라닌이 과도하게 합성되거나 노화 등에 의해 피부의 생리기능이 떨어지게 되면 멜라닌이 피부 표면에 침착되어 기미, 주근깨 등 다양한 색소 침착을 유발하게 된다 [1]. 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 멜라닌세포의 멜라노좀에서 합성되어 멜라닌세포의 수지상 돌기를 통해 피부 각질층으로 이동된다 [2].
멜라닌의 합성은 어디에서 이루어 지는가?
멜라닌은 태양광선 중 유해한 자외선으로부터 생체를 보호하는 중요한 방어수단이나 멜라닌이 과도하게 합성되거나 노화 등에 의해 피부의 생리기능이 떨어지게 되면 멜라닌이 피부 표면에 침착되어 기미, 주근깨 등 다양한 색소 침착을 유발하게 된다 [1]. 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 멜라닌세포의 멜라노좀에서 합성되어 멜라닌세포의 수지상 돌기를 통해 피부 각질층으로 이동된다 [2].
멜라닌의 합성은 어떤 요소들에 의해 조절되는가?
멜라닌의 합성은 자외선, cytokine, growth factor 및 호르몬 등에 의해 조절되며 많은 인자들이 관여하는 매우 복잡한 과정으로 몇 가지 세포내 신호전달 기전을 통하여 합성되는데, 주요 경로로서 cyclic adenosine monophosphate (cAMP) / protein kinase A (PKA) 경로가 있다. 이는 피부가 UV에 노출되었을 때 멜라닌세포의 cAMP 신호를 증폭시켜 하류 신호전달 물질인 PKA의 활성화를 유도하며, 세포내 cAMP response element binding (CREB) protein을 활성화시킴으로써 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)의 발현을 증가시킨다 [3,4].
참고문헌 (60)
Hill, H. Z., W. Li, P. Xin, and D. L. Michell (1998) Melanin: A two edged sword? Pigment Cell Res. 10: 158-161.
Seiberg, M., L. Babiarz, and C. B. Lin (2003) IL-41 the PAR-2 pathway is differentially expressed in skin of color. Pigment Cell Res. 16: 591-591.
Bertolotto, C., R. Busca, P. Abbe, K. Bille, E. Aberdam, J. P. Ortonne, and R. Ballotti (1998) Different cis-acting elements are involved in the regulation of TRP1 and TRP2 promoter activities by cyclic AMP: pivotal role of M boxes (GTCATGTGCT) and of microphthalmia. Mol. Cell. Biol. 18: 694-702.
Fuller, B. B., J. B. Lunsford, and D. S. Iman (1987) Alpha-melanocyte-stimulating hormone regulation of tyrosinase in Cloudman S-91 mouse melanoma cell cultures. J. Biol. Chem. 262: 4024-4033.
Yokoyama, K., H. Suzki, K. Yasumoto, Y. Tomita, and S. Shibahara (1994) Molecular cloning and functional analysis of a cDNA coding for human DOPAchrome tautomerase/tyrosinase-related protein-2. Biochim. Biophys. Acta. 1217: 317-321.
Bertolotto, C., P. Abbe, T. J. Hemesath, K. Bille, D. E. Fisher, J. P. Ortonne, and R. Ballotti (1998) Microphthalmia gene product as a signal transducer in cAMP-induced differentiation of melanocytes. J. Cell Biol. 142: 827-835.
Yasumoto, K., K. Yokoyama, K. Takahashi, Y. Tomita, and S. Shibahara (1997) Functional analysis of microphthalmia-associated transcription factor in pigment cell-specific transcription of the human tyrosinase family genes. J. Biol. Chem. 272: 503-509.
Yavuzer, U., E. Keenan, P. Lowings, J. Vachtenheim, G. Currie, and C. R. Goding (1995) The microphthalmia gene product interacts with the retinoblastoma protein in vitro and is a target for deregulation of melanocyte-specific transcription. Oncogene 10: 123-134.
Englaro, W., C. Bertolotto, R Busca, A. Brunet, G. Pages, J. P. Ortonne, and R. Ballotti (1998) Inhibition of the mitogen-activated protein kinase pathway triggers B16 melanoma cell differentiation. J. Biol. Chem. 273: 9966-9970.
Kim, D. S., E. S. Hwang, J. E. Lee, S. Y. Kim, S. B. Kwon, and K. C. Park (2003) Sphingosine-1-phosphate decreases melanin synthesis via sustained ERK activation and subsequent MITF degradation. J. Cell Sci. 116: 1699-1706.
Kim, D. S., S. Y. Kim, J. H. Chung, K. H. Kim, H. C. Eun, and K. C. Park (2002) Delayed ERK activation by ceramide reduces melanin synthesis in human melanocytes. Cell. Signal. 14: 779-785.
Englaro, W., R. Rezzonico, M. Durand-Clement, D. Lallemand, J. P. Ortonne, and R. Ballotti (1995) Mitogen-activated protein kinase pathway and AP-1 are activated during cAMP-induced melanogenesis in B-16 melanoma cells. J. Biol. Chem. 270: 24315-24320.
Kobayashi, T., W. D. Vieira, B. Potterf, C. Sakai, G. Imokawa, and V. J. Hearing (1995) Modulation of melanogenic protein expression during the switch from euto pheomelanogenesis. J. Cell Sci. 108: 2301-2309.
Kobayashi, T., K. Urabe, A. Winder, C. Jimenez-Cervantes, G. Imokawa, T. Brewington, F. Solano, J. C. Garcia-Borron, and V. J. Hearing (1994) Tyrosinase related protein 1 (TRP1) functions as a DHICA oxidase in melanin biosynthesis. EMBO J. 13: 5818-5825.
Branza-Nichita, N., G. Negroiu, A. J. Petrescu, E. F. Garman, F. M. Platt, M. R. Wormald, R. A. Dwek, and S. M. Petrescu (2000). Mutations at critical N-glycosylation sites reduce tyrosinase activity by altering folding and quality control. J. Biol. Chem. 275: 8169-8175.
Petrescu, A. J., T. D. Butters, G. Reinkensmeier, S. Petrescu, F. M. Platt, R. A. Dwek, and M. R. Wormal (1997) The solution NMR structure of glucosylated N-glycans involved in the early stages of glycoprotein biosynthesis and folding. EMBO J. 16: 4302-4310.
Petrescu, S. M., A. J. Petrescu, H. N. Titu, R. A. Dwek, and F. M. Platt (1997) Inhibition of N-glycan processing in B16 melanoma cells results in inactivation of tyrosinase but does not prevent its transport to the melanosome. J. Biol. Chem. 272: 15796-15803.
Branza-Nichita. N., A. J. Petrescu, R. A. Dwek, M. R. Wormald, F. M. Platt, and S. M. Petrescu (1999) Tyrosinase folding and copper loading in vivo: a crucial role for calnexin and alpha-glucosidase II. Biochem. Biophys. Res. Commun. 261: 720-725.
Wang, Y. and M. J. Androlewicz (2000) Oligosaccharide trimming plays a role in the endoplasmic reticulum-associated degradation of tyrosinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 271: 22-27.
Imokawa, G. and Y. Mishima (1984) Functional analysis of tyrosinase isozymes of cultured malignant melanoma cells during the recovery period following interrupted melanogenesis induced by glycosylation inhibitors. J. Invest. Dermatol. 83: 196-201.
Franchi, J., M. C. Coutadeur, C. Marteau, M. Mersel, and A. Kupferberg (2000) Depigmenting effects of calcium D-pantetheine-Ssulfonate on human melanocytes. Pigment Cell Res. 13: 165-171.
Aoki, H. M., O. Ifuku, and A. S. Zervos (1998) Identification of a new microphthalmia(Mi)-interacting protein, rKr2, involved in the regulation of melanogenesis. IFSCC. 1998: 67-78
Seiberg, M., C. Paine, E. Sharlow, P. Andrade Gordon, M. Costanzo, M. Eisinger, and S. S. Shapiro (2000) The protease-activated receptor 2 regulates pigmentation via keratinocyte-melanocyte interaction. Exp. Cell Res. 254: 25-32.
Negroiu, G., N. Branza-Nichita, A. J. Petrescu, R. A. Dwek, and S. M. Petrescu (1999) Protein specific N-glycosylation of tyrosinase and tyrosinase-related protein-1 in B16 mouse melanoma cells. Biochem. J. 344: 659-665.
Bensky, D. and A. Gamble (1993) Chinese Herbal Medicine; Materia Medica. 2nd ed., pp. 262. Eastland press, Seattle, WA, USA.
Mukheriee, P. K., J. Das, R. Balasubramanian, K. Saha, M. Pal, and B. Saha (1995) Antidiarrhoeal evaluation of Nelumbo nucifera rhizome extract. Indian J. Pharm. 27: 262-264.
Mukheriee, P. K., J. Das, K. Saha, M. Pal, and B. P. Saha (1996) Diuretic activity of the rhizomes of Nelumbo nucifera Gaertn. Phytother. Res. 10: 424-425.
Mukheriee, P. K., K. Saha, J. Das, M. Pal, and B. P. Saha (1996) Antipyretic activity of Nelumbo nucifera rhizome extract. Indian J. Exp. Biol. 34, 275-276.
Mukheriee, P. K. (2002) Quality control of herbal drugs-an approach to evaluation of botanicals, 604, Business Horizons, New Delhi, India.
Mukheriee, P. K., S. N. Giri, K. Saha, M. Pal, and B. P. Saha (1995) Antifungal screening of Nelumbo nucifera (Nymphaeaceae) rhizome extract. Indian J. Microbiol. 35: 327-330.
Mukheriee, P. K., R. Balasubramanian, K. Saha, M. Pal, and B. P. Saha (1995) Antibacterial efficiency of Nelumbo nucifera (Nymphaeaceae) rhizome extract. Indian Drugs 32: 274-276.
Mukheriee, P. K., S. R. Pal, K. Saha, and B. P. Saha (1995) Hypoglycemic activity of Nelumbo nucifera rhizome (methanolic extract) in streptozotocin induced diabetic rats. Phytother. Res. 9: 522-524.
Cho, E. J., T. Yokozawa, D. Y. Rhyu, S. C. Kim, N. Shibahara, and J. C. Park (2003) Study on the inhibitory effects of Korean medicinal plants and their main compounds on the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Phytomedicine 10: 544-551.
Hu, M. and L. H. Skibsted (2002) Antioxidative capacity of rhizome extract and rhizome knot extract of edible lotus (Nelumbo nuficera). Food Chem. 76: 327-333.
Park, J. H., D. W. Kim, B. G. Lee, and K. I. Byun (2010) Antioxidant activities and inhibitory effect on oxidative DNA damage of Nelumbinis semen extracts. Korean J. Herbol. 25: 55-59.
Seo, J. H., Y. H. Choi, M. Y. Yoo, K. S. Hong, B. H. Lee, G. H. Yon, Y. S. Kim, Y. K. Kim, and S. Y. Ryu (2006) Isolation of dihydrophaseic acid from seed extract of Nelumbo nucifera. Korean J. Pharmacogn. 37: 290-293.
Song, G. S., B. Y. Ahn, K. S. Lee, L. K. Maeng, and D. S. Choi (1997) Effect of hot water extracts from medical plants on the mutagenicity of indirect mutagens. J. Food Sci. Technol. 29: 1288- 1294.
Lee, J. W., M. C. Hong, M. K. Shin, and H. S. Bae (2006) Comparison of Nelumbinis semen extract with hypericum perforatum and fluoxetine in animal model of depression. Korean J. Ori. Med. Physiol. Pathol. 20: 830-843.
Kim, H. G. and M. S. Oh (2009) Protective effects of Nelumbinis Semen against neurotoxicity induced by 6-hydroxydopamine in dopaminergic cells. Korean J. Herbol. 24: 87-92.
Ann, C. J., G. H. Lee, Y. S. Kim, M. C. Hong, H. S. Bae, J. H. Kim, and M. G. Shin (2010) Effect of Nelumbinis semen on the recovery of the cardiac muscle activity by proteome analysis. Korean J. Ori. Med. Physiol. Pathol. 24: 962-969.
Kim, S. H. and J. W. Choi (2011) Action mechanism of anticonvulsive effect of Nelumbo Nucifera in pentylenetetrazole-induced animal models. Korean J. Ori. Med. Physiol. Pathol. 25: 614-619.
Luo, X. and S. Yao (2005) Stimultaneous analysis of N-nornuciferine, O-nornuciferine, nuciferine, and roemerine in leaves of Nelumbo nucifera Gaertn by high-performance liquid chromatography- photodiode array detection- electrospray mass spectrometry. Analytica. Chimica. Acta. 538: 129-133.
Wu, S. and Y. Pan (2004) Prepatative counter-current chromatography isolation of liensinine and its analogues from embryo of the seed of Nelumbo nucifera Gaertn using upright coil planet centrifuge with for multilayer coil connected in series. J. Chromatogr. A. 1041: 153-162.
Kashiwada, Y., A. Aoshima, Y. Ikeshiro, Y. P. Chen, H. Furukawa, M. Itoigawa, T. Fujioka, K. Mihashi, L. M. Cowedtino, S. L. Morris-Natschke, and K. H. Lee (2005) Anti-HIV benzylisoquinoline alkaloids and flavonoids from the leaves of Nelumbo nucifera and structure-activity correlations with related alkaloids. Bioorg. Med. Chem. 13: 443-448.
Kim, J. S., S. M. Cho, J. H. Kim, and M. W. Lee (2001) Phenolic compounds from the node of Lotus Rhizome. Yakhak Hoeji. 45: 599-603.
Mosmann, T. (1983) Rapid colorimetric assay for the cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxic assay. J. Immun. Methods 65: 55-63.
Oka, M., M. Ichihashi, and A. K. Chakraborty (1996) Enhanced expression of protein kinase C subspecies in melanogenic compartments in B16 melanoma cells by UVB or MSH. J. Invest. Dermatol. 106: 377-378.
Angelov, A., M. Putyrski, and W. Liebl (2006) Molecular and biochemical characterization of alpha-glucosidase and alpha-mannosidase and their clustered genes from the thermoacidophilic archaeon Picrophilus torridus. J. Bacteriol. 188: 7123-7131.
Nakamura, S., S. Nakashima, G. Tanabe, Y. Oda, N. Yokota, K. Fujimoto, T. Matsumoto, R. Sakuma, T. Ohta, K. Ogawa, S. Nishida, H. Miki, H. Matsuda, O. Muraoka, and M. Yoshikawa (2013) Alkaloid constituents from flower buds and leaves of sacred lotus (Nelumbo nucifera, Nymphaeaceae) with melanogenesis inhibitory activity in B16 melanoma cells. Bioorg. Med. Chem. 21: 779-787.
Xu, W., L. Gong, M. M. Haddad, O. Bischof, J. Campisi, E. T. Yeh, and E. E. Medrano (2000) Regulation of microphthalmia-associated transcription factor MITF protein levels by association with the ubiquitin-conjugating enzyme hUBC9. Exp. Cell Res. 255: 135-143.
Choi, H., S. Ahn, H. Chang, N. S. Cho, K. Joo, B. G. Lee, I. Chang, and J. S. Hwang (2007) Influence of N-glycan processing disruption on tyrosinase and melanin synthesis in $HM_{3}KO$ melanoma cells. Exp. Dermatol. 16: 110-117.
Mishima, Y. and G. Imokawa (1983) Selective aberration and pigment loss in melanosomes of malignant melanoma cells in vitro by glydosylation inhibitors: Premelanosomes as glycoprotein. J. Invest. Dermatol. 81: 106-114.
Halaban, R. E., E. Cheng, Y. Zhang, G. Moellmann, D. Hanlon, M. Michalak, V. Setaluri, and D. N. Hebert (1997) Aberrant retention of tyrosinase in the endoplasmic reticulum mediates accelerated degradation of the enzyme and contributes to the dedifferentiated phenotype of amelanotic melanoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6210-6215.
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