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문제 정의
- 본 실험에서는 赤芍藥이 HPA axis와 관련하여 항우울 효과를 나타내는 것을 확인해 보기 위해 시상하부의 PVN에서 CRF를 측정하여 보았다. CRF는 HPA axis에서 스트레스에 대한 내분비, 자율신경, 행동적, 면역 등의 반응을 매개하는 중요한 역할을 한다.
- 본 연구에서는 鬱症을 氣鬱이 오래되어 나타나는 鬱火를赤芍藥의 苦寒한 성질과 주로 肝經 血分에 들어가 血分의 實熱을 淸熱시키고 瘀血留滯를 善散하여 瘀血祛瘀하는 작용이 우울증 치료에 적용될 수 있는지를 알아보고자 하는 것이다.
- 청반(LC, Locus Coeruleus)과 복측피개야(VTA, Ventral Tegmental Area)에서 DA(Dopamine)과 NE(Norepinephrine)의 합성에 관여하는 효소인 TH(Tyrosine Hydroxylase)발현을 측정하였다. 이에 유의성 있는 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- . 15분간 물에 빠트리는 예비 실험 후 24시간 후 본 실험을 시행하는 것이 일반적이며, 수영을 하다 포기하고 부동자세를 취하는 일종의 좌절 양상을 보이는 시간을 측정하여 평가한다24).
- 처음 수분간은 이를 벗어나기 위해 白鼠가 심한 저항을 보이나, 시간이 흐를수록 점점 부동자세를 보이는 시간이 늘어난다. 24시간 후에 5분간 같은 환경에서 강제 수영을 시키고, 기어오르기(climbing), 수영(swimming), 부동(immobility) 세 가지를 측정한다. 기어오르기는 가장 격렬한 운동 상태인데, 앞발을 적극적으로 사용하여 아크릴 원통 위로 올라오려고 사지를 다 쓰는 상태이다.
- 다음날 뇌를 급속 냉동한 후 뇌 조직을 30㎛의 두께로 잘랐다. PBS로 몇 차례 씻고, CRF 발현실험에서는 Goat anti‐CRF (Santa Cruz Biotechnology)에 담갔고, c-Fos 발현실험에서는 Rabbit anti c‐Fos (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA) 에 담갔다. TH 발현실험에서는 Mouse anti‐Tyrosine Hydroxylase (Zymed Laboratories, Inc.
- 赤芍藥이 白鼠의 憂鬱行動에 미치는 效果를 알아보기 위해 FST를 실시하여 행동변화에 미치는 영향을 보고, 免疫組織化學法으로 시상하부의 PVN에서 CRF, c-Fos의 변화를 측정하고 LC, VTA에서 TH발현을 측정하여 유의성 있는 결과를 얻었다.
- 뇌 조직은 primary antiserum에서 72시간 배양하였다. 그 후 뇌 조직을 PBST 로 씻은 다음, 2시간 동안 실온에서 2% normal donky serum을 함유하는 PBST에서 200배로 희석한 biotinylated goat anti‐goat serum (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA)에 반응시켰다. 다시 PBST로 씻은 다음 뇌 조직은 실온에서 1시간 동안 Santa Cruz ABC reagent (Santa Cruz Biotechnology, Inc.
- 발색이 끝난 조직은 slide에 올려 2시간 동안 실온에서 건조시킨 후, xylene으로 투명화 시켜 polymount로 봉입하였다. 뇌 조직의 각 부위는 염색성을 광학 현미경으로 100배 확대 관찰하고 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도17)를 참고하였다.
- 이에 저자는 赤芍藥의 苦寒한 성질과 肝經에 들어가 血分을 淸熱시키는 작용이 鬱火를 풀어 우울증 치료 효과가 있는가를 알아보기 위해 赤芍藥을 白鼠에게 경구투여한 후, 강제 수영부하시험(FST, Forced Swimming Test)를 실시하여 행동변화를 살펴보았다. 면역조직화학법으로 HPA axis와 관련하여 시상하부의 실방핵(PVN, Paraventricular Nucleus)에서 스트레스를 받으면 발현이 증가되는 것으로 알려진 CRF(Corticotrophin Releasing Factor), c-Fos의 발현을 측정하였다. 청반(LC, Locus Coeruleus)과 복측피개야(VTA, Ventral Tegmental Area)에서 DA(Dopamine)과 NE(Norepinephrine)의 합성에 관여하는 효소인 TH(Tyrosine Hydroxylase)발현을 측정하였다.
- 사육실의 온도는 20-24℃ 습도는 36-64%로 유지 하였고 사육실 내 환풍기와 공기 정화기를 항시 가동시켰다. 밤과 낮의 주기는 12시간:12시간이 되도록 하되 야행성인 쥐의 습성을 고려하여 주로 실험이 진행되는 낮 시간이 밤 주기에 해당되도록 조정하였다. 시험절차에 따라 예외는 있으나 물과 먹이를 마음대로 먹을 수 있게 공급해 주었다.
- 본 실험에서는 도파민의 생성과 관련되어 자주 관찰되는 부위이며 뇌의 여러 영역으로 도파민성 투사를 하는 LC, VTA에서의 TH수준을 면역조직화학법으로 측정하였다. LC는 후뇌 협부 4뇌실 앞에 위치하고 있으며 색소를 띄고 있어 LC라고 불리는데 종뇌, 간뇌, 중뇌, 소뇌, 교뇌, 수뇌 및 척수 등 광범위하게 중추신경계에 분포하는 noradrenaline성 섬유가 LC에서 시작된다.
- 생후 8주된 중량 약 250g의 Sprague Dawley계 수컷 白鼠 (Orient 사)를 1주간, 실험실 내 사육실 조건에 적응하도록 하면서 동시에 핸들링(handling) 절차를 통해 실험자와 접촉에 익숙해지도록 하였다. 쥐들은 일부 스트레스 절차를 제외하고는 3-4마리씩 사육 상자에서 지내도록 하였다.
- FST는 1978년 Porsolt 등에 의해 고안된 방법으로, 실험동물이 물이 담긴 실린더 형 용기 속에서 수영을 하다 포기하고 부동자세를 취하는 시간을 측정하여 평가하는 것이다. 실험동물에게 약물을 투여하고 이 부동자세의 시간의 감소를 관찰함으로써 그 약물의 항우울효과를 평가한다22).
- 실험은 세 그룹으로 나누어 실시하였으며 Control group(대조군)은 스트레스를 부여하고 생리식염수를 투여하였으며 PR100 group은 스트레스를 부여한 다음 赤芍藥을 100mg/kg p.o. 투여 하였고, PR400 group은 스트레스를 부여한 다음 赤芍藥을 400mg/kg p.o. 투여하였다. 모든 그룹의 동물의 수는 5마리로 배정하였다.
- 이에 저자는 赤芍藥의 苦寒한 성질과 肝經에 들어가 血分을 淸熱시키는 작용이 鬱火를 풀어 우울증 치료 효과가 있는가를 알아보기 위해 赤芍藥을 白鼠에게 경구투여한 후, 강제 수영부하시험(FST, Forced Swimming Test)를 실시하여 행동변화를 살펴보았다. 면역조직화학법으로 HPA axis와 관련하여 시상하부의 실방핵(PVN, Paraventricular Nucleus)에서 스트레스를 받으면 발현이 증가되는 것으로 알려진 CRF(Corticotrophin Releasing Factor), c-Fos의 발현을 측정하였다.
- 생후 8주된 중량 약 250g의 Sprague Dawley계 수컷 白鼠 (Orient 사)를 1주간, 실험실 내 사육실 조건에 적응하도록 하면서 동시에 핸들링(handling) 절차를 통해 실험자와 접촉에 익숙해지도록 하였다. 쥐들은 일부 스트레스 절차를 제외하고는 3-4마리씩 사육 상자에서 지내도록 하였다. 사육실의 온도는 20-24℃ 습도는 36-64%로 유지 하였고 사육실 내 환풍기와 공기 정화기를 항시 가동시켰다.
- 면역조직화학법으로 HPA axis와 관련하여 시상하부의 실방핵(PVN, Paraventricular Nucleus)에서 스트레스를 받으면 발현이 증가되는 것으로 알려진 CRF(Corticotrophin Releasing Factor), c-Fos의 발현을 측정하였다. 청반(LC, Locus Coeruleus)과 복측피개야(VTA, Ventral Tegmental Area)에서 DA(Dopamine)과 NE(Norepinephrine)의 합성에 관여하는 효소인 TH(Tyrosine Hydroxylase)발현을 측정하였다. 이에 유의성 있는 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
- 5%). 투약 시는 건조된 약재를 분량에 맞게 생리식염수를 첨가하여 용액을 만들었다.
- 현상된 사진에서 격자 (2×2㎝)를 이용하여 동일한 지역에서 일정한 영역에 반응되어 나타난 염색성의 정도를 counting하였다.
대상 데이터
- 赤芍藥(Paeoniae Radix Rubra)은 毛良科(프로그램에서 한자가 없슴) (미나리아재비과 ; Ranunculaceae)에 속한 다년생 草本인 赤芍藥(Paeonia lactiflora PALL)의 뿌리를 乾燥한 것을 사용하였다. 赤芍藥 400g에 10배(w/v)량의 3차 증류수를 가하여 100℃에서 4시간 동안 냉각기를 장착한 상태로 달인 후, 거즈로 여과하여, 80℃에서 중탕 농축하여 하루동안 ‐80℃에서 냉각시킨 후, ‐40℃ 온도로 동결건조시켜 분말을 22g 획득하였다(수율 5.5%). 투약 시는 건조된 약재를 분량에 맞게 생리식염수를 첨가하여 용액을 만들었다.
데이터처리
- 모든 측정값은 평균값±표준오차로 표시하였고, 각 실험군의 통계학적 분석은 window용 SPSS를 이용하였다.
- 모든 측정값은 평균값±표준오차로 표시하였고, 각 실험군의 통계학적 분석은 window용 SPSS를 이용하였다. 행동 실험결과 및 면역조직 화학법에 대한 통계분석은 one way ANOVA로 분석하였으며, 사후 검정은 LSD를 통해 검증하였으며, P값이 0.05 미만인 것을 통계적으로 유의한 것으로 인정하였다.
이론/모형
- 뇌 조직의 각 부위는 염색성을 광학 현미경으로 100배 확대 관찰하고 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도17)를 참고하였다. 현상된 사진에서 격자 (2×2㎝)를 이용하여 동일한 지역에서 일정한 영역에 반응되어 나타난 염색성의 정도를 counting하였다.
- 본 실험에서는 FTS에 의해서 스트레스를 받은 白鼠에게赤芍藥을 투여하여 PVN 내에서의 c-Fos의 발현을 면역조직화학법으로 측정하였다. 측정 결과, 대조군에 비하여 赤芍藥 100mg/kg그룹(PR100)과 赤芍藥 400mg/kg그룹(PR400)에서 대조군에 비해 비슷하거나 오히려 증가하였다.
- 우울증의 시험 모델로 白鼠의 강제수영부하시험(FST, Forced Swimming Test)을 사용하였다. FST는 1978년 Porsolt 등에 의해 고안된 방법으로, 실험동물이 물이 담긴 실린더 형 용기 속에서 수영을 하다 포기하고 부동자세를 취하는 시간을 측정하여 평가하는 것이다.
성능/효과
- 1. 不動行動이 나타나는 시간을 관찰한 결과, 대조군에 비해赤芍藥 100mg/kg그룹과 赤芍藥 400mg/kg그룹에서 유의성있게 감소하였다(p<0.001).
- 2. CRF의 발현을 관찰한 결과, 대조군에 비해 赤芍藥 400mg/kg그룹에서 CRF의 발현이 유의성있게 감소하였다(p<0.05).
- 3. c-Fos의 발현을 관찰한 결과, 대조군에 비해 赤芍藥 100mg/kg 그룹에서는 오히려 증가하였고 赤芍藥 400mg/kg그룹에서는 거의 변화가 없었다.
- 4. LC와 VTA 내에서의 TH 발현을 측정한 결과, 赤芍藥 투여군이 대조군에 비해 VTA에서는 유의성있게 감소하였으나(p<0.05), LC에서는 발현 세포의 수가 赤芍藥 100mg/kg그룹에서는 약간 감소하였고 赤芍藥 400mg/kg 그룹에서는 오히려 증가 하였다.
- 측정 결과 대조군에 비하여 赤芍藥 100mg/kg 투여 그룹은 감소하였으나 赤芍藥 400mg/kg는 오히려 증가하여 LC 내 TH 발현은 유의성이 없음을 알 수 있었다. 그리고 VTA 내에서는 TH 발현은 대조군에 비하여, 赤芍藥 100mg/kg 투여 그룹과 赤芍藥 400mg/kg 투여 그룹 모두에서 유의성 있게 감소함을 알 수 있었다.
- 대조군에 비하여, 赤芍藥 100mg/kg 그룹(CR100)과 赤芍藥 400mg/kg그룹(CR400)에서 각각 81.3±12.9%, 54.2±7.6%를 나타내, PVN에서의 CRF의 발현이 감소되었고, 특히 赤芍藥 400mg/kg 그룹(CR400)에서는 유의성있게 감소하였다(p<0.05).
- 대조군에 비하여, 赤芍藥 100mg/kg그룹(PR100)은 160.8±39.5%, 赤芍藥 400mg/kg그룹(PR400)은 102.1±2.0%를 나타내, 대조군에 비해 비슷하거나 증가하였다.
- 대조군에 비하여, 赤芍藥 100mg/kg투여 그룹 68.9±8.0%, 赤芍藥 400mg/kg투여 그룹 70.7±7.9%로 VTA 내, TH 발현은 유의성 있게 감소함을 알 수 있었다(p<0.05).
- 대조군에 비하여, 赤芍藥 100mg/kg투여 그룹은 90.3±17.0%로 감소하였으나 赤芍藥 400mf/kg는 113.3±24.1%로 오히려 증가하여 청반에서의 TH 발현은 유의성이 없음을 알 수 있었다.
- 본 실험 결과, 赤芍藥을 투여한 그룹에서 대조군에 비해 부동행동이 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 특히, 赤芍藥100mg/kg투여한 그룹은 대조군에 비해 부동행동이 유의성있게 줄어드는 것을 관찰할 수 있었으며, 赤芍藥 400mg/kg를 투여한 그룹에서도 대조군에 비해 부동행동이 감소하는 것을 볼 수 있었다.
- 이상과 같은 실험 결과로 볼때 赤芍藥은 FST유발된 우울증에 대한 항우울효과가 있음을 확인하였고 免疫組織化學法으로 측정한 결과 PVN에서 CRF의 발현은 유의성있게 감소시켰으나 c-Fos의 발현은 오히려 증가시켰고, VTA에서 TH발현은 유의성있게 감소시켰으나, LC에서 TH발현은 유의성이 없었다. 이것은 NE보다는 DA합성을 억제하는 효능으로 생각 된다.
- 이상의 결과로 볼때 赤芍藥은 부동행동을 감소시켰으며, PVN에서 CRF의 발현은 감소시키고 VTA에서 TH 발현은 감소시켰으나, PVN에서 c-Fos의 발현과 LC에서 TH발현은 유의성이 없었다. 따라서 赤芍藥은 PVN에서 CRF와 VTA에서 TH의 감소를 통한 항우울 효과가 있는 것으로 생각된다.
- 측정 결과 대조군에 비하여 赤芍藥 100mg/kg 투여 그룹은 감소하였으나 赤芍藥 400mg/kg는 오히려 증가하여 LC 내 TH 발현은 유의성이 없음을 알 수 있었다. 그리고 VTA 내에서는 TH 발현은 대조군에 비하여, 赤芍藥 100mg/kg 투여 그룹과 赤芍藥 400mg/kg 투여 그룹 모두에서 유의성 있게 감소함을 알 수 있었다.
- 측정 결과, 대조군에 비하여 赤芍藥 100mg/kg그룹 (CR100)과 赤芍藥 400mg/kg그룹(CR400)에서 PVN 내에서의 CRF의 발현이 감소되었다. 특히 赤芍藥 400mg/kg 그룹(CR400)에서는 유의성있게 감소하였다.
- 본 실험에서는 FTS에 의해서 스트레스를 받은 白鼠에게赤芍藥을 투여하여 PVN 내에서의 c-Fos의 발현을 면역조직화학법으로 측정하였다. 측정 결과, 대조군에 비하여 赤芍藥 100mg/kg그룹(PR100)과 赤芍藥 400mg/kg그룹(PR400)에서 대조군에 비해 비슷하거나 오히려 증가하였다.
- 본 실험 결과, 赤芍藥을 투여한 그룹에서 대조군에 비해 부동행동이 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 특히, 赤芍藥100mg/kg투여한 그룹은 대조군에 비해 부동행동이 유의성있게 줄어드는 것을 관찰할 수 있었으며, 赤芍藥 400mg/kg를 투여한 그룹에서도 대조군에 비해 부동행동이 감소하는 것을 볼 수 있었다. 이는 FST로 인해 白鼠의 우울행동이 유발되었고, 赤芍藥의 투여가 FST에서 나타나는 白鼠의 우울행동을 억제하는 작용을 하고 있음을 알 수 있다(p<0.
후속연구
- 와 상반되는 결과이다. 복합처방과 赤芍藥과 비교할 수는 없지만, 赤芍藥이 PVN 에서 CRF의 발현을 억제하는 효과는 있으나 c-Fos발현 증가를 억제하는 효과는 없는 것으로 나타나고 있어 향후 연구가 필요한 부분이라고 생각한다.
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