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문제 정의
- 이에 필자는 柴胡抑肝湯의 약물 중 生地黃을 선택하여 강제수영부하시험에서 절망행동에 의한 항 우울효과를 확인하는 실험으로 표준화된 검사법으로서 강제수영부하시험(FST, Forced Swimming Test)에서 백서의 행동에 미치는 효과를 알아보기 위해 흰쥐에게 FST를 실시하여 행동변화를 살펴보고11), 우울증에서 HPA Axis system과 Catecholaminergic system의 변화가 일어나므로12) 이에 대한 효능을 확인하기 위하여 면역조직화학법으로13) 시상하부의 실방핵(PVN, Paraventricular Nucleus)에서 CRF(Corticotropin-Releasing Factor)와 c-Fos, 청반(LC, Locus Coeruleus)과 복측피개야(VTA, Ventral Tegmental Area)에서 TH(Tyrosine Hydroxylase)의 발현을 측정하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 처음 수분간은 이를 벗어나기 위해 백서가 심한 저항을 보이나, 시간이 흐를수록 점점 부동자세를 보이는 시간이 늘어난다. 24시간 후에는 5분간 같은 환경에서 강제 수영을 시키고, 여기서 기어오르기(climbing), 헤엄치기(swimming), 부동행동(immobility) 세가지를 측정한다. 전형적인 부동행동(immobility)이란 백서가 얼굴을 포함한 상체의 일부분만 수면 위로 드러낸 체 몸의 균형을 유지하기 위하여 약간의 움직임만을 나타낼뿐 물 위에 떠 있는 상태이다.
- )에 담구어 반응시켰다. PBST로 몇 번 헹군다음 뇌 조직을 착색제인 diaminobenzidine을 사용하여 발색시켰다. 발색이 끝난 조직은 slide에 올려 2시간 동안 실온에서 건조 시킨 후, xylene으로 투명화 시켜 polymount로 봉입하였다.
- 다음날 뇌를 급속 냉동한 후 뇌 조직을 30㎛의 두께로 잘랐다. PBS로 몇 차례 씻고, CRF expression, c‐Fos expression, TH expression에 가장 널리 사용되는 goat anti‐CRF (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA), rabbit anti c‐Fos (Santa Cruz Biotechnology Inc.), mouse anti-Tyrosine Hydroxylase (Zymed Laboratories, Sanfrancisco, CA, USA)에 담구었다. Primary antibody는 0.
- 生地黃이 흰쥐의 행동에 미치는 효과를 알아보기 위해 강제수영부하실험을 실시하여 행동변화에 미치는 영향을 보고, 면역조직화학법으로 시상 하부의 실방핵에서 CRF, c-Fos와 청반, 복측피개야에서 TH의 변화를 측정하여 유의성 있는 결과를 얻었다.
- 뇌 조직은 primary antiserum에서 72시간 배양하였다. 그 후 뇌 조직을 PBST로 씻은 다음, 2시간 동안 실온에서 2% normal donkey serum을 함유하는 PBST에서 200배로 희석한 biotinylated goat anti‐goat serum(Santa Cruz Biotechnology Inc.)에 반응시켰다. 다시 PBST로 씻은 다음 뇌 조직은 실온에서 1시간 동안 Santa Cruz ABC reagent (Santa Cruz Biotechnology Inc.
- 발색이 끝난 조직은 slide에 올려 2시간 동안 실온에서 건조 시킨 후, xylene으로 투명화 시켜 polymount로 봉입하였다. 뇌 조직의 각 부위는 염색성을 광학 현미경으로 100배 확대 관찰하고 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도46)를 참고하였다.
- 기어오르기(climbing)은 가장 격렬한 운동 상태인데, 앞발을 적극적으로 사용하여 아크릴 원통 위로 올라오려고 사지를 다 쓰는 상태이다. 실수와 사람에 의한 오차를 줄이기 위해 비디오카메라로 측정하여 자료를 확보하였다.
- 즉 먼저 FST를 시행한 다음 백서를 희생시켜 뇌를 적출하여 면역조직화학법을 실시하였다. 실험군은 Control(생리식염수 투여, n=8), RR100(生地黃 100mg/kg 경구(p.o.=per os)투여, n=8), RR400(生地黃 400mg/kg p.o.투여, n=8)의 3그룹으로 나누어 실시하였다.
- 실험은 두 단계로 나누어 실시하였다. 즉 먼저 FST를 시행한 다음 백서를 희생시켜 뇌를 적출하여 면역조직화학법을 실시하였다.
- 이 검사법은 약물개발시의 항 우울 효과를 검색하는 기본적인 실험으로 알려져 있다. 이 실험은 두 번에 걸쳐 이루어지는데, 첫 날은 높이 50cm, 지름 30cm의 투명한 아크릴원통형 수조에 22℃의 물에 흰쥐의 꼬리가 바닥에 닿지 않을 정도의 물 높이(35cm)에 강제로 빠뜨린 다음 15분간 있게 하였다. 처음 수분간은 이를 벗어나기 위해 백서가 심한 저항을 보이나, 시간이 흐를수록 점점 부동자세를 보이는 시간이 늘어난다.
- 실험은 두 단계로 나누어 실시하였다. 즉 먼저 FST를 시행한 다음 백서를 희생시켜 뇌를 적출하여 면역조직화학법을 실시하였다. 실험군은 Control(생리식염수 투여, n=8), RR100(生地黃 100mg/kg 경구(p.
- 75%). 투약 시에는 건조된 약재를 분량에 맞게 saline을 첨가하여(10ml) 용액을 만들었으며 강제수영부하시험에서 행동변화를 확인하기 전 3회(24시간 전, 5시간전, 1시간 전)에 경구로 투여하였다.
- 현상된 사진에서 격자(2×2㎝)를 이용하여 동일한 지역에서 일정한 영역에 반응되어 나타난 염색성의 정도를 counting하였다.
대상 데이터
- 연구에 사용한 한약재는 玄蔘科(Rutaceae)에 속한 多年生草本인 지황(Rehmanniae Radix)의 新鮮한 塊根을 에이치에이엠엑스사에서 구입하여(HMAX Co. Jaechon, Korea) 추출용 시료로 사용하였다. 生地黃은 300g에 10배 (w/v)량의 3차 증류수를 가하여 100℃에서 4시간 동안 냉각기를 장착한 상태로 환류 추출한 다음, 거즈로 여과하여, 80℃에서 중탕 농축하여 하루 동안 ‐80℃에서 냉각시킨 후, 40℃ 온도로 냉각동결건조시켜 분말 47g을 획득하였다( 득율 11.
- 우울증(Major depressive disorder, 憂鬱症)은 정신 질환의 하나로 주요우울장애라고도 한다. 주요 증상은 지속적(몇 개월에서 몇 년)인 우울하고 슬픈 감정과 의욕저하 등 다양한 신체적인 증상이 함께 나타나는 것이다. 관계의 와해나 직업적인 생산성의 상실, 무능이나 죽음(자살)에 이를 수도 있다14).
- 중량 200g 내외의 6-7 주령된 Sprague Dawley 계 수컷 백서 (Orient 사)를 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후, 실험에 사용하였다. 낮과 밤 주기는 오전 7시부터 오후 7시까지를 낮으로, 다른 12시간을 밤으로 하여 자동 조절하였다.
데이터처리
- 모든 측정값은 (평균값±표준오차)로 표시하였고, 각 실험군의 통계학적 분석은 window용 SPSS 를 이용하였다.
- 모든 측정값은 (평균값±표준오차)로 표시하였고, 각 실험군의 통계학적 분석은 window용 SPSS 를 이용하였다. 행동 실험결과 및 면역조직 화학법에 대한 통계분석은 One-way ANOVA로 분석하였으며, 사후 검정은 LSD를 통해 검증하였으며, p값이 0.05 미만인 것을 통계적으로 유의한 것으로 인정하였다.
이론/모형
- 뇌 조직의 각 부위는 염색성을 광학 현미경으로 100배 확대 관찰하고 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도46)를 참고하였다. 현상된 사진에서 격자(2×2㎝)를 이용하여 동일한 지역에서 일정한 영역에 반응되어 나타난 염색성의 정도를 counting하였다.
- 본 실험에서는 절망행동검사(Behavioral Despair Test)라고도 하는 표준화된 검사법인 FST를 이용하였다. 이 검사법은 약물개발시의 항 우울 효과를 검색하는 기본적인 실험으로 알려져 있다.
성능/효과
- 1. 강제수영부하실험을 실시하고 부동행동이 나타나는 시간을 관찰한 결과, 대조군에 비해 生地黃 400mg/kg그룹에서 유의성 있게 감소하였다(p<0.05).
- 2. CRF의 발현을 관찰한 결과, 대조군에 비해 生地黃 400mg/kg그룹에서 CRF의 발현이 유의성 있게 감소하였다(p<0.01).
- 3. c-Fos의 발현을 관찰한 결과, 대조군에 비해 生地黃 100mg/kg그룹에서 c-Fos의 발현이 유의성 있게 감소하였다(p<0.01).
- 4. 청반에서 TH의 발현을 관찰한 결과, 대조군에 비해 生地黃 100mg/kg그룹과 生地黃 400mg/kg 그룹에서 모두 TH의 발현이 유의성 있게 증가하였다(p<0.001).
- 5. 복측피개야에서 TH의 발현을 관찰한 결과, 대조군에 비해 生地黃 100mg/kg그룹과 生地黃 400mg/kg 그룹에서 모두 TH의 발현이 유의성 있게 감소하였다(p<0.001).
- LC에서는 발현 세포수를 비교해 본 결과, 대조군에 비하여 RR100에서는 185.09±15.70%, RR400에서는 198.33±27.67 %를 나타내어 RR100과 RR400에서 유의성 있게 증가하였음을 알 수 있다(F(2,19)=9.537, p<0.001).
- VTA 내에서 발현 세포수를 비교해본 결과, 대조군에 비하여 RR100에서는 60.61±6.35%, RR400에서는 50.07±7.99 %를 나타내, RR100과 RR400에서 유의성 있게 감소하였음을 알 수 있다(F(2,22)=20.788, p<0.001).
- 강제수영부하실험 결과에서 生地黃400 mg/kg 투여그룹(RR400)에서 부동행동이 유의성 있게 감소하였다. 이는 강제수영부하실험으로 인해 흰쥐의 우울행동이 유발되었고, 生地黃의 투여가 강제 수영부하실험에서 나타나는 흰쥐의 우울행동을 억제하는 작용을 하고 있음을 알 수 있다.
- 3과 같다. 기어오르기(climbing) 행동은 농도 의존적으로 약간의 증가하는 경향을 보였고, 헤엄치기(swimming)행동은 변화가 없었다. 부동행동(immobility)에 있어서 5.
- 발현 세포수를 비교해 본 결과, RR100과 RR400에서 각각 76.25±21.77 %, 65.92±11.57 %를 나타내, PVN 내에서의 CRF의 발현이 감소되었고, 특히 RR400에서는 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다(F(2,14)=2.172, p<0.01).
- 발현 세포수를 비교해 본 결과, 대조군에 비하여 RR100은 63.25±4.60 %, RR400은 77.53±8.51 %를 나타내, RR100은 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타내었다(F(2,16)=5.217, p<0.01)
- 수조에서 물의 높이를 전통적인 15-18cm에서 30cm로 조정했을 때의 행동변화에서는 serotonin과 noradrenalin 신경계에 모두 반응하는 것을 보이며, 헤엄치기(swimming) 행동은 선택적세로토닌재흡수차단제(SSRI, Selective Serotonine Reuptake Inhibitor)를 사용했을 때 증가하고 기어오르기 행동은 catecholamine 전달에 선택적으로 작용하는 약물을 사용했을 때 증가한다. 본 논문에서 나온 결과에서는 헤엄치기 행동에서는 변화가 없었고, 기어오르기에서는 농도 의존적으로 약간의 증가하는 경향을 보였지만 유의성이 없었다24). 이는 청반(Locus Coeruleus)에서 TH의 발현이 증가한 반면 복측피개야(Ventral Tegmental Area)에서 TH의 발현이 억제된 것이 서로 억제작용을 한 것으로 추정된다.
- 이상의 실험과 연구를 살펴보면, 生地黃이 시상 하부 실방핵에서 CRF와 c-Fos, 복측피개야에서 TH의 발현을 감소함으로써 강제수영부하실험에서 흰쥐의 부동행동을 억제시키는 항우울효과가 있다고 생각된다. 시호억간탕의 효능과 비교해보면 시호억간탕에서는 강제수영부하실험에서 청반과 복측피개야에서 모두 TH의 발현을 억제하는 경향이 있었는데 구성약물인 생지황에서는 복측기개야에서만 발현을 억제하는 것으로 나타나 차이가 있음을 알 수 있다8).
- 실방핵에서 CRF 발현 세포수를 비교해 본 결과, 生地黃 400 mg/kg 투여그룹에서는 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, c-Fos 발현 세포수를 비교해 본 결과, 生地黃 100 mg/kg 투여그룹은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다. 이 결과를 보면 c-Fos 발현억제에 의한 CRF 발현이 억제되고 있음을 알 수 있다.
- 실방핵에서 CRF 발현 세포수를 비교해 본 결과, 生地黃 400 mg/kg 투여그룹에서는 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, c-Fos 발현 세포수를 비교해 본 결과, 生地黃 100 mg/kg 투여그룹은 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다. 이 결과를 보면 c-Fos 발현억제에 의한 CRF 발현이 억제되고 있음을 알 수 있다. c-Fos의 발현은 신경 활동을 의미하고 CRF의 발현은 조정자로서의 역할을 의미하므로 강제수영부하실험에 의한 HPA axis system의 활동증가가 억제되었음을 알 수 있다.
- 이상과 같은 실험결과를 볼 때, 生地黃이 시상하부의 실방핵의 CRF와 c-Fos, 복측피개야에서 TH의 발현을 감소함으로써 강제수영부하실험에서 흰쥐의 부동행동을 억제시키는 항우울효과가 있다고 생각된다.
- 이상의 실험과 연구를 살펴보면, 生地黃이 시상 하부 실방핵에서 CRF와 c-Fos, 복측피개야에서 TH의 발현을 감소함으로써 강제수영부하실험에서 흰쥐의 부동행동을 억제시키는 항우울효과가 있다고 생각된다. 시호억간탕의 효능과 비교해보면 시호억간탕에서는 강제수영부하실험에서 청반과 복측피개야에서 모두 TH의 발현을 억제하는 경향이 있었는데 구성약물인 생지황에서는 복측기개야에서만 발현을 억제하는 것으로 나타나 차이가 있음을 알 수 있다8).
- 청반에서 발현 세포수를 비교해 본 결과, 生地黃 100mg/kg 그룹과 生地黃 400mg/kg그룹에서 모두 유의성 있게 증가하였고, 복측피개야 내에서 발현 세포수를 비교해 본 결과, 生地黃 100mg/kg 그룹과 生地黃 400mg/kg 그룹에서 모두 유의성 있게 감소하였다. 이는 NE system에서의 과도한 활성을 억제하기 보다는 DA system의 활성을 억제하는 것으로 판단된다.
후속연구
- 그러므로 柴胡抑肝湯의 항우울 기전을 더 상세히 살피기 위해, 生地黃과 柴胡抑肝湯 內의 다른 藥材와의 배합에서의 항우울 작용에 대한 추가 연구가 필요하다고 사료된다.
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