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문제 정의
- 고생산성 균주를 개발하기 위해서는 최종 생산배양에서 선별된 균주들의 IPS 생산성을 확인해야 하는데, 이를 위해서는 다음의 일련의 배양공정을 거쳐야 한다: 단일 콜로니를 얻기 위한 원형질체 형성 및 재생 -고체성장배지에서의 계대배양 - 정치배양 - 플라스크에서의 성장 액상배양 - 플라스크 액상 생산배양 또는 발효조 액상 생산배양. 본 연구에서는 I. obliquus 균사체의 액상 배양에 적합하고, 동시에 IPS 고생산성의 특성을 갖는 우량균주를 획득하는 방법을 개발하고자 하였다. I.
- obliquus 의 경우 균사체 액상배양 시 포자를 형성하지 않기 때문에 동일한 유전자를 보유한 단일균주의 선별이 어려운데, 배양공정의 안정성과 재현성을 위해서는 고생산성의 단일 균주 개발이 필수적이다. 따라서 본 연구에서는 균사체로부터 세포막을 제거하여 형성된 원형질체로부터 단일 핵을 보유한, 성장속도가 우수한 우량 균주를 선별하여, 이로부터 유효성분인 IPS를 고함유하는 고생산성 균주를 개발하고자 하였다. 이를 위해 원형질체 재생을 위한 재생배지 및 고체 성장배지에서 빠른 성장속도를 보이는 생산균주를 분리하여 플라스크 액상 생산배양을 통해 이들의 배양 생리적 특성을 재조사한 후, 이로부터 IPS 고생산성의 생산균주를 최종 선별하고자 하였다.
- 본 연구에서는 액상 종배양(성장배양)의 바로 이전 단계에 정치배양 공정을 추가로 도입하여 종배양에서 균사모양의 배양형태를 유도하고자 하였다 (Fig. 1). 정치배양을 위해 고체성장배지(SGM)에서 10~15일 동안 배양한 균사체를 직경 1 cm의 agar-cutting용 cork borer No.
- Inonotus obliquus는 포자를 형성하지 않기 때문에 유전자형이 동일한 단일 콜로니를 얻기 위해서 원형질체를 형성시키는 방법을 개발하였다. 전배양을 수행하여 원형질체 형성을 위한 균사체를 획득하였는데, 전배양을 위한 액상배지 (PGM)의 조성은 다음과 같다: glucose 30 g/L, (NH4)2SO4 10 g/L, KH2PO4 5 g/L, MgSO4 3 g/L, CaCl2 0.
- 이는 세포벽이 제거된 원형질체에 UV가 조사되면 대부분의 균주가 재생될 수 없을 정도로 강력한 변이가 유발되었음을 제시해 준다. 따라서 본 연구에서는 보다 온화한 조건에서 변이를 유도하기 위해서 균사체에 UV를 먼저 조사한 후, 원형질체를 형성시키는 방법을 도입하였다. UV처리를 위한 균사체 시료를 준비하기 위해, 전배양된 균사체를 3차증류수로 부유시킨 후 4,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였으며 이 과정을 최소 5회 이상 수행하여 배지성분이 완벽하게 제거된 균사체를 회수하였다.
- Inonotus obliquus와 같은 담자균류의 경우 균사체 액체배양 시 포자를 형성하지 않기 때문에 단일 유전자를 보유한 균주의 선별이 매우 어려운 것으로 잘 알려져 있다 [20,21,22]. 본 연구에서는 균주 개발상의 이러한 문제점을 극복하고자 원형질체를 이용하는 방법을 도입하였다. 즉 생산균주의 균사체로부터 세포벽을 제거하여 각각의 단일 핵을 보유한 원형질체를 분리한 후, 이들을 재생시킴으로써 우수한 품종의 균주를 일차적으로 선별해 내고자 하였다.
- 균사체로부터 원형질체를 형성시킨 후에는 순수한 원형질체를 나머지 잔여물로부터 회수해 내는 것이 중요하다. 본 연구에서는 더욱 많은 원형질체를 얻기 위해 기존의 원형질체 형성방법을 개량하여 고생산성 균주를 선별하고자 하였다. 기존에 사용하던 trapping 방법 [17]은 원형질체를 회수하는 과정에서 손실되는 원형질체의 양이 비교적 많은 것으로 나타나 (최대 회수된 원형질체수 = 5×105 protoplasts/mL), 본 연구에서는 개량된 filtration 방법을 적용해서 원형질체를 회수하고자 하였다 (Fig.
- 상기의 원형질체 형성방법을 이용해서 기존의 균주를 더 훌륭한 배양 형태적 특성 및 배양 생리적 특성을 보이는 생산균주로 개량하기 위해, 형성된 원형질체로부터 단일 colony를 얻고자 하였다. 즉 재생된 원형질체로부터 유전자형이 동일한 단일균주들을 분리 획득한 후, 이 단일 균주들을 고체성장배지(SGM)에서 약 15일간 배양하여 각 균주의 성장속도를 비교하였다.
- 온화한 돌연변이원으로 알려진 UV의 처리에 의해 생산균주를 돌연변이시킴으로써 Inonotus obliquus 균사체의 scale-up 배양 시 색소 저생산성, 고성장성 및 고안정성 변이주를 효율적으로 선별하고자 하였다. Fig.
- 본 실험에서는 상기의 액상 플라스크 실험에서 가장 생산성이 높게 나타난 변이주인 OBLQ756-15를 모균주로 하여 이로부터 유래된 변이주들의 액상배양을 통해 균사체 생산성이 높은 균주를 최종 선별하는 실험을 수행하였다. 이번에는 돌연변이 조건을 더욱 강화하기, wet cell 1 g을 320초 동안 243 nm 파장의 UV를 조사하였고 (약 97% 사멸조건), photo reactivation을 막기 위해 10일 동안의 원형질체재생기간 동안 호일로 밀봉하여 배양하였다.
- Inonotus obliquus 균사체의 액상배양을 통해 항당뇨 및 면역증강 효능의 세포벽다당체 (IPS) 생산 공정을 개발하기 위한 첫 시도로서, 고생산성 균주를 개발하는 연구를 수행하였다. Inonotus obliquus는 균사체로 성장할 때 포자를 형성하지 못하므로 단일 세포주를 얻기가 힘든 것으로 관찰되었다.
- Inonotus obliquus는 균사체로 성장할 때 포자를 형성하지 못하므로 단일 세포주를 얻기가 힘든 것으로 관찰되었다. 따라서 Inonotus obliquus 균사체로부터 대량의 원형질체 형성 및 재생에 의한 단일 콜로니 획득 방법을 개발함으로써 생산균주를 신속하게 개량하고자 하였다. 개량된 filtration 방법을 적용해서 원형질체를 회수한 결과, 기존의 trapping 방법에 의해 회수한 수보다 약 5배 증가한 2.
제안 방법
- 배지멸균은 침전과 갈변현상을 방지하기 위하여 당과 질소원, 무기염류를 분리하여 121℃에서 15분간 수행하였으며, 경우에 따라 0.45 (μm)의 filter를 이용하여 멸균을 수행하였다.
- 따라서 본 연구에서는 균사체로부터 세포막을 제거하여 형성된 원형질체로부터 단일 핵을 보유한, 성장속도가 우수한 우량 균주를 선별하여, 이로부터 유효성분인 IPS를 고함유하는 고생산성 균주를 개발하고자 하였다. 이를 위해 원형질체 재생을 위한 재생배지 및 고체 성장배지에서 빠른 성장속도를 보이는 생산균주를 분리하여 플라스크 액상 생산배양을 통해 이들의 배양 생리적 특성을 재조사한 후, 이로부터 IPS 고생산성의 생산균주를 최종 선별하고자 하였다.
- Inonotus obliquus strain (KACC 50069)을 모균주로 하여 배양을 수행하였다. 균사체 배양을 위해 사용된 배지는 배양 목적에 따라 고체성장배지 (solid growth medium, SGM), 정치배양배지 (static culture growth medium, SCGM), 액상 종배양용 성장배지 (liguid growth medium, LGM)와 액상 생산배양용 생산배지 (liguid production medium, LPM)로 구분하였다. 각 배지의 조성은 다음과 같다:
- 1). 정치배양을 위해 고체성장배지(SGM)에서 10~15일 동안 배양한 균사체를 직경 1 cm의 agar-cutting용 cork borer No. 3을 이용하여 7~10개씩 떼어내어 정치배양용 배지 (SCGM)로 무균상태에서 옮겨준 후 28℃에서 7~10일간 배양하였다. 이후 플라스크 액상배양을 위해, 정치배양에서 회수한 균사체를 Waring blender를 이용하여 20초간 균질화하였다.
- 이후 플라스크 액상배양을 위해, 정치배양에서 회수한 균사체를 Waring blender를 이용하여 20초간 균질화하였다. 균질화된 균사체를 500 mL 플라스크 (조업부피: 100 mL)로 30% (v/v)를 접종하였으며 28℃, 150 rpm에서 4~5일간 성장배양 (액상 성장배지 (LGM) 이용)을 수행한 후, 10% (v/v)의 양을 최종 생산배양용 플라스크로 접종하였다. 최종 생산배양은 500 mL 플라스크 (조업부피: 100 mL) (액상 생산배지 (LPM) 이용)를 이용하여 28℃, 150 rpm에서 7~10일간 수행하였으며, 이로부터 배양 생리적 특성이 우수한 고생산성의 우량균주를 선별하였다.
- 균질화된 균사체를 500 mL 플라스크 (조업부피: 100 mL)로 30% (v/v)를 접종하였으며 28℃, 150 rpm에서 4~5일간 성장배양 (액상 성장배지 (LGM) 이용)을 수행한 후, 10% (v/v)의 양을 최종 생산배양용 플라스크로 접종하였다. 최종 생산배양은 500 mL 플라스크 (조업부피: 100 mL) (액상 생산배지 (LPM) 이용)를 이용하여 28℃, 150 rpm에서 7~10일간 수행하였으며, 이로부터 배양 생리적 특성이 우수한 고생산성의 우량균주를 선별하였다. 본 연구에서 사용한 고체성장배양, 정치배양, 플라스크 액상 성장배양 및 액상 생산배양에 관한 일련의 배양공정을 Fig.
- 최종 생산배양은 500 mL 플라스크 (조업부피: 100 mL) (액상 생산배지 (LPM) 이용)를 이용하여 28℃, 150 rpm에서 7~10일간 수행하였으며, 이로부터 배양 생리적 특성이 우수한 고생산성의 우량균주를 선별하였다. 본 연구에서 사용한 고체성장배양, 정치배양, 플라스크 액상 성장배양 및 액상 생산배양에 관한 일련의 배양공정을 Fig. 1에 도식적으로 제시하였다.
- 상기의 고체성장배지 (SGM)를 계대배양 배지로도 이용하여, 약 8일 마다 계대배양을 수행하였다. SGM에서 배양한 Inonotus obliquus 균사체를 상기에 제시된 바와 동일하게 정치배양을 수행하였다.
- 상기의 고체성장배지 (SGM)를 계대배양 배지로도 이용하여, 약 8일 마다 계대배양을 수행하였다. SGM에서 배양한 Inonotus obliquus 균사체를 상기에 제시된 바와 동일하게 정치배양을 수행하였다. 이로부터 얻은 균사체를 균질화하여 액상 성장배지 (LGM)에서 플라스크 성장배양을 28℃, 150 rpm에서 약 4일간 수행한 후, 20% glycerol stock을 만들어 -80℃에 보관하였다.
- 이로부터 얻은 균사체를 균질화하여 액상 성장배지 (LGM)에서 플라스크 성장배양을 28℃, 150 rpm에서 약 4일간 수행한 후, 20% glycerol stock을 만들어 -80℃에 보관하였다. 이 stock을 필요시마다 꺼내어 100 mm petridish의 SGM에 접종하여 약 10일 동안 28℃에서 재활성화 (reactivation)시킨 후, Fig. 1에 제시된 일련의 배양공정을 수행하였다.
- 2). 회수한 균사체를 0.6 M KCl(0.1 M phosphate, pH 5.8)로 수차례 washing한 후 균사체 1 g (wet weight)을 측정하여 원형질체 형성에 이용하였다. 원형질체 형성을 위해서 OM-A buffer(1.
- 8-Trizma acidR and Trizma alkaliR) 5 mL에 균사체 1 g과 2%의 Novozyme 234를 첨가하여 잘 섞어준 후 28℃, 100 rpm에서 약 3시간 동안 반응시켰다. 원형질체가 형성되는 상태를 30~40분 간격으로 현미경을 통해 관찰하면서 반응 시간을 결정하였다. 형성된 원형질체는 세포벽이 제거된 상태로 삼투압에 매우 약한 형상을 보이며 물리적인 충격에도 다소 약한 특성이 있기 때문에 가능한 한 충격을 완화하면서 이 원형질체들을 회수하였다.
- 2 M, agar powder 20 g/L) 위에 pour plating하였다. 접종한 배지를 28℃에서 9~11일 정도 배양한 후 재생된 원형질체를 관찰하였다. 원형질체 형성, 회수 및 재생에 관한 일련의 과정과 실험조건을 Fig.
- 2에 제시하였다. 재생된 원형질체는 자체 제작한 0.5 mm agar cylinder를 이용하여 주변의 다른 균사체가 닿지 않도록 하여 각각 분리해 낸 후, 고체성장배지(SGM)에 옮겨서 10~15일 동안 배양하면서 각 균주의 배양 생리적 특성을 조사하였는데, 이 고체성장배지에서 빠른 성장속도를 보이는 균주들을 우량 균주로 1차 선별하였다.
- 따라서 본 연구에서는 보다 온화한 조건에서 변이를 유도하기 위해서 균사체에 UV를 먼저 조사한 후, 원형질체를 형성시키는 방법을 도입하였다. UV처리를 위한 균사체 시료를 준비하기 위해, 전배양된 균사체를 3차증류수로 부유시킨 후 4,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였으며 이 과정을 최소 5회 이상 수행하여 배지성분이 완벽하게 제거된 균사체를 회수하였다. 이렇게 회수된 1 g의 균사체를 glass petridish 내의 5 mL의 phosphate buffer 용액에 넣어준 후, 이를 rocker 위에서 온화하게 혼합하면서 UV를 조사하였다.
- UV처리를 위한 균사체 시료를 준비하기 위해, 전배양된 균사체를 3차증류수로 부유시킨 후 4,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였으며 이 과정을 최소 5회 이상 수행하여 배지성분이 완벽하게 제거된 균사체를 회수하였다. 이렇게 회수된 1 g의 균사체를 glass petridish 내의 5 mL의 phosphate buffer 용액에 넣어준 후, 이를 rocker 위에서 온화하게 혼합하면서 UV를 조사하였다. UV 처리는 암소에서 254 nm의 15 W UV lamp (VIBER LOURMAT 사, VL-215C) 2개를 15 cm 거리에서 80~400초 동안 조사한 후, 변이된 균사체를 멸균된 플라스크로 옮겨 단일 변이주 선별을 위한 원형질체 형성 및 재생 실험을 상기와 동일하게 수행 (Fig.
- 이렇게 회수된 1 g의 균사체를 glass petridish 내의 5 mL의 phosphate buffer 용액에 넣어준 후, 이를 rocker 위에서 온화하게 혼합하면서 UV를 조사하였다. UV 처리는 암소에서 254 nm의 15 W UV lamp (VIBER LOURMAT 사, VL-215C) 2개를 15 cm 거리에서 80~400초 동안 조사한 후, 변이된 균사체를 멸균된 플라스크로 옮겨 단일 변이주 선별을 위한 원형질체 형성 및 재생 실험을 상기와 동일하게 수행 (Fig. 2)하였다. 돌연변이주 개발을 위한 전 공정을 Fig.
- 3에 요약 제시하였다. 궁극적으로는 재생된 원형질체로부터 단일 변이주들을 각각 분리한 후, Fig. 1에 제시된 바와 같이 고생산성 균주 개발을 위한 일련의 배양공정을 수행하였다.
- Inonotus obliquus로부터 β-D-glucan의 구조를 갖는 세포벽다당체 (IPS)의 정량분석을 위해, 배양한 균사체를 원심분리하여 상등액을 제거한 후 증류수를 이용하여 3번의 세척과정을 수행하였다.
- 배양액으로부터 균일하게 균사체를 회수한 다음 20 mL의 배양액을 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 회수하여 1.5 mL tube에 옮겨 남아 있는 당의 측정에 사용하였고, 나머지 상등액을 제거한 후 3번의 세척과정을 통해서 남아 있는 당, 불용성 물질이나 염류들을 제거하였다. 이 후 weighting dish에 담아 90℃에서 12시간 건조하여 DCW의 무게에 변화가 없는 것을 확인한 후 건조중량을 측정하여 1 L당 세포농도로 환산하여 나타내었다.
- 5 mL tube에 옮겨 남아 있는 당의 측정에 사용하였고, 나머지 상등액을 제거한 후 3번의 세척과정을 통해서 남아 있는 당, 불용성 물질이나 염류들을 제거하였다. 이 후 weighting dish에 담아 90℃에서 12시간 건조하여 DCW의 무게에 변화가 없는 것을 확인한 후 건조중량을 측정하여 1 L당 세포농도로 환산하여 나타내었다. 경우에 따라서는 회수한 배양액을 paper filter를 이용하여 세척한 후, 이를 microwave oven을 이용하여 20분간 건조하여 DCW를 측정하였다.
- 이 후 weighting dish에 담아 90℃에서 12시간 건조하여 DCW의 무게에 변화가 없는 것을 확인한 후 건조중량을 측정하여 1 L당 세포농도로 환산하여 나타내었다. 경우에 따라서는 회수한 배양액을 paper filter를 이용하여 세척한 후, 이를 microwave oven을 이용하여 20분간 건조하여 DCW를 측정하였다.
- 9% 에탄올에서 6시간 동안 침전시켰다. 이를 2,800 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 동결건조한 후, HPLC용 gel chromatography column과 ELSD detector를 이용하여 IPS를 정량분석하였다. Fig.
- 본 연구에서는 균주 개발상의 이러한 문제점을 극복하고자 원형질체를 이용하는 방법을 도입하였다. 즉 생산균주의 균사체로부터 세포벽을 제거하여 각각의 단일 핵을 보유한 원형질체를 분리한 후, 이들을 재생시킴으로써 우수한 품종의 균주를 일차적으로 선별해 내고자 하였다.
- 또한 전배양에 따른 세포의 상태가 무엇보다도 중요한 요건 중의 하나인 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 원형질체 형성에 사용하기 위한 균사체로서, 정치배양에서 7일 동안 자란 균사체를 수거하여 2일간 28℃에서 진탕 배양하고 이들 다시 계대하여 3일 동안 배양한 어리고 대사작용이 활발한 균사체를 이용하였다. 그 이유는 원형질체 형성에 있어서 가장 중요한 요인이 균사체의 상태인 것으로 확인되었기 때문이다.
- 기존에 사용하던 trapping 방법 [17]은 원형질체를 회수하는 과정에서 손실되는 원형질체의 양이 비교적 많은 것으로 나타나 (최대 회수된 원형질체수 = 5×105 protoplasts/mL), 본 연구에서는 개량된 filtration 방법을 적용해서 원형질체를 회수하고자 하였다 (Fig. 2에 실험방법제시).
- 상기의 원형질체 형성방법을 이용해서 기존의 균주를 더 훌륭한 배양 형태적 특성 및 배양 생리적 특성을 보이는 생산균주로 개량하기 위해, 형성된 원형질체로부터 단일 colony를 얻고자 하였다. 즉 재생된 원형질체로부터 유전자형이 동일한 단일균주들을 분리 획득한 후, 이 단일 균주들을 고체성장배지(SGM)에서 약 15일간 배양하여 각 균주의 성장속도를 비교하였다. 본 연구팀의 선행 연구결과에 따르면 Inonotus obliquus 균사체의 경우 세포벽 단백다당체 (intracellular polysaccharides)인 IPS의 함량이 세포 무게당 거의 일정한 것으로 관찰되었으므로 (데이타 미제시), 세포벽 단백다당체 (IPS)의 생산성을 증가시키기 위해서는 액상 생산배양시 균사체 생산량 증가가 가장 중요한 요인으로 판단되었다.
- 7). 상기의 방법에 의해 선별된 다수의 원형질체를 이용해서 기존의 균주보다 더 좋은 배양 형태적 특성 및 생리적 특성을 보이는 생산균주를 지속적으로 선별하였다. 궁극적으로는 플라스크 액상배양실험을 통해 고체성장배지에서 선별된 균주들의 균사체 생산성을 조사한 후, 이로부터 안정적인 생산성을 보인 OBLQ89 균주를 최종 선별했으며, 다시 이 균주를 모균주로 이용하여 하기의 UV 변이처리를 통한 지속적인 균주개량을 수행하였다.
- 상기의 방법에 의해 선별된 다수의 원형질체를 이용해서 기존의 균주보다 더 좋은 배양 형태적 특성 및 생리적 특성을 보이는 생산균주를 지속적으로 선별하였다. 궁극적으로는 플라스크 액상배양실험을 통해 고체성장배지에서 선별된 균주들의 균사체 생산성을 조사한 후, 이로부터 안정적인 생산성을 보인 OBLQ89 균주를 최종 선별했으며, 다시 이 균주를 모균주로 이용하여 하기의 UV 변이처리를 통한 지속적인 균주개량을 수행하였다.
- 3에 제시한 바대로, 균사 상태의 모균주를 UV로 변이처리한 후 세포벽 분해효소로 처리하고, 이로부터 돌이변이된 원형질체들을 유도한 후 이들의 재생과정을 거쳐 돌연변이 균주를 획득할 수 있었다. 변이처리 시 치사율이 90%인 (minimum inhibitory concentration, MIC, 최소저해농도)를 구했으며, 이 조건에서 살아남은 균주를 이용하여 균주개량을 수행해 나갔다 (Fig. 8). OBLQ89 균주의 경우 치사율이 90%인 MIC 조건은 UV 변이처리시간이 약 320초 사이인 것으로 확인되었다.
- 이들 균주 중에 고체 성장배지에서 균사체의 성장속도가 빠르면서 동시에 IPS 생산에 양호한 흰색의 pigment를 생산하는 특성을 갖는 균주인 OBLQ234번 균주를 최종 선별할 수 있었다. 궁극적으로는 이들의 플라스크 액상배양 실험을 통하여 배양 생리적 특성 및 배양 형태적 특성을 규명한 후, 이로부터 안정적인 생산성을 보인 OBLQ432, 528, 756 균주들을 최종 선별했으며, 이 균주들을 액상배양에서의 배지 최적화 연구, IPS 고생산성 우량균주를 선별하기 위한 모균주로 사용하였다.
- 고체 성장배지에서 가장 높은 생산성과 안정성을 보인 상기의 세 변이주를 각각 모균주로 하여 액상배양을 통해 높은 균사체 생산성을 보이는 우량 변이주를 선별하는 균주개량 실험을 수행하였다. 각각의 모균주를 UV 변이처리한 후, 회수된 원형질체를 재생배지에 pour plating하여 재생시켰으며 이 중 빠르게 성장하는 균사체 colony를 획득하여, Fig.
- 고체 성장배지에서 가장 높은 생산성과 안정성을 보인 상기의 세 변이주를 각각 모균주로 하여 액상배양을 통해 높은 균사체 생산성을 보이는 우량 변이주를 선별하는 균주개량 실험을 수행하였다. 각각의 모균주를 UV 변이처리한 후, 회수된 원형질체를 재생배지에 pour plating하여 재생시켰으며 이 중 빠르게 성장하는 균사체 colony를 획득하여, Fig. 2에 제시된 배양공정에 따라, 즉 고체 성장배양과 정치배양을 수행한 후, 플라스크에서 균사체의 액상배양을 수행 (액상 성장배지에서 4일, 액상 생산배지에서 7일 동안 배양)하여 각 변이주의 균사체 생산성을 조사하였다. 앞서 언급한 바와 같이 Inonotus obliquus 균사체의 경우 세포벽의 단백다당체 (IPS)의 함량이 세포 무게당 거의 일정한 양을 함유하고 있는 것으로 관찰되었으므로, IPS의 생산성을 증가시키기 위해서는 액상 생산배양 시 균사체의 생산량증가가 가장 중요한 요인으로 판단되었다.
- 우선적으로 OBLQ432를 모균주로 하여 이로부터 유래된 우량 변이주들의 플라스크 액상배양을 통해, 실제 생산배양에서 IPS 고생산성을 보이는 균주를 선별하는 실험을 수행하였다. 재생배지로부터 총 21개의 단일 colony를 분리하여 성장배양과 생산배양을 거친 우량균주들의 균사체 생산성을 Fig.
- 11에 제시하였다. 모균주인 OBLQ432와 비슷하거나 더 높은 균체 생산성 (15 gDCW/L 이상)을 보이는 균주가 다수를 차지했는데 (Fig. 11), 특별히 OBLQ432-2, OBLQ432-9, OBLQ432-17번 균주와 같이 액상 생산배양에서 모균주보다 더 우수한 생산성을 보이는 우량균주를 찾을 수 있었고, 이를 20% glycerol로 회수하여 -80℃에 보관하였으며 필요시 해동하여 사용하였다.
- 상기의 OBLQ432 균주 실험에서 관찰된 현상으로서, 고체 성장배지에서 자라나는 형태, 즉 균사체의 밀도나 성장환의 직경에 따라서 최종 액상배양에서 균체 생산성에 차이를 보이는 것으로 나타났다. 따라서 OBLQ528을 모균주로 하여 액상 생산배양에서 고생산성을 보이는 균주를 선별하는 실험의 경우에는, OBLQ528 유래의 균주들을 고체 성장배양 과정 중에 균사체의 밀도나 성장환의 크기에 따라서 3가지 그룹으로 나누어 (Fig. 12), 각 그룹에 속한 각각의 균주들의 최종 액상 생산배양에서의 생산성을 조사하는 실험을 수행하였다. 이와 같은 실험을 수행한 이유는 일단 선별된 균주들로부터 고생산성의 균주를 재선별하는 경우, 초기 단계인 고체 성장배양 과정에서 고생산성의 가능성을 보이는 균주들을 미리 선별하는 방법을 도입함으로써 최종 액상 생산배양에 이르는 균주의 개수를 줄이기 위함이다.
- 상기의 균주개량 실험과 마찬가지로 이번에는 OBLQ756균주를 모균주로 하여 이로부터 유래된 변이주들의 최종액상 생산배양에서 성장 정도가 큰 균주를 선별하는 실험을 수행하였다. 고체배지에서 단일 colony를 이룬 90개의 균주들 중에서 균사체의 밀도와 직경을 비교하여 31개의 우량 균주들을 최종 선별한 후, 액상 생산배양에 이들의 균사체의 생산성을 조사하였다.
- 상기의 균주개량 실험과 마찬가지로 이번에는 OBLQ756균주를 모균주로 하여 이로부터 유래된 변이주들의 최종액상 생산배양에서 성장 정도가 큰 균주를 선별하는 실험을 수행하였다. 고체배지에서 단일 colony를 이룬 90개의 균주들 중에서 균사체의 밀도와 직경을 비교하여 31개의 우량 균주들을 최종 선별한 후, 액상 생산배양에 이들의 균사체의 생산성을 조사하였다. Fig.
- 본 실험에서는 상기의 액상 플라스크 실험에서 가장 생산성이 높게 나타난 변이주인 OBLQ756-15를 모균주로 하여 이로부터 유래된 변이주들의 액상배양을 통해 균사체 생산성이 높은 균주를 최종 선별하는 실험을 수행하였다. 이번에는 돌연변이 조건을 더욱 강화하기, wet cell 1 g을 320초 동안 243 nm 파장의 UV를 조사하였고 (약 97% 사멸조건), photo reactivation을 막기 위해 10일 동안의 원형질체재생기간 동안 호일로 밀봉하여 배양하였다. 돌연변이된 원형질체로부터 재생된 변이주들을 회수한 후, 이 중 고체배지에서 성장속도가 빠른 우량균주를 1차적으로 선발하였고, 선발된 각각 균주들의 균체생산성을 확인하기 위해 플라스크 성장배양 및 생산배양에 이르는 일련의 배양공정 (Fig.
- 이번에는 돌연변이 조건을 더욱 강화하기, wet cell 1 g을 320초 동안 243 nm 파장의 UV를 조사하였고 (약 97% 사멸조건), photo reactivation을 막기 위해 10일 동안의 원형질체재생기간 동안 호일로 밀봉하여 배양하였다. 돌연변이된 원형질체로부터 재생된 변이주들을 회수한 후, 이 중 고체배지에서 성장속도가 빠른 우량균주를 1차적으로 선발하였고, 선발된 각각 균주들의 균체생산성을 확인하기 위해 플라스크 성장배양 및 생산배양에 이르는 일련의 배양공정 (Fig. 1)을 이전과 동일하게 수행하였다.
- 균체농도 측정은 균사체 건조중량 (dry cell weight, DCW)을 이용하였다. 배양액으로부터 균일하게 균사체를 회수한 다음 20 mL의 배양액을 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다.
대상 데이터
- Inonotus obliquus strain (KACC 50069)을 모균주로 하여 배양을 수행하였다. 균사체 배양을 위해 사용된 배지는 배양 목적에 따라 고체성장배지 (solid growth medium, SGM), 정치배양배지 (static culture growth medium, SCGM), 액상 종배양용 성장배지 (liguid growth medium, LGM)와 액상 생산배양용 생산배지 (liguid production medium, LPM)로 구분하였다.
이론/모형
- 회수방법으로는 비교적 짧은 시간에 실험을 수행할 수 있는 filtration(pore size 20~25 μm. Watman No. 4) 방법을 이용하였다 (Fig. 2).
성능/효과
- 그 결과 trapping 방법에 의해 회수한 수보다 약 5배 증가한 2.3×106 protoplasts/mL의 원형질체를 회수할 수 있었다.
- 즉 균사가 충분히 자라 세포벽이 단단해진 뒤에는 원형질체를 분리해 내기 어려운 것으로 관찰되었다. 균체가 pellet을 형성하지 않고 성긴 균사(loose filamentous)형태로 자라는 것이 좋으며 배양기간은 짧게 하여 어린 균사체를 사용하는 것이 원형질체 형성에 효율적인 것으로 선행 연구 결과 확인되었다. 다양한 전배양 배지를 조사한 결과, 특별히 합성배지인 PGM배지를 사용시 생산균주의 배양형태가 protoplast 형성율 증가에 필수적인 균사 (filamentous) 모양으로 유지되는 것으로 나타났다.
- 균체가 pellet을 형성하지 않고 성긴 균사(loose filamentous)형태로 자라는 것이 좋으며 배양기간은 짧게 하여 어린 균사체를 사용하는 것이 원형질체 형성에 효율적인 것으로 선행 연구 결과 확인되었다. 다양한 전배양 배지를 조사한 결과, 특별히 합성배지인 PGM배지를 사용시 생산균주의 배양형태가 protoplast 형성율 증가에 필수적인 균사 (filamentous) 모양으로 유지되는 것으로 나타났다.
- 1 mL를 고체 재생배지와 같은 성분의 soft 재생배지 5 mL에 첨가한 후, 이 혼합용액을 고체 재생배지에 pour plating하여 원형질체를 재생시켰다. 28℃에서 약 10일 경과 후 재생된 콜로니를 계수한 결과, 원형질체 재생률 (형성된 원형질체 수/접종한 원형질체 수)은 약 10-2~10-3로서 꽤 높은 것으로 관찰되었다. 궁극적으로 이와 같은 원형질체 형성 및 재생방법을 통해 유전자형이 동일한 단일 생산균주를 다수 선별할 수 있는 효율적인 방법을 개발할 수 있었다.
- 28℃에서 약 10일 경과 후 재생된 콜로니를 계수한 결과, 원형질체 재생률 (형성된 원형질체 수/접종한 원형질체 수)은 약 10-2~10-3로서 꽤 높은 것으로 관찰되었다. 궁극적으로 이와 같은 원형질체 형성 및 재생방법을 통해 유전자형이 동일한 단일 생산균주를 다수 선별할 수 있는 효율적인 방법을 개발할 수 있었다.
- 즉 재생된 원형질체로부터 유전자형이 동일한 단일균주들을 분리 획득한 후, 이 단일 균주들을 고체성장배지(SGM)에서 약 15일간 배양하여 각 균주의 성장속도를 비교하였다. 본 연구팀의 선행 연구결과에 따르면 Inonotus obliquus 균사체의 경우 세포벽 단백다당체 (intracellular polysaccharides)인 IPS의 함량이 세포 무게당 거의 일정한 것으로 관찰되었으므로 (데이타 미제시), 세포벽 단백다당체 (IPS)의 생산성을 증가시키기 위해서는 액상 생산배양시 균사체 생산량 증가가 가장 중요한 요인으로 판단되었다.
- 6에 제시하였다. 고체성장배지에서 대부분의 균주들의 성장환의 직경이 40 mm에서 45 mm인 반면 11번 균주의 경우 51 mm 로서 가장 높은 성장속도를 보이는 것으로 나타났다. 한편 또 다른 원형질체로부터 재생된 균주를 이용한 실험에서는 직경 50 mm 이상을 보이는 3종류의 균주들을 성공적으로 분리해 낼 수 있었다 (Fig.
- 8). OBLQ89 균주의 경우 치사율이 90%인 MIC 조건은 UV 변이처리시간이 약 320초 사이인 것으로 확인되었다. 400초를 조사할 경우에 거의 모든 원형질체가 재생되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
- OBLQ89 균주의 경우 치사율이 90%인 MIC 조건은 UV 변이처리시간이 약 320초 사이인 것으로 확인되었다. 400초를 조사할 경우에 거의 모든 원형질체가 재생되지 않는 것을 확인할 수 있었다. Fig.
- 약 320초간 UV 변이처리 후 재생된 변이주를 선별하여 고체배지 (SGM) 상에서 약 15일 동안 Inonotus obliquus 균사의 성장속도를 비교한 결과, 대부분의 균주들은 직경이 50~60 mm 정도에 분포하고 있었으나, 모균주인 OBLQ89 균주보다 더 빠른 성장속도를 보이는 변이주 들을 다수 획득할 수 있었다(데이타 미제시). 또한 control로서 UV 변이처리를 하지 않고 재생시킨 모균주보다도 변이주들의 균사 성장속도가 상당히 빠른 것을 확인할 수 있었으며, 기존의 모균주보다 비교적 더 흰색으로 자라는, 색소 저생산성의 우량 균주도 관찰되었다.
- 약 320초간 UV 변이처리 후 재생된 변이주를 선별하여 고체배지 (SGM) 상에서 약 15일 동안 Inonotus obliquus 균사의 성장속도를 비교한 결과, 대부분의 균주들은 직경이 50~60 mm 정도에 분포하고 있었으나, 모균주인 OBLQ89 균주보다 더 빠른 성장속도를 보이는 변이주 들을 다수 획득할 수 있었다(데이타 미제시). 또한 control로서 UV 변이처리를 하지 않고 재생시킨 모균주보다도 변이주들의 균사 성장속도가 상당히 빠른 것을 확인할 수 있었으며, 기존의 모균주보다 비교적 더 흰색으로 자라는, 색소 저생산성의 우량 균주도 관찰되었다. 이들 균주 중에 고체 성장배지에서 균사체의 성장속도가 빠르면서 동시에 IPS 생산에 양호한 흰색의 pigment를 생산하는 특성을 갖는 균주인 OBLQ234번 균주를 최종 선별할 수 있었다.
- 또한 control로서 UV 변이처리를 하지 않고 재생시킨 모균주보다도 변이주들의 균사 성장속도가 상당히 빠른 것을 확인할 수 있었으며, 기존의 모균주보다 비교적 더 흰색으로 자라는, 색소 저생산성의 우량 균주도 관찰되었다. 이들 균주 중에 고체 성장배지에서 균사체의 성장속도가 빠르면서 동시에 IPS 생산에 양호한 흰색의 pigment를 생산하는 특성을 갖는 균주인 OBLQ234번 균주를 최종 선별할 수 있었다. 궁극적으로는 이들의 플라스크 액상배양 실험을 통하여 배양 생리적 특성 및 배양 형태적 특성을 규명한 후, 이로부터 안정적인 생산성을 보인 OBLQ432, 528, 756 균주들을 최종 선별했으며, 이 균주들을 액상배양에서의 배지 최적화 연구, IPS 고생산성 우량균주를 선별하기 위한 모균주로 사용하였다.
- 2에 제시된 배양공정에 따라, 즉 고체 성장배양과 정치배양을 수행한 후, 플라스크에서 균사체의 액상배양을 수행 (액상 성장배지에서 4일, 액상 생산배지에서 7일 동안 배양)하여 각 변이주의 균사체 생산성을 조사하였다. 앞서 언급한 바와 같이 Inonotus obliquus 균사체의 경우 세포벽의 단백다당체 (IPS)의 함량이 세포 무게당 거의 일정한 양을 함유하고 있는 것으로 관찰되었으므로, IPS의 생산성을 증가시키기 위해서는 액상 생산배양 시 균사체의 생산량증가가 가장 중요한 요인으로 판단되었다.
- 상기의 OBLQ432 균주 실험에서 관찰된 현상으로서, 고체 성장배지에서 자라나는 형태, 즉 균사체의 밀도나 성장환의 직경에 따라서 최종 액상배양에서 균체 생산성에 차이를 보이는 것으로 나타났다. 따라서 OBLQ528을 모균주로 하여 액상 생산배양에서 고생산성을 보이는 균주를 선별하는 실험의 경우에는, OBLQ528 유래의 균주들을 고체 성장배양 과정 중에 균사체의 밀도나 성장환의 크기에 따라서 3가지 그룹으로 나누어 (Fig.
- 1)를 생략할 수 있게 되어, 보다 신속하고 효율적으로 균주를 선별할 수 있을 것으로 판단되었다. 예상했던 바대로, 또한 이전에 균주선별의 초기 단계에서 관찰되었던 결과처럼, 고체 성장배양에서 균사체의 환의 크기와 밀도가 가장 작았던 27~32번 균주의 경우에 최종 액상 생산배양에서도 가장 낮은 균체 생산성을 보여주었다 (Fig. 13). 한편 대다수의 균주는 모균주인 OBLQ528에 비해 더 높은 균체생산성 (15 gDCW/L 이상)을 보이는 것으로 나타났는데 (Fig.
- 13). 한편 대다수의 균주는 모균주인 OBLQ528에 비해 더 높은 균체생산성 (15 gDCW/L 이상)을 보이는 것으로 나타났는데 (Fig. 14), 이로부터 18 g/L 범의의 균체 생산성을 보이는 세 균주 (OBLQ528-2, OBLQ528-3, OBLQ528-6)를 최종선별할 수 있었다.
- 이번 실험을 통해 이미 선별된 고생산성 균주일지라도, 이 균주로부터 다시 우량균주를 선별하는 경우에는 고체 성장배양에서 가능한 한 많은 수의 콜로니를 얻은 후에, 이로부터 잘 자라지 않는 균주들을 선별과정에서 미리 제외시켜야만 최종 액상배양에서의 균주 선별의 효율성을 높일 수 있음을 확인할 수 있었다. 한편 OBLQ528 균주의 히스토그램 (Fig.
- 이번 실험을 통해 이미 선별된 고생산성 균주일지라도, 이 균주로부터 다시 우량균주를 선별하는 경우에는 고체 성장배양에서 가능한 한 많은 수의 콜로니를 얻은 후에, 이로부터 잘 자라지 않는 균주들을 선별과정에서 미리 제외시켜야만 최종 액상배양에서의 균주 선별의 효율성을 높일 수 있음을 확인할 수 있었다. 한편 OBLQ528 균주의 히스토그램 (Fig. 14)과 OBLQ432 균주의 히스토그램 (Fig. 12)을 비교해보면, 최종 액상 생산배양에서 OBLQ28로부터 유래한 균주들의 균사체 생산성이 OBLQ432에서 유래한 균주들보다 더 높음을 알 수 있다.
- 고체배지에서 단일 colony를 이룬 90개의 균주들 중에서 균사체의 밀도와 직경을 비교하여 31개의 우량 균주들을 최종 선별한 후, 액상 생산배양에 이들의 균사체의 생산성을 조사하였다. Fig. 15와 Fig. 16에 제시한 바와 같이 약 50% 정도가 모균주인 OBLQ756보다 더 높은 균체생산성 (14 gDCW/L 이상)을 보여주는 것으로 관찰되었다. 한편 균체생산성의 범위는 8~18 gDCW/L에 이르는 광범위한 분포를 보여주었는데 (Fig.
- 16에 제시한 바와 같이 약 50% 정도가 모균주인 OBLQ756보다 더 높은 균체생산성 (14 gDCW/L 이상)을 보여주는 것으로 관찰되었다. 한편 균체생산성의 범위는 8~18 gDCW/L에 이르는 광범위한 분포를 보여주었는데 (Fig. 16), 이로부터 OBLQ756 균주로부터 유래된 변이주들의 생산 안정성이 다른 균주들에 비해 비교적 낮음을 확인할 수 있었다. 본 실험으로부터 16~18 g/L 범의의 균체생산성을 보이는 세 균주 (OBLQ756-4, OBLQ756-13, OBLQ756-15)를 최종선별하여 이들의 glycerol stock을 -80℃에 보관하였다.
- 개량된 filtration 방법을 적용해서 원형질체를 회수한 결과, 기존의 trapping 방법에 의해 회수한 수보다 약 5배 증가한 2.3×106 protoplasts/mL의 원형질체를 회수할 수 있었으며, 원형질체 재생률 또한 10-2~10-3로서 비교적 높게 나타났다.
- Inonotus obliquus 균사체의 액상배양을 통해 항당뇨 및 면역증강 효능의 세포벽다당체 (IPS) 생산 공정을 개발하기 위한 첫 시도로서, 고생산성 균주를 개발하는 연구를 수행하였다. Inonotus obliquus는 균사체로 성장할 때 포자를 형성하지 못하므로 단일 세포주를 얻기가 힘든 것으로 관찰되었다. 따라서 Inonotus obliquus 균사체로부터 대량의 원형질체 형성 및 재생에 의한 단일 콜로니 획득 방법을 개발함으로써 생산균주를 신속하게 개량하고자 하였다.
- 3×106 protoplasts/mL의 원형질체를 회수할 수 있었으며, 원형질체 재생률 또한 10-2~10-3로서 비교적 높게 나타났다. 한편 Inonotus obliquus 균사체의 경우 IPS의 함량이 세포 무게 당 거의 일정한 양을 함유하고 있는 것으로 확인되었으므로, IPS의 생산성을 증가시키기 위해서는 최종 액상 생산배양에서의 균체량 증가가 가장 중요한 것으로 판단되었다. IPS 고생산성의 균주를 개발하기 위해, 이미 선별된 고생산성 균주들의 균사체를 다양한 조건으로 UV 처리한 후, 생존한 원형질체로부터 고생산성의 변이주들을 지속적으로 선별한 결과, 16~18 g DCW/L 범의의 높은 균체 생산성을 보이는 우량균주들을 다수 선별할 수 있었다.
- 한편 Inonotus obliquus 균사체의 경우 IPS의 함량이 세포 무게 당 거의 일정한 양을 함유하고 있는 것으로 확인되었으므로, IPS의 생산성을 증가시키기 위해서는 최종 액상 생산배양에서의 균체량 증가가 가장 중요한 것으로 판단되었다. IPS 고생산성의 균주를 개발하기 위해, 이미 선별된 고생산성 균주들의 균사체를 다양한 조건으로 UV 처리한 후, 생존한 원형질체로부터 고생산성의 변이주들을 지속적으로 선별한 결과, 16~18 g DCW/L 범의의 높은 균체 생산성을 보이는 우량균주들을 다수 선별할 수 있었다. 특히 고체 성장배지에서 빠른 성장속도를 보여주는 대부분의 균주들이 최종 액상 생산배양에서도 고생산성 및 고안정성을 보여주는 것으로 나타났다.
- IPS 고생산성의 균주를 개발하기 위해, 이미 선별된 고생산성 균주들의 균사체를 다양한 조건으로 UV 처리한 후, 생존한 원형질체로부터 고생산성의 변이주들을 지속적으로 선별한 결과, 16~18 g DCW/L 범의의 높은 균체 생산성을 보이는 우량균주들을 다수 선별할 수 있었다. 특히 고체 성장배지에서 빠른 성장속도를 보여주는 대부분의 균주들이 최종 액상 생산배양에서도 고생산성 및 고안정성을 보여주는 것으로 나타났다. 이 결과로부터 일련의 균주 개발 공정의 초기 단계에 속하는 고체 성장배양에서 성장속도가 낮은 균주들을 미리 제외시킬 경우, 균주선별의 효율성이 매우 높아짐을 확인할 수 있었다.
- 특히 고체 성장배지에서 빠른 성장속도를 보여주는 대부분의 균주들이 최종 액상 생산배양에서도 고생산성 및 고안정성을 보여주는 것으로 나타났다. 이 결과로부터 일련의 균주 개발 공정의 초기 단계에 속하는 고체 성장배양에서 성장속도가 낮은 균주들을 미리 제외시킬 경우, 균주선별의 효율성이 매우 높아짐을 확인할 수 있었다. 최종적으로 97%의 치사율을 보이는 UV 변이처리 조건에서 균사체 생산성이 약 22 g/L에 이르며, 생산 안정성도 높은 우량균주 (OBLQ756-15-5)를 획득할 수 있었는데, 이 균주를 이용하여 현재 IPS 대량 생산을 위한 pilot-scale 발효조 배양공정을 개발 중이다.
- 이 결과로부터 일련의 균주 개발 공정의 초기 단계에 속하는 고체 성장배양에서 성장속도가 낮은 균주들을 미리 제외시킬 경우, 균주선별의 효율성이 매우 높아짐을 확인할 수 있었다. 최종적으로 97%의 치사율을 보이는 UV 변이처리 조건에서 균사체 생산성이 약 22 g/L에 이르며, 생산 안정성도 높은 우량균주 (OBLQ756-15-5)를 획득할 수 있었는데, 이 균주를 이용하여 현재 IPS 대량 생산을 위한 pilot-scale 발효조 배양공정을 개발 중이다.
후속연구
- 18). 이 균주들 OBLQ756-15-5로 명명한 후, 이 균주를 이용하여 pilot-scale 발효조를 이용한 단백다당체(IPS)의 대량 생산 연구를 수행 중이며 이에 대한 연구결과는 곧 발표될 예정이다.
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