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문제 정의
- 그 이유는 이 배양 단계에서 특별히 장기간의 배양 시간이 요구되어 신속한 균주개발이 매우 어렵기 때문이다. 본 연구에서는 고체성장배양 시의 이러한 문제점을 극복하고자, 배양 환경의 최적화에 대한 연구를 중점적으로 수행하였다. 본 연구팀은 실제로 원형질체 형성을 통한 균주 개량에 관한 연구를 통해, 고체성장배양에서 훌륭한 성장 특성을 보이는 균주들이 최종 액상 생산배양에서도 단백다당체의 생산성이 높음을 확인한 바 있다 [20].
- Inonotus obliquus 균사체 배양을 위해 사용된 배지는 배양 목적에 따라 고체성장배지 (solid growth medium, SGM), 정치배양배지 (static culture growth medium, SCGM), 액상 성장배양용 성장배지 (liguid growth medium, LGM)와 액상 생산배양용 생산배지 (liguid production medium, LPM)로 구분하였다. 이 배지들의 조성을 기초로 하여 각 배지들에 대한 최적화 연구를 진행하였다. 각 배지의 초기 조성은 다음과 같다:
- 이 방법은 n회 실험으로 (n-1)개 변수까지 선별할 수 있는 방법인데, 4의 배수로 실험을 수행하므로, (4k-1) 성분까지 선별할 수 있도록 하는 실험계획법이다. 본 연구에서는 세포성장에 비교적 크게 영향을 주는 것으로 생각되는 11개의 배지성분을 사용하여 (Table 1), 이 배지성분들의 조합이 Inonotus obliquus 균사체의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 최종적으로 Plackett-Burman design에 의한 실험 결과을 분석하기 위해 Design-Expert 6.
- 이 단계에서 요구되는 특별히 긴 배양 시간 (약 15일 이상)으로 인해, 최종 액상 생산배양에서 각 균주의 단백다당체 생산성을 확인할 때까지 너무 긴 시간이 소모되므로 신속한 균주개발에 큰 어려움이 있는 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구에서는 고체성장배양 시의 이러한 문제점을 극복하고자 고체배양 환경의 최적화를 통해 고효율의 고속균주선별시스템 (high throughput system, HTS)을 확립하고자 하였다.
- 상기 실험에서 MA 고체성장배지를 다른 종류의 배지와 비교했을 때 균사체가 뻗어나가는 속도는 빠른 반면, 균사체의 밀도는 낮은 것으로 관찰되었다. 따라서 다양한 성분들의 첨가를 통해, 빠른 성장과 동시에 균사체의 밀도를 높임으로써 최적의 고체성장배지를 개발하고자 Plackett-Burman design 방법에 의한 통계적 배지최적화 실험을 수행하였다. 이 실험은 각각의 배지성분에 대한 main effect를 분석함으로써 다양한 배지의 조합에서 균체생산성에 큰 영향을 미치는 주요 성분을 찾아내는 방법이다.
- 따라서 다양한 성분들의 첨가를 통해, 빠른 성장과 동시에 균사체의 밀도를 높임으로써 최적의 고체성장배지를 개발하고자 Plackett-Burman design 방법에 의한 통계적 배지최적화 실험을 수행하였다. 이 실험은 각각의 배지성분에 대한 main effect를 분석함으로써 다양한 배지의 조합에서 균체생산성에 큰 영향을 미치는 주요 성분을 찾아내는 방법이다. Plackett-Burman design을 위해 Table 3에 제시한 바와 같이 11가지의 배지조합을 설계하였다.
- 상기의 SAM 실험결과를 바탕으로 해서, 각 배지성분의 최적농도를 통계적으로 더욱 정밀하게 조사하고자 RSM 실험을 계속해서 수행하였다. 이를 위해 4개의 중요한 배지 성분 (glucose, brown rice, soytone peptone, MgSO4)을 이용하여 중심합성계획 (central composite design) (CCD)에 의해 최적화 배양실험을 수행하였다.
- Inonotus obliquus 균사체의 액상배양을 통한 항당뇨 효능의 단백다당체 대량생산 배양공정을 개발하기 위한 첫 단계로 고생산성 균주의 개발을 신속하게 수행하기 위한 방법을 개발하였다. I.
- obliquus는 균사체로 성장할 때 포자를 형성하지 못하므로 단일 세포를 획득하기 위해서는 원형질체들을 회수하여 이로부터 성장 능력과 단백다당체의 생산성이 높은 우량균주를 선별하여야 한다. 본 연구에서는 이러한 균주개량 공정 중 특별히 장기간의 배양 시간이 요구되어 신속한 균주개발 시 가장 큰 장애 요인으로 작용하는 고체성장배양 단계의 문제점을 극복하고자, 고체배양 환경의 최적화에 대한 연구를 중점적으로 수행하였다. 고체성장배양 시 균사체 성장에 효능이 탁월한 배지성분을 선별하기 위해 우선 Plackett-Burman design 실험을 통해서 유의성 높은 배지성분을 찾아내었고, 이에 근거한 부분요인설계법 fractional factorial design, FFD) 실험을 통해 배지성분 상호간의 관계를 분석할 수 있었다.
제안 방법
- 배지멸균은 침전과 갈변현상을 방지하기 위하여 당과 질소원, 무기염류를 분리하여 121℃에서 15분간 수행하였으며, 때에 따라 0.45 (μm)의 filter를 이용하여 멸균을 수행하였다.
- 배지 최적화를 수행할 때 단일 요소에 대해서만 변화를 줄 경우, 영양원 간의 상호작용을 제대로 파악할 수 없으므로 최적 배지조성을 찾기 힘들며, 여러 요소를 전체적으로 조사할 경우 과다한 실험양으로 인한 한계에 직면하게 된다. 이러한 어려움을 해결하기 위해 본 연구에서는 유용대사산물의 생물공학적 대량생산을 위해 주로 사용되는 통계적 배지최적화 방법을 도입하였다[21,22,23]. 즉 고체성장배지의 조성을 최적화하기 위해 균체의 성장속도에 큰 영향을 미치는 주요 배지성분들을 우선 찾아내고, 그 성분들의 교호작용을 확인하기 위한 다양한 통계적 실험방법들을 순차적으로 적용한 후, 최종적으로 반응표면분석법을 적용하여 균사체의 성장속도가 최대가 되는 배지조성을 결정하였다.
- 이러한 어려움을 해결하기 위해 본 연구에서는 유용대사산물의 생물공학적 대량생산을 위해 주로 사용되는 통계적 배지최적화 방법을 도입하였다[21,22,23]. 즉 고체성장배지의 조성을 최적화하기 위해 균체의 성장속도에 큰 영향을 미치는 주요 배지성분들을 우선 찾아내고, 그 성분들의 교호작용을 확인하기 위한 다양한 통계적 실험방법들을 순차적으로 적용한 후, 최종적으로 반응표면분석법을 적용하여 균사체의 성장속도가 최대가 되는 배지조성을 결정하였다.
- Inonotus obliquus strain (KACC 50069)을 모균주로 하여 본 연구를 수행하였다. Inonotus obliquus 균사체 배양을 위해 사용된 배지는 배양 목적에 따라 고체성장배지 (solid growth medium, SGM), 정치배양배지 (static culture growth medium, SCGM), 액상 성장배양용 성장배지 (liguid growth medium, LGM)와 액상 생산배양용 생산배지 (liguid production medium, LPM)로 구분하였다. 이 배지들의 조성을 기초로 하여 각 배지들에 대한 최적화 연구를 진행하였다.
- 본 연구에서는 액상 성장배양 (종배양)의 바로 이전 단계에 정치배양 방법을 추가로 도입하여, 액상 성장배양에서 균사체의 배양형태 (morphology)가 균사 모양으로 유도되도록 하였다 (Fig. 1). 정치배양을 위해 고체 성장배지 (SGM)에서 11~15일 배양한 균사체를 직경 1 cm의 agar-cutting용 cork borer (No.
- Inonotus obliquus로부터 β-D-glucan의 구조를 갖는 세포벽다당체 (IPS)의 정량분석을 위해, 배양한 균사체를 원심분리하여 상등액을 제거한 후 증류수를 이용하여 3번의 세척과정을 수행하였다.
- 1). 정치배양을 위해 고체 성장배지 (SGM)에서 11~15일 배양한 균사체를 직경 1 cm의 agar-cutting용 cork borer (No. 3 size)를 이용하여 7~10개씩 떼어내어 정치배양용 배지 (SCGM)로 무균상태에서 옮겨준 후 28℃에서 7~10일간 배양하였다. 이후 플라스크에서의 액상 성장배양을 위해, 정치배양에서 회수한 균사체를 Waring blender를 이용하여 20초간 균질화 하였다.
- 3 size)를 이용하여 7~10개씩 떼어내어 정치배양용 배지 (SCGM)로 무균상태에서 옮겨준 후 28℃에서 7~10일간 배양하였다. 이후 플라스크에서의 액상 성장배양을 위해, 정치배양에서 회수한 균사체를 Waring blender를 이용하여 20초간 균질화 하였다. 균질화된 생산균주를 500 mL 플라스크 (조업부피: 100 mL)로 30% (v/v)를 접종하였으며 28℃, 150 rpm에서 액상 성장배양을 수행하였다.
- 균질화된 생산균주를 500 mL 플라스크 (조업부피: 100 mL)로 30% (v/v)를 접종하였으며 28℃, 150 rpm에서 액상 성장배양을 수행하였다. 플라스크 액상배양은 성장배지 (LGM) 및 생산배지 (LPM)의 조성을 기본으로 하여 1차 성장배양은 500 mL 플라스크에서 수행했으며, 다음 단계의 배양 (액상 생산배양)을 위해 이로부터 10% (v/v)를 접종하였다. 액상 생산배양은 진탕배양기에서 28℃, 150 rpm으로 7~10일간 배양하였다.
- 액상 생산배양은 진탕배양기에서 28℃, 150 rpm으로 7~10일간 배양하였다. 본 연구에서 사용한 일련의 배양공정 (즉 고체성장배양, 정치배양, 액상 성장배양, 액상 생산배양)에 대한 모식도를 Fig. 1에 제시하였다.
- 상기의 고체성장배지 (SGM)를 계대배양 배지로도 이용하여, 약 8일 마다 계대배양을 수행하였다. SGM에서 배양한 Inonotus obliquus 균사체를 상기에 제시된 바와 동일하게 정치배양을 수행하였다.
- 상기의 고체성장배지 (SGM)를 계대배양 배지로도 이용하여, 약 8일 마다 계대배양을 수행하였다. SGM에서 배양한 Inonotus obliquus 균사체를 상기에 제시된 바와 동일하게 정치배양을 수행하였다. 이로부터 얻은 균사체를 균질화하여 액상 성장배지 (LGM)에서 플라스크 성장배양을 28℃, 150 rpm에서 약 4일간 수행한 후, 20% glycerol stock을 만들어 -80℃에 보관하였다.
- 이로부터 얻은 균사체를 균질화하여 액상 성장배지 (LGM)에서 플라스크 성장배양을 28℃, 150 rpm에서 약 4일간 수행한 후, 20% glycerol stock을 만들어 -80℃에 보관하였다. 이 stock을 필요시 마다 꺼내어 100 mm petridish의 SGM에 접종하여 약 10일 동안 28℃에서 재활성화 (reactivation)시킨 후, Fig. 1에 제시된 일련의 배양공정을 수행하였다.
- 균체농도 측정은 균사체 건조중량 (dry cell weight, DCW)을 이용하였다. 배양액으로부터 균일하게 균사체를 회수한 다음 20 mL의 세포를 4,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다.
- 5 mL tube에 옮겨 남아있는 당의 측정에 사용하였고, 나머지 상등액을 제거한 후 3번의 세척과정을 통해서 남아있는 당, 불용성 물질이나 염류들을 제거하였다. 이 후 weighting dish에 담아 90℃에서 12시간 건조하여 DCW의 무게에 변화가 없는 것을 확인한 후 건조중량을 측정하여 1리터당 세포농도로 환산하여 나타내었다. 경우에 따라서는 회수한 배양액을 paper filter로 washing한 후, 이를 microwave oven을 이용하여 20분간 건조하여 DCW를 측정하였다.
- 이 후 weighting dish에 담아 90℃에서 12시간 건조하여 DCW의 무게에 변화가 없는 것을 확인한 후 건조중량을 측정하여 1리터당 세포농도로 환산하여 나타내었다. 경우에 따라서는 회수한 배양액을 paper filter로 washing한 후, 이를 microwave oven을 이용하여 20분간 건조하여 DCW를 측정하였다.
- 9% 에탄올에서 6시간 동안 침전시켰다. 이를 2,800 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 동결건조한 후, HPLC용 gel chromatography column과 ELSD detector를 이용하여 분석하였다 (Fig. 2).
- 따라서 통계적 방법으로 최적의 배지성분을 결정하기 위해 Plackett-Burman design을 통해 유효 성분들을 조사하였으며, 이 결과를 바탕으로 배지성분들의 중요도를 평가하였다. Plackett-Burman design을 통해 조사하고자 한 배지 성분으로는 (i) 잘 알려진 산업용 배지성분, (ii) 문헌 조사를 통해 생산성에 중요하다고 판단된 성분, (iii) 미량으로 첨가되는 중요 성분 등을 다양하게 포함시켜 연구를 수행하였다. 이 방법은 n회 실험으로 (n-1)개 변수까지 선별할 수 있는 방법인데, 4의 배수로 실험을 수행하므로, (4k-1) 성분까지 선별할 수 있도록 하는 실험계획법이다.
- 본 연구에서는 4가지의 배지성분에 대해 CCD 연구를 수행했으므로, 총 실험횟수는 2k + 2 k + no =24 + (2 × 4) + 6 (여기서 2k는 2수준 요인 실험 갯수, 2 k는 축점의 수, no는 중심점 수)가 되므로 30개의 선정된 조건에서 실험을 수행하였다.
- 이와 같은 2수준 factorial은 각 변수의 주요 효과와 변수간의 상호작용을 결정할 수 있다. 이 접근법은 고정된 X2, X3의 값에서만 결과를 얻게 되는 OFAT (one factor at a time)의 접근방법의 단점을 보완하게 하고, 동시에 X1의 주요 효과를 측정하기 위해 8개의 실험치 모두가 사용되어 자연스러운 반복효과를 갖게 한다. 연구의 초기 단계에서 많은 변수를 실험해서 중요한 인자를 추려내는 선발실험 (screening experiments)에서는 주효과와 1차 교호작용에 대한 정보를 얻는 것이 중요하므로, 실험의 규모를 줄이면서 많은 변수에 대한 정보를 얻을 수 있는 방법이 절실히 요구된다.
- 상기의 FFD의 실험에 의해 선별된 배지성분을 이용해서 각 배지성분의 최적 농도를 선정하기 위한 RSM을 곧바로 실행할 경우, 어떤 농도 범위에서 최적의 농도가 존재하는지를 추정하기가 매우 어려운 문제점이 존재한다. 따라서 Fig. 4에 체계적으로 제시한 바와 같이, 최종적인 RSM 실험을 수행하기 전에 최적 농도가 존재하는 근사치를 추정하기 위해서 SAM을 이용한 배양실험을 먼저 수행하였다.
- 본 연구에서는 4가지의 배지성분에 대해 CCD 연구를 수행했으므로, 총 실험횟수는 2k + 2 k + no =24 + (2 × 4) + 6 (여기서 2k는 2수준 요인 실험 갯수, 2 k는 축점의 수, no는 중심점 수)가 되므로 30개의 선정된 조건에서 실험을 수행하였다. 일반적으로 CCD에서는 실험오차를 추정하기 위하여 중심점 (원점)에서 실험을 수행하는데, 이 때 중심점 (no)의 갯수는 제한이 없으며, 본 연구에서는 6개의 중심점 실험을 수행하였다. 각각의 배지 성분의 농도 변화에 따른 균사체 성장환의 직경 (반응표면)이 곡선으로 나타날 것으로 예상되어, 아래와 같은 2차 다항식을 적용시켰다.
- 일반적으로 CCD에서는 실험오차를 추정하기 위하여 중심점 (원점)에서 실험을 수행하는데, 이 때 중심점 (no)의 갯수는 제한이 없으며, 본 연구에서는 6개의 중심점 실험을 수행하였다. 각각의 배지 성분의 농도 변화에 따른 균사체 성장환의 직경 (반응표면)이 곡선으로 나타날 것으로 예상되어, 아래와 같은 2차 다항식을 적용시켰다.
- 05 보다 작을 때 그 유의성이 인정된다고 간주하였다. 최적 배지농도는 2차다항식의 f 값인 균사체성장환의 직경이 최대로 되는 지점을 3차원 반응표면도와 contour plot을 이용하여 결정하였다.
- Inonotus obliquus의 고체성장배지 조사를 위한 기본 실험으로 Table 2에 제시된 바와 같이 기존에 자주 사용되는 MYA, MGA, PDYA, MA, PDA의 다섯 가지 배지조성을 만들어 plant culture용 petri-dish에 20 mL를 무균적으로 부은 후, 15일 동안 최적의 온도로 밝혀진 28℃에서 배양하였다. 배양 후 균사체 성장환의 직경을 측정한 결과 (Fig.
- 이는 배지 표면의 corn oil로 인해 생산균주의 영양분의 흡수가 저해되었기 때문인 것으로 판단된다. 따라서 corn oil을 dummy variable로 교체하여 2차 Plackett-Burman design 실험을 수행하였다 (Table 4). 그 결과 기존의 MA 배지에서는 균사성장 직경이 71 mm이었으나, 5번 배지조합의 경우에서 균사의 성장속도가 약 23% 증가 (균사성장 직경 92 mm)하는 주목할 만한 결과를 얻을 수 있었다 (Table 5(A)) (Fig.
- 상기의 Plackett-Burman design은 배지성분 각자가 기여하는 정도를 보여주는데 반해, factorial design에 의한 실험에서는 두 가지 배지성분의 상호 영향까지도 분석할 수 있다. 따라서 이번에는 배지성분들의 교호작용을 조사하기 위해 Table 7에 제시된 factorial design 조합법으로 고체성장배지에 대한 성분 조사를 계속 수행하였다. Factorial design의 경우 2n개의 실험조합이 필요하지만 factor들이 많아질 경우에는 통계학적 방법에 의해 2n-1개의 실험을 수행할 수도 있다.
- Factorial design의 경우 2n개의 실험조합이 필요하지만 factor들이 많아질 경우에는 통계학적 방법에 의해 2n-1개의 실험을 수행할 수도 있다. 따라서 5개의 factor에 의해서 25-1개의 조합인 16가지의 배지조합과, 실험의 오차를 줄이기 위해 중점으로 구성된 두 개의 배지조합을 추가해서 fractional factorial design (FFD) 실험을 수행하였다. 18개 배지조합의 FFD 실험을 위한 배지성분으로는 기존의 Plackett-Burman design 실험에 의해 기여도가 높다고 분석된 5가지 배지성분 (즉 glucose, brown rice, yeast extract, soytone peptone, MgSO4)을 이용하였다.
- 배지성분 상호간의 영향을 조사한 상기의 FFD 실험결과에 근거해서 추정한 SAM의 실험설계값을 Table 9에 제시하였다. 통계 소프트웨어가 계산한 new step이 상당히 큰 값으로 제시되어 있으므로, 만일 이 값대로 실험을 수행한다면 소수의 실험밖에 수행할 수 없으므로, 이 new step 값들을 1/10로 축소 (이 경우에도 steepest ascent로의 방향은 일치함)시킨 배지조합으로 배지농도 최적화 실험을 수행하였다. 그 결과 new step의 방향으로 균사의 성장이 지속적으로 증가되고 있는 것으로 나타났다 (Table 10) (Fig.
- 12. Increase in mycelial growth diameter according to the optimization of the solid growth medium by the steepest ascent method (SAM) and fractional factorial design (FFD) (15 days cultivation on each of the solid growth medium).
- 상기의 SAM 실험결과를 바탕으로 해서, 각 배지성분의 최적농도를 통계적으로 더욱 정밀하게 조사하고자 RSM 실험을 계속해서 수행하였다. 이를 위해 4개의 중요한 배지 성분 (glucose, brown rice, soytone peptone, MgSO4)을 이용하여 중심합성계획 (central composite design) (CCD)에 의해 최적화 배양실험을 수행하였다. CCD 실험의 중점(glucose 24 g/L, brown rice 12 g/L, soytone peptone 12 g/L, MgSO4 5 g/L)과 각 요인들의 수준을 Table 11에 제시하였다.
- 본 연구에서는 이러한 균주개량 공정 중 특별히 장기간의 배양 시간이 요구되어 신속한 균주개발 시 가장 큰 장애 요인으로 작용하는 고체성장배양 단계의 문제점을 극복하고자, 고체배양 환경의 최적화에 대한 연구를 중점적으로 수행하였다. 고체성장배양 시 균사체 성장에 효능이 탁월한 배지성분을 선별하기 위해 우선 Plackett-Burman design 실험을 통해서 유의성 높은 배지성분을 찾아내었고, 이에 근거한 부분요인설계법 fractional factorial design, FFD) 실험을 통해 배지성분 상호간의 관계를 분석할 수 있었다. 또한 이 FFD 실험결과에 근거해서 설계한 최급상승법 (steepest ascent method, SAM) 실험방법을 적용한 결과, 고체성장배양 시 균사체 성장환의 직경이 기존의 MA 배지와 비교해서 약 41% 증가했을 뿐만 아니라 균사체의 밀도도 크게 향상된 배지조성을 확립할 수 있었다.
대상 데이터
- Inonotus obliquus strain (KACC 50069)을 모균주로 하여 본 연구를 수행하였다. Inonotus obliquus 균사체 배양을 위해 사용된 배지는 배양 목적에 따라 고체성장배지 (solid growth medium, SGM), 정치배양배지 (static culture growth medium, SCGM), 액상 성장배양용 성장배지 (liguid growth medium, LGM)와 액상 생산배양용 생산배지 (liguid production medium, LPM)로 구분하였다.
- 따라서 5개의 factor에 의해서 25-1개의 조합인 16가지의 배지조합과, 실험의 오차를 줄이기 위해 중점으로 구성된 두 개의 배지조합을 추가해서 fractional factorial design (FFD) 실험을 수행하였다. 18개 배지조합의 FFD 실험을 위한 배지성분으로는 기존의 Plackett-Burman design 실험에 의해 기여도가 높다고 분석된 5가지 배지성분 (즉 glucose, brown rice, yeast extract, soytone peptone, MgSO4)을 이용하였다.
데이터처리
- 많은 배지성분들 중에서 중요한 성분을 선별해 내는 초반의 실험에서는 가능한 한 실험의 규모를 줄이면서 많은 성분들에 대한 정보를 얻을 수 있는 방법이 절실히 요구된다. 따라서 통계적 방법으로 최적의 배지성분을 결정하기 위해 Plackett-Burman design을 통해 유효 성분들을 조사하였으며, 이 결과를 바탕으로 배지성분들의 중요도를 평가하였다. Plackett-Burman design을 통해 조사하고자 한 배지 성분으로는 (i) 잘 알려진 산업용 배지성분, (ii) 문헌 조사를 통해 생산성에 중요하다고 판단된 성분, (iii) 미량으로 첨가되는 중요 성분 등을 다양하게 포함시켜 연구를 수행하였다.
- 본 연구에서는 세포성장에 비교적 크게 영향을 주는 것으로 생각되는 11개의 배지성분을 사용하여 (Table 1), 이 배지성분들의 조합이 Inonotus obliquus 균사체의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 최종적으로 Plackett-Burman design에 의한 실험 결과을 분석하기 위해 Design-Expert 6.0 program을 사용하였다.
- 그 후 선별된 배지성분의 최적 농도를 최종적으로 결정하기 위해 배지성분 각각의 농도 변화가 균체생산성에 미치는 영향을 RSM을 이용하여 통계적으로 분석하였다. 이를 위한 실험계획법으로 가장 널리 활용되는 계획법인 Box & Wilson의 중심합성계획법 (central composite design, CCD)(Fig.
- 은 회귀계수이다. CCD에 의거해 얻은 배양결과를 Design-Expert 6.0 program을 이용하여 통계적으로 분석하여 회귀 방정식을 얻음으로써 각각의 배지성분들에 대한 상호 영향을 분석하였다. 이 때 전체 model에 대한 유의성은 ANOVA 분석 시 주어지는 P값에 의해 결정되며, P값이 0.
- 이 결과를 이차다항식의 형태로 표현하였으며, 각 항에 대한 계수를 회귀분석방법으로 결정하기 위해 Design-Expert 6.0 program을 사용하였다. 그 결과 균사체 성장환의 직경에 대한 최종 모델식을 다음과 같이 표현할 수 있었다.
- 또한 이 FFD 실험결과에 근거해서 설계한 최급상승법 (steepest ascent method, SAM) 실험방법을 적용한 결과, 고체성장배양 시 균사체 성장환의 직경이 기존의 MA 배지와 비교해서 약 41% 증가했을 뿐만 아니라 균사체의 밀도도 크게 향상된 배지조성을 확립할 수 있었다. 또한 SAM 연구결과를 바탕으로 최적의 배지조성을 확립하고자 각 배지성분의 최적농도를 통계적으로 더욱 정밀하게 조사하는 반응표면분석법 (response surface method, RSM) 실험을 수행하였다. 그 결과 최적 고체성장배지의 성분과 농도는 glucose 25.
이론/모형
- 이를 위한 실험계획법으로 가장 널리 활용되는 계획법인 Box & Wilson의 중심합성계획법 (central composite design, CCD)(Fig. 5)를 이용하였다 [20,21].
- 연구의 초기 단계에서 많은 변수를 실험해서 중요한 인자를 추려내는 선발실험 (screening experiments)에서는 주효과와 1차 교호작용에 대한 정보를 얻는 것이 중요하므로, 실험의 규모를 줄이면서 많은 변수에 대한 정보를 얻을 수 있는 방법이 절실히 요구된다. 따라서 2m요인 실험 갯수의 1/2인 2m-1, 1/4인 2m-2, 1/8인 2m-3 반복만을 실험하는 소위 부분 요인설계법 (fractional factorial design, FFD)을 본 연구에서도 적용하였다.
- 최적화된 배양배지를 확립하기 위해 배지성분 각각의 농도 변화가 배양결과 (균체생산성)에 미치는 영향을 최급 상승법 (steepest ascent method, SAM)과 반응표면분석법(response surface method, RSM)을 이용하여 분석하였다. 상기의 FFD의 실험에 의해 선별된 배지성분을 이용해서 각 배지성분의 최적 농도를 선정하기 위한 RSM을 곧바로 실행할 경우, 어떤 농도 범위에서 최적의 농도가 존재하는지를 추정하기가 매우 어려운 문제점이 존재한다.
- 가 균사 성장에 있어서 가장 긍정적인 영향를 미치고 있으며, yeast extract의 경우에는 오히려 농도가 낮아지는 방향에서 긍적적인 효과가 있음을 추정할 수 있었다. 따라서 이 배지성분과 기여도를 이용해서, 고체배양 배지성분들의 최적 농도 지점을 대략적으로 결정하기 위해 우선 최급상승법 (steepest ascent method, SAM) 실험을 수행하였다. 즉 SAM 실험 결과에 의해 추정된 각 배지성분의 농도 근처에서 최적의 배지성분 농도가 존재하리라고 판단하였다.
- 10. Experimental results performed according to the design of the steepest ascent method (SAM) (15 days of cultivation on the solid growth medium).
성능/효과
- 본 연구에서는 고체성장배양 시의 이러한 문제점을 극복하고자, 배양 환경의 최적화에 대한 연구를 중점적으로 수행하였다. 본 연구팀은 실제로 원형질체 형성을 통한 균주 개량에 관한 연구를 통해, 고체성장배양에서 훌륭한 성장 특성을 보이는 균주들이 최종 액상 생산배양에서도 단백다당체의 생산성이 높음을 확인한 바 있다 [20].
- 1에 체계적으로 제시한 바 있다. 즉 liquid stock, 고체 성장배지에서의 성장배양, 정치배양, 액상 플라스크 성장배양을 거쳐 최종적으로 액상 생산 배양을 수행하여야 단백다당체 생산성이 높은 배양형태가 유도되며, 배양 생리적 특성도 우수한 것으로 확인되었다(데이타 미제시). 이 일련의 공정에서 특히 주목해야 할 과정은 균주개발 시 가장 큰 장애요인으로 작용하는 고체 성장 배지에서의 배양 단계이다.
- 이 일련의 공정에서 특히 주목해야 할 과정은 균주개발 시 가장 큰 장애요인으로 작용하는 고체 성장 배지에서의 배양 단계이다. 이 단계에서 요구되는 특별히 긴 배양 시간 (약 15일 이상)으로 인해, 최종 액상 생산배양에서 각 균주의 단백다당체 생산성을 확인할 때까지 너무 긴 시간이 소모되므로 신속한 균주개발에 큰 어려움이 있는 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구에서는 고체성장배양 시의 이러한 문제점을 극복하고자 고체배양 환경의 최적화를 통해 고효율의 고속균주선별시스템 (high throughput system, HTS)을 확립하고자 하였다.
- Inonotus obliquus의 고체성장배지 조사를 위한 기본 실험으로 Table 2에 제시된 바와 같이 기존에 자주 사용되는 MYA, MGA, PDYA, MA, PDA의 다섯 가지 배지조성을 만들어 plant culture용 petri-dish에 20 mL를 무균적으로 부은 후, 15일 동안 최적의 온도로 밝혀진 28℃에서 배양하였다. 배양 후 균사체 성장환의 직경을 측정한 결과 (Fig. 6), malt extract가 첨가된 MA 배지에서 비교적 높은 성장속도를 보이며, MYA에서는 MA에서 보다 균사의 성장이 다소 늦은 것으로 관찰되었다. 본 실험에서 주목할 점은 생산균주의 고체배양을 위해 기존의 다양한 배지를 사용했음에도 불구하고, 이들이 왕성하게 자라지 않았다는 점이다.
- 본 실험에서 주목할 점은 생산균주의 고체배양을 위해 기존의 다양한 배지를 사용했음에도 불구하고, 이들이 왕성하게 자라지 않았다는 점이다. 따라서 고생산성 균주개발을 통한 배양공정 연구가 신속히 진행되기 위해서는 우선적으로 Inonotus obliquus의 고체성장배양 시, 최적의 고체배지 조성이 결정되어야 함을 확인할 수 있었다.
- 상기 실험에서 MA 고체성장배지를 다른 종류의 배지와 비교했을 때 균사체가 뻗어나가는 속도는 빠른 반면, 균사체의 밀도는 낮은 것으로 관찰되었다. 따라서 다양한 성분들의 첨가를 통해, 빠른 성장과 동시에 균사체의 밀도를 높임으로써 최적의 고체성장배지를 개발하고자 Plackett-Burman design 방법에 의한 통계적 배지최적화 실험을 수행하였다.
- 1차 Plackett-Burman design 실험을 수행한 결과, 배지 조합 중에 corn oil이 첨가된 경우 균사의 성장이 심각히 저해되는 현상이 관찰되었다. 이는 배지 표면의 corn oil로 인해 생산균주의 영양분의 흡수가 저해되었기 때문인 것으로 판단된다.
- 각 배지의 기여도를 일차다항식으로 분석한 결과를 Table 5(B)에, 또한 이 배양에 대한 ANOVA 분석결과를 Table 6에 제시하였다. 균사체의 성장에 있어서 MgSO4 (32% 기여도)가 가장 큰 영향을 미치고, glucose (27% 기여도)와 brown rice (20% 기여도)도 균사 성장에 심각한 영향을 주는 것으로 분석되었다 (Table 6). Fig.
- 15일 동안 배양한 FFD 실험 결과에 대한 통계학적 분석을 통해 다섯 가지의 성분이 균사체의 성장 (고체배지에서의 성장환의 직경)에 미치는 영향을 1차 다항식으로 표현할 수 있었다.
- 이 식과 ANOVA 분석 결과 (Table 8)로부터, MgSO4가 균사 성장에 있어서 가장 긍정적인 영향를 미치고 있으며, yeast extract의 경우에는 오히려 농도가 낮아지는 방향에서 긍적적인 효과가 있음을 추정할 수 있었다. 따라서 이 배지성분과 기여도를 이용해서, 고체배양 배지성분들의 최적 농도 지점을 대략적으로 결정하기 위해 우선 최급상승법 (steepest ascent method, SAM) 실험을 수행하였다.
- 따라서 이 배지성분과 기여도를 이용해서, 고체배양 배지성분들의 최적 농도 지점을 대략적으로 결정하기 위해 우선 최급상승법 (steepest ascent method, SAM) 실험을 수행하였다. 즉 SAM 실험 결과에 의해 추정된 각 배지성분의 농도 근처에서 최적의 배지성분 농도가 존재하리라고 판단하였다.
- 통계 소프트웨어가 계산한 new step이 상당히 큰 값으로 제시되어 있으므로, 만일 이 값대로 실험을 수행한다면 소수의 실험밖에 수행할 수 없으므로, 이 new step 값들을 1/10로 축소 (이 경우에도 steepest ascent로의 방향은 일치함)시킨 배지조합으로 배지농도 최적화 실험을 수행하였다. 그 결과 new step의 방향으로 균사의 성장이 지속적으로 증가되고 있는 것으로 나타났다 (Table 10) (Fig. 10). 이번 실험에서는 15일 동안 고체 성장배양을 수행하였는데, 그 결과 초반에 사용했던 MA 배지의 경우에서는 약 50 mm (직경)까지 균사체가 성장한 반면, SAM으로 설계된 15번의 배지조합에서는 약 86 mm (직경)까지 균사체 성장이 증가했을 뿐만 아니라 고체성장배지 상에서 균사체의 밀도도 크게 향상되는 주목할 만한 결과를 얻을 수 있었다 (Fig.
- 10). 이번 실험에서는 15일 동안 고체 성장배양을 수행하였는데, 그 결과 초반에 사용했던 MA 배지의 경우에서는 약 50 mm (직경)까지 균사체가 성장한 반면, SAM으로 설계된 15번의 배지조합에서는 약 86 mm (직경)까지 균사체 성장이 증가했을 뿐만 아니라 고체성장배지 상에서 균사체의 밀도도 크게 향상되는 주목할 만한 결과를 얻을 수 있었다 (Fig. 11).
- 고체성장배지에서 지금까지 수행한 배지성분 농도의 최적화 실험결과를 요약하면, FFD 실험을 통해서 균사체 성장환의 직경이 기존의 MA 배지 대비 약 23% 정도 증가하였고, 또한 SAM 실험방법을 적용함으로써 기존의 MA 배지 대비 약 41% 더 증가한 배지성분의 조합과 농도를 결정할 수 있었다 (Fig. 12).
- 또한 CCD 설계법을 적용한 총 30가지의 실험조합(2 수준 요인 실험 갯수 24개, 축점 8개, 중심점 6개)을 Table 12에 제시하였다. 탄소원으로 사용한 glucose (A)와 brown rice (B)의 농도는 각각 16~32 g/L과 8~16 g/L, 질소 원인 soytone peptone (C)은 8~16 g/L, MgSO4 (D)는 3~8 g/L까지 변화시켜 가며 다양한 배지조합에서 실험한 결과 (RSM 실험에서는 균사체의 성장속도가 높아서 13일 동안 배양함), 고체 성장배지에서의 균사체의 직경이 70~83 mm 범위의 값을 보여주는 것으로 나타났다 (Table 12).
- 또한 Table 13에 본 실험결과에 대한 ANOVA 분석표를 제시하였다. ANOVA 분석의 p-value인 0.0224가 제시하는 바와 같이 본 실험 결과는 매우 유의성이 있는 것으로 확인되었다. 특히 A2의 p-value, 0.
- 0224가 제시하는 바와 같이 본 실험 결과는 매우 유의성이 있는 것으로 확인되었다. 특히 A2의 p-value, 0.0015, C2의 p-value, 0.0015, D2의 p-value, 0.0136에서 이들의 성분 및 농도가 균사체의 성장에 매우 크게 기여하고 있음을 확인할 수 있었다.
- 13에 반응표면도와 contour plot을 이용해서 각 배지 성분들의 농도에 따른 균사체의 성장정도 (직경)를 나타내었다. 각 배지조합에 관계없이 최대 생산치를 주는 stationary point가 존재하는 것으로 확인되었다. 궁극적으로 본 연구를 통해 통계적으로 결정된 최적 고체성장배지의 성분과 농도는 glucose 25.
- 각 배지조합에 관계없이 최대 생산치를 주는 stationary point가 존재하는 것으로 확인되었다. 궁극적으로 본 연구를 통해 통계적으로 결정된 최적 고체성장배지의 성분과 농도는 glucose 25.61 g/L, brown rice 12.53 g/L, soytone peptone 12.53 g/L, MgSO4 5.53 g/L, agar 20 g/L인 것으로 확인되었다. 또한 이 고체성장배지 조성에서 13일 동안 배양할 경우, 균사체의 직경은 약 83 mm 정도인 것으로 예상되었는데, 이 결과는 SAM 연구에서 배지조합 14번(RUN 14) 및 배지조합 15번 (RUN 15번)의 농도 주변임을 알 수 있었다.
- 또한 이 고체성장배지 조성에서 13일 동안 배양할 경우, 균사체의 직경은 약 83 mm 정도인 것으로 예상되었는데, 이 결과는 SAM 연구에서 배지조합 14번(RUN 14) 및 배지조합 15번 (RUN 15번)의 농도 주변임을 알 수 있었다. 이로부터 최종적인 RSM 실험을 수행하기 전에 최적농도의 근사치를 추정하기 위해서 수행한 SAM 실험이 매우 효율적이었음을 확인할 수 있었다.
- 궁극적으로는 이와 같이 일련의 통계적 방법을 적용한 배지 최적화 결과, 고체성장배양에서 Inonotus obliquus 균사체의 성장속도의 증가로 인해 배양기간을 기존의 15~20일에서 8일 정도로 획기적으로 줄일 수 있게 되어, 짧은 시간 내에 대규모 균주 선별과 각 균주의 생산성 확인이 가능하게 되었다.
- 고체성장배양 시 균사체 성장에 효능이 탁월한 배지성분을 선별하기 위해 우선 Plackett-Burman design 실험을 통해서 유의성 높은 배지성분을 찾아내었고, 이에 근거한 부분요인설계법 fractional factorial design, FFD) 실험을 통해 배지성분 상호간의 관계를 분석할 수 있었다. 또한 이 FFD 실험결과에 근거해서 설계한 최급상승법 (steepest ascent method, SAM) 실험방법을 적용한 결과, 고체성장배양 시 균사체 성장환의 직경이 기존의 MA 배지와 비교해서 약 41% 증가했을 뿐만 아니라 균사체의 밀도도 크게 향상된 배지조성을 확립할 수 있었다. 또한 SAM 연구결과를 바탕으로 최적의 배지조성을 확립하고자 각 배지성분의 최적농도를 통계적으로 더욱 정밀하게 조사하는 반응표면분석법 (response surface method, RSM) 실험을 수행하였다.
- 또한 SAM 연구결과를 바탕으로 최적의 배지조성을 확립하고자 각 배지성분의 최적농도를 통계적으로 더욱 정밀하게 조사하는 반응표면분석법 (response surface method, RSM) 실험을 수행하였다. 그 결과 최적 고체성장배지의 성분과 농도는 glucose 25.61 g/L, brown rice 12.53 g/L, soytone peptone 12.53 g/L, MgSO4 5.53 g/L, agar 20 g/L인 것으로 최종 결정되었으며, 이 조건에서 13일 동안 배양시 균사체의 직경이 약 82 mm 정도에 이르는 것으로 나타났다. 이 결과는 상기의 SAM 실험에서 최적농도로 제시한 배지조성과 매우 유사한 것으로 확인되었는데, 이로부터 최종적인 RSM 실험을 수행하기 전에 최적 농도의 근사치를 추정하기 위해서 수행한 SAM 실험이 매우 효율적이었음을 확인할 수 있었다.
- 53 g/L, agar 20 g/L인 것으로 최종 결정되었으며, 이 조건에서 13일 동안 배양시 균사체의 직경이 약 82 mm 정도에 이르는 것으로 나타났다. 이 결과는 상기의 SAM 실험에서 최적농도로 제시한 배지조성과 매우 유사한 것으로 확인되었는데, 이로부터 최종적인 RSM 실험을 수행하기 전에 최적 농도의 근사치를 추정하기 위해서 수행한 SAM 실험이 매우 효율적이었음을 확인할 수 있었다. 또한 배지 최적화 결과 고체성장배양에서의 성장속도의 증가로 인해 배양기간을 기존의 15~20일에서 8일로 획기적으로 줄일 수 있게 되어, 짧은 시간 내에 대규모 균주 선별과 각 균주의 단백다당체의 생산성 확인이 가능하게 되었다.
- 이 결과는 상기의 SAM 실험에서 최적농도로 제시한 배지조성과 매우 유사한 것으로 확인되었는데, 이로부터 최종적인 RSM 실험을 수행하기 전에 최적 농도의 근사치를 추정하기 위해서 수행한 SAM 실험이 매우 효율적이었음을 확인할 수 있었다. 또한 배지 최적화 결과 고체성장배양에서의 성장속도의 증가로 인해 배양기간을 기존의 15~20일에서 8일로 획기적으로 줄일 수 있게 되어, 짧은 시간 내에 대규모 균주 선별과 각 균주의 단백다당체의 생산성 확인이 가능하게 되었다.
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