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문제 정의
- SH21B는 황금(Scutellaria baicalensis Georgi), 행인(Prunus armeniaca Maxim), 마황(Ephedra sinica Stapf), 석창포(Acorus gramineus Soland), 포황(Typha orientalis Presl), 원지(Polygala tenuifolia Willd), 하엽(Nelumbo nucifera Gaertner)의 혼합(비율 3:3:3:3:3:2:2)으로 이루어진 생약복합물로 최근 본 연구진에 의해 이루어진 선행연구의 결과 3T3-L1세포 및 고지방식이 마우스 동물모델에서 adipogenesis 억제를 통한 지방축적 억제효과가 있음이 규명되었다[11]. 본 연구에서는 3T3-L1 지방세포에서 SH21B가 미치는 adipogenesis 억제에 대한 보다 상세한 분자적 메커니즘을 규명하기 위하여 adipogenesis를 조절하는 다양한 유전자의 발현을 시간의 흐름에 따라 분석하였다.
제안 방법
- 1 μg의 total RNA는 cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA)를 이용하여 역전사 하였다.
- 2일 후(day 0), 10% fetal bovine serum (FBS)을 포함한 DMEM에 1 μg/ml insulin, 0.25μM dexamethasone 그리고 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine이 첨가된 differentiation-induction medium (분화 유도 배지)로 교체하여 48시간 처리하였다.
- 그 후 2일 간격으로 10% FBS를 포함한 새 배지에 1 μg/ml insulin이 첨가된 differentiation-maintenance medium (분화 유지 배지)로 교체되었다. Adipogenesis의 진행과정에서SH21B의 효능을 확인하기 위해, 분화 유도 배지와 분화 유지 배지를 첨가할 때 SH21B를 함께 처리하였다.
- , Foster City, CA, USA)를 이용하여 역전사 하였다. Real-time PCR은 7000 Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) 장비를 사용하여 진행되었다. PCR은 다음의 조성으로 최종 반응 부피를 20 μl로 준비하여 3반복 하였다: TaqMan gene expression master mix, 250 nM TaqMan Probe, 2 μM의 각 primer, 2μl의 cDNA.
- 원재료가 되는 생약은 성일바이오엑스(Hwasung, Korea)에서 구입하였다. 황금, 행인, 마황, 석창포, 포황, 원지, 하엽의7가지 생약을 3:3:3:3:3:2:2의 비율로 혼합하여 30% 에탄올에서 3시간씩 2회 추출한 후, 에탄올과 동일한 부피의 부탄올을 가하여 2시간 동안 추출한 다음 부탄올 층을 따로 분획하였다. 이후 부탄올 분획물을 증발농축기를 이용하여 용매를 증발시키고 분말상태인 SH21B엑스를 얻었다.
대상 데이터
- 적정 조성으로 혼합된 반응물질은 효소를 활성화시키기 위해 95℃에서 10분간 반응시킨 후, 95℃에서 15초와 60℃에서 1분으로 구성된 40 cycle을 진행하였다. Real-Time PCR에 사용된 primer는 Applied Biosystems 사의 assay on demand gene expression 제품을 구매하여 사용하였다(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA). Endogenous control는 Gustafson과 Smith를 참고로 18S rRNA를 사용하였다[6].
- 실험에 사용된 3T3-L1 세포(preadipocyte)는 ATCC(American type culture collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 10% calf serum, 100 μg/mL streptomycin, and 100 units/mL penicillin 과 함께 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양하였다.
- SH21B의 제조 및 표준화 과정은 선행 연구논문에서 상세하게 제시되었으며 이를 요약하면 다음과 같다[11]. 원재료가 되는 생약은 성일바이오엑스(Hwasung, Korea)에서 구입하였다. 황금, 행인, 마황, 석창포, 포황, 원지, 하엽의7가지 생약을 3:3:3:3:3:2:2의 비율로 혼합하여 30% 에탄올에서 3시간씩 2회 추출한 후, 에탄올과 동일한 부피의 부탄올을 가하여 2시간 동안 추출한 다음 부탄올 층을 따로 분획하였다.
데이터처리
- )로 나타냈다. SH21B가 첨가된 군과 첨가되지 않은 군, 두 군 사이의 비교에 대한 통계의 유의성은 unpaired t-test에 의해 검증되었다.
- 모든 실험결과는 SPSS ver. 14.0 프로그램(SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균(mean)±표준오차(S.E.)로 나타냈다.
이론/모형
- , Foster City, CA, USA). Endogenous control는 Gustafson과 Smith를 참고로 18S rRNA를 사용하였다[6]. 각 샘플에 대한 표적유전자의mRNA 수준은 동일한 샘플 내의 18S rRNA에 의해 표준화되었고, 표준화 된 샘플들의 값은 전지방세포(day 0)의 값을 기준으로 Ct method에 의해 비교되었다[13].
- Total RNA는 acid-phenol 추출법을 이용한 RNeasy kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제시된 편람에 따라 분리 정제되었다. 추출된 total RNA는 분광광도계를 이용하여 optical density (OD)값을 측정하고 역전사(reverse transcription) 반응을 진행할 때까지 -80℃에 보관하였다.
- Endogenous control는 Gustafson과 Smith를 참고로 18S rRNA를 사용하였다[6]. 각 샘플에 대한 표적유전자의mRNA 수준은 동일한 샘플 내의 18S rRNA에 의해 표준화되었고, 표준화 된 샘플들의 값은 전지방세포(day 0)의 값을 기준으로 Ct method에 의해 비교되었다[13].
성능/효과
- 본 연구를 통해 SH21B에 의한 지방세포형성 억제효능 및 adipogenesis를 조절하는 인자들의 mRNA 발현 변화를 확인할 수 있었다. SH21B의 지방세포형성 억제효능은 Krox20, KLF15와 같은 지방세포형성 유도조절자와 KLF2, CHOP과 같은 지방세포형성 억제조절자의 mRNA 발현을 조절함으로써 나타났다. SH21B에 의해 변화된 다양한 상위조절자들의 mRNA 발현은 서로 상호작용하여 결국, 지방세포형성의 핵심 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα의 mRNA 발현을 억제하고 이를 통해 지방세포형성의 최종마커인 ADIPOQ나 GLUT4의 mRNA 발현을 감소시켰다.
- 9%였다(w/w). SH21B의 추출 후, thin layer chromatography를 사용하여 7종류의 생약 물질의 성분을 조사하고 high performance liquid chromatography 를 사용하여 구성 물질의 양을 측정한 결과, 11.4%와 4.2%를 각각 차지하는 바이칼린(baicalin)과 아미그달린(amygdalin)이 SH21B의 주요 성분으로 분석되었다.
- SH21B에 의해 변화된 다양한 상위조절자들의 mRNA 발현은 서로 상호작용하여 결국, 지방세포형성의 핵심 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα의 mRNA 발현을 억제하고 이를 통해 지방세포형성의 최종마커인 ADIPOQ나 GLUT4의 mRNA 발현을 감소시켰다. 결론적으로, SH21B에 의한 지방세포형성 억제효능은 핵심전사인자를 포함한 다양한 지방세포형성 조절자의 mRNA 발현이 복합적으로 조절되면서 나타나는 것으로 사료된다.
- 본 연구를 통해 SH21B에 의한 지방세포형성 억제효능 및 adipogenesis를 조절하는 인자들의 mRNA 발현 변화를 확인할 수 있었다. SH21B의 지방세포형성 억제효능은 Krox20, KLF15와 같은 지방세포형성 유도조절자와 KLF2, CHOP과 같은 지방세포형성 억제조절자의 mRNA 발현을 조절함으로써 나타났다.
- 또 다른 지방세포형성 억제조절자인 CHOP은 C/EBPβ단백질과 이질이합체(heterodimer)를 형성함으로써 그 활성을 억제한다고 알려져 있다[3]. 본 연구에서 CHOP의 mRNA 발현은 분화 초기(2일)에 크게 감소되었다가 SH21B의 첨가에 의해 유의하게 증가되었다(Fig. 4B). CHOP의 기능은 C/EBPβ발현 보다는 그 활성을 조절하는 것이기 때문에, SH21B에 의한 CHOP의 mRNA 발현 증가 결과는 SH21B에 의해 변화가 없던 C/EBPβ의 결과(Fig.
- PPARγ의 상위 조절자인 KLF5와 KLF15는 각각 초기, 후기 분화에서 PPARγ의 promoter에 결합하여 전사를 조절한다[5,19]. 본 연구에서 KLF15의 mRNA 발현은 adipogenesis 과정 중에 후기까지 크게 증가하지만 SH21B의 처리에 의해 유의적으로 억제되었다(Fig. 3C). 이와는 달리 KLF5의 mRNA 발현은 SH21B에 의해 영향을 받지 않았다(Fig.
- KLF2는 지방세포가 분화되기 전에 높게 발현되어 있다가 분화가 시작되면서 급격하게 감소된다[1]. 본 연구에서 KLF2의 유전자 발현은 분화가 진행되면서 감소하였다가 SH21B의 첨가에 의해 4일째부터 유의하게 증가되었다(Fig. 4A). 또 다른 지방세포형성 억제조절자인 CHOP은 C/EBPβ단백질과 이질이합체(heterodimer)를 형성함으로써 그 활성을 억제한다고 알려져 있다[3].
- 또한 Krox20은 C/EBPβ의 발현을 증가시킴으로써 adipogenesis을 조절함과 동시에 C/EBPβ와 비의존적으로 adipogenesis을 조절한다고 보고하고 있다[2]. 본 연구에서 Krox20의 mRNA 발현은 adipogenesis 과정 중에 뚜렷하게 증가하지만SH21B에 의해 유의하게 억제되었다(Fig. 3B). 그림 3A에서 C/EBPβ의 mRNA 발현이 SH21B에 의해 변화가 없었기 때문에, SH21B 첨가에 의한 Krox20의 mRNA 변화는 C/EBPβ와는 비의존적으로 지방세포형성에 관여한다고 생각되어진다.
- 본 연구의 real-time PCR 결과에서, PPARγ의 mRNA 발현은 분화 전과 비교하여 분화 후에서 10배 이상 증가하였다가 SH21B의 첨가에 의해 유의하게 감소되었다(Fig. 2A).
- 이러한 결과들은 SH21B가 adipogenesis의 두 핵심 조절자인, C/EBPα와 PPARγ의 발현을 억제함으로써 최종마커의 발현을 감소시키고 중성지방의 축적을 저해함을 제시한다.
- 지방세포형성의 최종마커인 SLC2A4 역시 분화 전과 비교하여 분화 후에서 mRNA 발현이 20배 이상 크게 증가하였다가 SH21B에 의해 유의하게 감소되었다. 이러한 결과들은 SH21B가 지방세포형성을 억제함으로써 중성지방의 축적 및 최종마커의 mRNA 발현을 저해함을 제시한다.
- 이러한 결과들은 SH21B의 지방세포형성 억제효과가 여러 지방세포형성 유도유전자 중 Krox20과 KLF15의 발현을 억제함으로써 PPARγ와 C/EBPα의 유전자 발현을 조절하는 것임을 나타낸다.
- 이후 부탄올 분획물을 증발농축기를 이용하여 용매를 증발시키고 분말상태인 SH21B엑스를 얻었다. 최종적으로 얻어진 SH21B엑스의 양은 추출 전 생약 원료 양의 4.9%였다(w/w). SH21B의 추출 후, thin layer chromatography를 사용하여 7종류의 생약 물질의 성분을 조사하고 high performance liquid chromatography 를 사용하여 구성 물질의 양을 측정한 결과, 11.
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