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문제 정의
- 이에 본 연구자는 정상 자궁경부 조직과 자궁경부 편평상피암 환자의 종양 조직을 대상으로 Membrane with P-33 probes를 이용한 Human cDNA microairay를 실시하여 자궁경부암에서 특징적으로 나타나는 유전자발현 양상과 방사선치료에 따른 변화 및 방사선 단독치료와 항암화학요법 병용치료 시의 유전자발현 변화양상을 파악하고자 하였다.
제안 방법
- 5개의 군으로 나누어 준비한 전체 RNA pool 각각에 대하여 역전사(reveirse transcription) 방법을 이용하여 [P-33]으로표지한 cDNAs를 제작하였다. 이 과정을 간단히 요약하면,3~10 μg의 total RNA를 reverse transcription 반응 (5X fig strand PCR buffer, 1 μg of 24-mer poly dT primer, 4 μL of 20 mM each dNTP excluding dCTP, 4 μL of 0.
- 시행하였다. Microarray 멤브레인을 10 μL의 10 mg/mL human Cot 1 DNA (Life Technologies) 와 10 μL of 8 mg/mL poly dA (Pharmacia, NJ)가 포함된 총 4.0 mL Microhyb (Research Genetics) 용액에 전처치 하였다. Cot 1과 poly dA는 95℃에서 5 분간 방치한 후 첨가하였다 전처치 용액을 42℃ 에서 4시간 처리하여 준비된 멤브레인에 10’ cpm/mL의 heat- denatured (95℃, 5 부) probes를 첨가하고 42℃에서 17시간 동안 반응하였다.
- 노출된 Imaging plates는 FLA-8000® (Fuji Photo Film Co)으로 50 (jm resolutioii을 갖고 스캔하였다. Microarray 이미지는 적절한 크기로 잘라 정돈하거나 회전시켜 L-Processor® (Fiyi Photo Film Co)에서 분석하였다. 각 스팟 (spot)들의 방사능 강도가 유전자의 발현정도를 나타내는데, 각 스팟의 픽셀(pixel)을 Arrayguage® (Fuji Photo Film Co.
- 1 "M DTT, 40 U of RNase inhibitor, 6 μL of 3, 000 Ci/mmol [P-33] dCTP to a final volume of 40 μL 하였고, 반응혼합물은 65 ℃ 에서 5분간 방*치한 후 42℃에서 3분간 반응하였다. Superscript reverse transcriptase (Life Technologies, specific activity : 200, 000 U/mL)2 μL를 첨가하고 42℃에서 30분간 방치하여 1차 반응을 시행하였고 이후 2 μL의 Superscript reverse tTamciiptase를 2차로 첨가하고 동일한 온도에서 30분간 추가로 2차 반응을 하였다, 이후 0.5 M EDTA 5 μL를 첨가한 후 10 μL의 0.1 M NaOH를 추가하고 65C 에서 30 분간 반응하여 잔여 RNA들을 제거하였다 최종적으로 25 μL의 1 M Tris (pH 8.0)를 넣어 최종산물을 중화하고 Bio-Rad 6 purification columns (Hercules, CA)를 사용하여 정제하였다. 최종산물의 방사능은 시료 당 5X1O6-3X1O7 cpm이었다.
- Microarray 이미지는 적절한 크기로 잘라 정돈하거나 회전시켜 L-Processor® (Fiyi Photo Film Co)에서 분석하였다. 각 스팟 (spot)들의 방사능 강도가 유전자의 발현정도를 나타내는데, 각 스팟의 픽셀(pixel)을 Arrayguage® (Fuji Photo Film Co.)를사용하여 산출한 후 에셀파일Microsoft, Seattle, WA)로 저장하였다. 각 유전자의 발현정도는 원 자료(original data)를 Z- 변환을 통해 보정 (normalized)한 Z score로 표현되는데, 이는 각 유전자가 전체유전자의 평균강도에서 얼마나 떨어져 있는가를 나타내 주는 것으로서 표준편차가 그 단위가 된다.
- 전골반에 36-45 Gy를 조사한 후, 중앙차폐를 실시하고, 강내치료를 시행하였다. 강내치료는 [Ir-192] 동위원소를 사용하는 고선량률(High dose rate) 근접치료기 (micro-Selectron, Nucletron, Netherlands) 로 1회 4-5 Gy씩 5~6회 총 24~30 Gy를 시행하였다. 필요시 외부치료로 골반측벽에 9~10 Gy를 추가하였다.
- 생검을 통해 얻은 각 조직에서 위와 같은 방법으로 각각의 전체 RNA를 얻은 후, cDNA micmarray를 위해 정상 자궁경부조직 3례, 방사선 단독치료 전 8례, 방사선단독치료 중 8 례, 방사선-항암화학요법 병용치료 전 8례, 병용치료 중 8례등의 5개 군으로 pooling을 하였는데, 각 poole 개별 환자의 유전자 농도비를 일정하게 하면서 전체 RNA의 농도가 5μg/10 μL이 되도록 준비하였다.
- 생검을 통해 얻은 대상 조직 약 50 mg에서 균질화(homogenization) 시킬 수 있는 기기 (Tissue . Tearor homogenizer; Biospec product, Inc)로 total RNA를 추출하였다. 전체 RNA< 분리하기 위하여 사용한 용기는 먼저 ribonuclease (RNase)를 제거하였는데, 유리 제품은 고압 증기 멸균기로 40분 이상을 처리하여 사용하였다.
- 전체 RNA< 분리하기 위하여 사용한 용기는 먼저 ribonuclease (RNase)를 제거하였는데, 유리 제품은 고압 증기 멸균기로 40분 이상을 처리하여 사용하였다. 시약을 만들기 위하여 필요한 멸균 증류수는 강력한 단백질 분해제인 diethylpyrocarbonate (DEPC; Sigma, St Louis, MO, USA)를 0.1% 처리하여 멸균한 물을 사용하였다. 전체 RNA 추출을 위해 RNA lysis solution (4.
- 실험 대상 및 대조군의 생검된 조직이 본 실험에 적합한지를 확인하기 위하여 광학현미경하의 조직학적 특성을 살펴보았다(Fig. 1). 방사선치료를 약 2주간 시행한 후 채취한 자궁경부암종 조직에서 단일 세포괴사는 있었으나 광범위한 부위의 괴사는 관찰되지 않았고, 주로 방사선조사에 의한 세포사를 시사하는 변화가 보였다(Fig.
- 병기에 대한 특별한 제한은 두지 않았으나, 진단시 원격전이가 있는 경우는 제외하였다. 실험에 사용하는 검체의 채취 시기는 어떠한 치료도 시행 받지 않은 상태인 치료 전 시점과 외부 방사선 치료 시작 후 조직 흡수선량이 16.2~27 Gy가된 시점인 2~3주 사이에 시행하였다. 검체는 암종 중 괴사가 없고, 출혈이 심하지 않은 부위에서 채취하였으며, 즉시cryotube에 담아 deep iieezer에 -80 ℃ 로 동결보관 하였다가 RNA 추출 시 일괄 사용하였다.
- 구성되었다. 외부 방사선 치료는 고에너지 방사선인 10 MV X-ray을 사용(Clinac 2100 C/D, Varian, USA)하여 전 골반부위에 전후좌우 4문조사를 시행하되, 일일 선량 L8~2 Gy씩 주 5회 시행하여 주당 9~10 Gy를 조사하였다. 전골반에 36-45 Gy를 조사한 후, 중앙차폐를 실시하고, 강내치료를 시행하였다.
- 항암화학요법을 방사선치료와 병용한 경우, 방사선치료 시작일에 항암제가 동시에 투여되도록 하였다. 항암화학요법은 5-Fluorouracil 1,000 mg/m?을 제 1일부터 5일까지 정주하고, cisplatin 60 mg/n?을 제 1일에 정주하여, 3주 간격으로 총 6회 시행하였다.
- 각 유전자의 발현정도는 원 자료(original data)를 Z- 변환을 통해 보정 (normalized)한 Z score로 표현되는데, 이는 각 유전자가 전체유전자의 평균강도에서 얼마나 떨어져 있는가를 나타내 주는 것으로서 표준편차가 그 단위가 된다. 이후 각 유전자의 발현정도 상호 비교는 각 유전자의 발현의 차를 Z-Difference로 표현한 후, 이를 다시 Z-Diff&ence 의표 준 편차로 나눈 Z-ratio 값을 산출하여 시행하였는데 그 계산식은 다음과 같다.
- 1% SDS가 함유된 세척액으로 3번 닦아내고 실온에서 15분간 방치하였다. 이후 멤브레인을 phosphorimageT용 imaging plates에 옮겨 1~5일 동안 표지된 방사능의 강도에 따라서 차등을 두어 노출시켰다. 노출된 Imaging plates는 FLA-8000® (Fuji Photo Film Co)으로 50 (jm resolutioii을 갖고 스캔하였다.
- 외부 방사선 치료는 고에너지 방사선인 10 MV X-ray을 사용(Clinac 2100 C/D, Varian, USA)하여 전 골반부위에 전후좌우 4문조사를 시행하되, 일일 선량 L8~2 Gy씩 주 5회 시행하여 주당 9~10 Gy를 조사하였다. 전골반에 36-45 Gy를 조사한 후, 중앙차폐를 실시하고, 강내치료를 시행하였다. 강내치료는 [Ir-192] 동위원소를 사용하는 고선량률(High dose rate) 근접치료기 (micro-Selectron, Nucletron, Netherlands) 로 1회 4-5 Gy씩 5~6회 총 24~30 Gy를 시행하였다.
- 1% 처리하여 멸균한 물을 사용하였다. 전체 RNA 추출을 위해 RNA lysis solution (4.2 M guanidine isothiocyanite, 0.75 M sodium citrate, 10% sarcosyl) 500 μL를 첨가하고, citrate-saturated phenol (Bio- neer, Equilibrated Phenol A, pH 4.3 ±0.2) 500 eL, chloroform (Merck, Darmstadt, Germany) 300 μL을 첨가하여 잘 혼합하였다, 이것을 얼음에서 30분간 처리한 후 14, 000 ipm으로 4℃의 냉장 상태에서 10분간 원심분리(Miciol7R plus, Micro high speed centrifuge, Hanil)하여 상층액을 새로운 tube에 옮겨 담고 Isopropanol (Merck)을 동일량 첨가하여 10~20회 정도 혼합한 후 ・20℃에서 1시간 이상 냉각시켰다. 이를 4℃의 냉장에서 14, 000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다.
- 75% ethaii이 1 mL로 침전물을 2회 세척한 후 heating block에서 ethanol을 건조시켰다. 최종적으로 추출한 RNA 침전물을 RNase-free water (DEPC로 전처리한 멸균 증류수)로 용해하여 260 nm에서 흡광광도계 (spectrophotometer- DU650; Beckman, Somerset, NJ, USA)로 농도를 측정하였다.
- 강내치료는 [Ir-192] 동위원소를 사용하는 고선량률(High dose rate) 근접치료기 (micro-Selectron, Nucletron, Netherlands) 로 1회 4-5 Gy씩 5~6회 총 24~30 Gy를 시행하였다. 필요시 외부치료로 골반측벽에 9~10 Gy를 추가하였다. 항암화학요법을 방사선치료와 병용한 경우, 방사선치료 시작일에 항암제가 동시에 투여되도록 하였다.
- 필요시 외부치료로 골반측벽에 9~10 Gy를 추가하였다. 항암화학요법을 방사선치료와 병용한 경우, 방사선치료 시작일에 항암제가 동시에 투여되도록 하였다. 항암화학요법은 5-Fluorouracil 1,000 mg/m?을 제 1일부터 5일까지 정주하고, cisplatin 60 mg/n?을 제 1일에 정주하여, 3주 간격으로 총 6회 시행하였다.
대상 데이터
- 2~27 Gy가된 시점인 2~3주 사이에 시행하였다. 검체는 암종 중 괴사가 없고, 출혈이 심하지 않은 부위에서 채취하였으며, 즉시cryotube에 담아 deep iieezer에 -80 ℃ 로 동결보관 하였다가 RNA 추출 시 일괄 사용하였다. 근치목적 방사선치료를 단독으로 시행한 8명과 항암화학요법을 병행한 8명에서 각각 채취한 조직을 실험대상으로 하였으며, 정상 자궁경부를 3례 생검하여 대조군으로 사용하였다(Table 1).
- 검체는 암종 중 괴사가 없고, 출혈이 심하지 않은 부위에서 채취하였으며, 즉시cryotube에 담아 deep iieezer에 -80 ℃ 로 동결보관 하였다가 RNA 추출 시 일괄 사용하였다. 근치목적 방사선치료를 단독으로 시행한 8명과 항암화학요법을 병행한 8명에서 각각 채취한 조직을 실험대상으로 하였으며, 정상 자궁경부를 3례 생검하여 대조군으로 사용하였다(Table 1).
- 방사선치료는 외부 방사선치료와 강내치료 (Intracavitary Brachytherapy)로 구성되었다. 외부 방사선 치료는 고에너지 방사선인 10 MV X-ray을 사용(Clinac 2100 C/D, Varian, USA)하여 전 골반부위에 전후좌우 4문조사를 시행하되, 일일 선량 L8~2 Gy씩 주 5회 시행하여 주당 9~10 Gy를 조사하였다.
- 병리조직 검사로 자궁경부 편평상피암으로 확진된 후 근치 목적 방사선치료를 시행받는 환자를 대상으로 하였다. 병기에 대한 특별한 제한은 두지 않았으나, 진단시 원격전이가 있는 경우는 제외하였다.
- 종양 cDNA microarray nylon membranee 미국 국립보건원 (National Institutes of Health) 노화연구소(National Institute on Aging)의 DNA microarry unit에서 제작된 것을 사용하였다. 이 멤브레인은 Research Genetics 사에서 구입한 15, 000개의 human cDNA 클론들(RG 15K®)로부터 제작되었는데, 여기에는 분화(differentiation), 발달(development), 증식 (proliferation), 변형 (transfomation), 세포주기 (cell cycle progression), 면역반응 (immune response), 전사 및 번역 인자(transcription and translation factors), 발암유전자(oncogenes), 및 세포성장과 유지에 관련된 여러가지 분자(molecules) 등이 포함되어있다.
이론/모형
- cDNA microarray 실험과정은 박 등9)이 발표한 기법을 따라 시행하였다. Microarray 멤브레인을 10 μL의 10 mg/mL human Cot 1 DNA (Life Technologies) 와 10 μL of 8 mg/mL poly dA (Pharmacia, NJ)가 포함된 총 4.
- 0 이하이면 의미있게 감소한 것을 나타낸다. 유전자의 발현 정도에 따른 유전자분류 기법인 클러스터그램(clustergram)은 Eisen 등의 방법을 이용하였다.10)
성능/효과
- 타이로신 인산화 능력이 일부 암유전자의 주요한 기능의 하나로 알려졌는데, 인산화여부와 효소 활성의 증가 및 세포변형능력의 획득이 서로 인과관계가 있는 것으로 밝혀져 있다.26, 27) Receptor tyrosine kinase (RTK)의 주요 기능은 정상적인 세포의 생명현상 뿐만 아니라, RTK sig-naling을 통해 종양세포의 발생과 증식에도 관여하는 것으로 알려졌다 Tyrosine phosphatase는 단순히 kinase의 역기능으로서 탈인산화과정에만 관여하는 것이 아니라 tyrosine phos- phatase의 활성도에 따라 RTK의 기능을 감소시키거나, 리간드(ligand)로 유도된 RTK의 활성화를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 29, 30) 현재까지 약 60여 종이 발견되 었으며, 세포막에 수용체 기능을 가진 tyrosine phcsphatase도 다수 발견되었으나 기능은 아직 밝혀지지 않았다.
- 1, 2) 병기 DB로 국소진행된 경우에도 약 2/3의 환자들이 방사선치료 단독으로 완치될 수 있으나, 치료 전에 이를 각 개인별로 식별해 낼 수 없기 때문에 현재로서는 부작용과 합병증을 감수하면서 방사선치료와 함께 항암제 병용요법을 모든 대상 환자에게 시행하는 것이 표준적 치료로 정립 되어가는 실정이다.3, 4) 전통적 기법인 병기, 암종의 크기, 침윤정도 조직학적 유형, 림프절 전이유무 등의 예후인자를 분석하여 어느 정도 치료 결과를 예측할 수는 있지만, 같은 치료를 실시하고도 완치가 되는 경우와 실패하는 경우의 이유는 규명할 수 없었다. 만약 이를 사전에 미리 예측할 수 있는 방법이 개발된다면, 방사선 조사선량의 조절과 항암제 병용 여부 및 최적의 약제 선택 등을 골자로 하는, 최소의 치료로 최대의 치료 효과를 얻고 독성은 최소화하는 개별화된 맞춤형 치료법(individualized therapy)을 각 환자에게 시행할 수 있게될 것이다.
- 꼬) 정상적으로 CDK는 세포주기의 변화에 큰 영향을 받지 않고 항상 일정한 양이 안정적으로 발현되고 있는데, 간혹 growth factor의 자극에 의해 그 발현이 약간의 영향을 받기도 하는 것으로 알려져 있다.33)본 연구결과 자궁경부 편평상피암에서 Cdc 28의 Z-ratio 2.32로서 정상 자궁경부 세포에 비해 유의하게 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었는데, 이는 Z-ratio 2.02인 cell division protein kinase 8과 함께 종양 세포에서의 왕성한 세포분 열을 시사해준다고 판단되었다.
- 알려졌다.34) Spiy 2는 RTK 신호전달에 대한 보편적인 억제인자로 알려졌었는데, 120~kDa의 proto-oncogenic protein 인 c-Cbl과의 상호작용에 따라 조절기능을 향상시킬 수도 있고 감소시킬 수도 있는 양면적인 기능을 가진 것이 밝혀졌다.35) Spry 2의 aminotermmal domain과 c-Cbl의 격리 (sequestration) 에 의해 EGFR의 ubiquitination과 분해 (degradation) 를 저해함으로서 Spry 2는 EGFR 신호전달을 증폭한다는 보고가 있었다.
- 36)즉 Spry 2가 c-Cbl를 매개로한 수용체의 기능감소 (receptor down regulation)를 저해함으로서 EGFR 신호전달을 특이적으로 증폭한다는 것이다.36) 다양한 종양세포에서 발현이 증가되는 것으로 보고된 EGFRe 자궁경부암에서도 발현이 증가되는 것으로 알려져 있는데, 이번 연구에서는 Spry 2가 Z-ratio 2.37로 발현 증가되어, EGFR 신호전달을 증폭하는 효과가 있을 것으로 생각된다.
- 또한 암유전자인 K-ras onco- gene, 암억 제 유전자인 protein phosphatase 2A B56-beta (PP2A), protein phosphatese PP2A 65 xD, regulatory subunit alpha isoform 등과 혈관형성에 관여하는 angiopoietin-2의 발현도 증가하였다. G-단백신호전달에 관여하는 G protein-cou-pled receptor HM74, regulator of G protein signaling (RGS13)과 포도당 대사에 관여하는 Glucose-6-phosphatase, phosphorylasekinase beta subunit, Phosphoenolpyruvate carboxykinase 등과 면역반응에 관여하는 Formyl peptide receptor-like 1, NKG2-D type II integral membrane protein 등의 발현도 증가하였다. DNA 손상의 회복(repair) 에 관여하는 cAMP phosphodiesterase의 발현도 증가하였다.
- 방사선 조사에 따른 유전자 발현 양상을 살펴보면 종양세포에서 증가되었던 세포성장과 증식, 세포주기, 신호전달 관련 유전자들이 전반적으로 감소되는 경향을 나타내었다(Qable 2). Spry 2, ILK, tyrosine phosphatase, ERK 3, cell division protein kinase 8 등의 Z-ratio가 각각 -3.04, 300, -2.85, -2.36, -220으로서 많은 감소를 나타내어 방사선에 의해 종양세포의 분열과 증식이 크게 저해되고 있음을 확인할 수 있었다.
- 결론적으로 cDNA microairay를 이용하여 자궁경부 편평상피암에서 세포성장과 증식에 관여하는 유전자, 세포주기 관련 유전자, 신호전달 관련 유전자 등의 발현증가를 일괄적으로 확인할 수 있었다. 이에 따라 자궁경부암의 분열과 증식은 ILK에의한 신호시작, Spry 2에 의한 신호의 증폭, MAPK signaling의 활성증가, Cdc 2 및 cell division kinase 등에 의한 세포분열의 증가 등 여러 유전자의 다발적 활성 증가가 관여하리라고 유추 할 수 있었다.
- 0 이상의 발현증가를 보인 유전자들에는 세포 성장과 증식에 관여하는 유전자들인 ILK, casein kinase I gamma 2, 68 kDa type I phosphatidylinositol-4-phos- phate 5-kinase alpha, tyrosine phosphatase, serine-threonme phosphatase (PP5), Protein tyrosine phosphatase (receptor-type, zeta polypeptide 1) 등과 세포주기 관련 유전자인 cell division protein kinase 8, CDC28 protein kinase 2 및 신호전달 관련 유전자들인 Sprouty 2 (SPRY2), ERK3, sds22-like mRNA, phosphatidyl inositol 3-kinase catalytic subunit alpha isoform, TAK1 binding protein 1 (TAB1), serine kinase SRPK2, Diacylglycerol kinase delta, Ins P35-phosphatase, Protein tyrosine phosphatase (non-receptor type 1) 등이 포함되어 방사선 단독치료에서는 그 발현이 감소되었던 유전자들의 발현이 상대적으로 증가하는 양상을 보였다(Table 2). 또한 암유전자인 K-ras onco- gene, 암억 제 유전자인 protein phosphatase 2A B56-beta (PP2A), protein phosphatese PP2A 65 xD, regulatory subunit alpha isoform 등과 혈관형성에 관여하는 angiopoietin-2의 발현도 증가하였다. G-단백신호전달에 관여하는 G protein-cou-pled receptor HM74, regulator of G protein signaling (RGS13)과 포도당 대사에 관여하는 Glucose-6-phosphatase, phosphorylasekinase beta subunit, Phosphoenolpyruvate carboxykinase 등과 면역반응에 관여하는 Formyl peptide receptor-like 1, NKG2-D type II integral membrane protein 등의 발현도 증가하였다.
- 0 이상으로 유의하게 발현이 증가한 경우는 CNCG와 3개의 EST들로서 이들은 그 기능이 아직 밝혀지지 않은 것들이었다. 방사선 치료 중 유전자 발현이 Z-ratio -2.0 이하로 유의한 감소를 보인 것들에는 세포성장과 증식에 관여하는 유전자들인 ILK, tyrosine phosphatase, Phosphoenolpyruvate car- boxykinase 1, casein kinase I gamma 2, IRAK, 68 kDa type I phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kmase alpha 등과 세포주기 관련 유전자인 CDC28 protein kinase 2, cell division kinase 8 및 신호전달에 관여하는 유전자인 Diacylglycerol kinase delta, Sprouty 2 (Spry2), lipid-activated protein kinase PRK2, serine kinase SRPK 2, ERK 3 등이 포함되어 종양세포에서 발현이 증가되었던 세포 증식과 신호전달 관련 유전자들의 발현이 방사선 조사로 인하여 의미있게 감소되었다(Table 2). 또한 포도당 대사에 관여하는 Phosphofructokinase 등과 G-단백 신호전달에 관여하는 retinal S-antigen, GTP binding protein (ARL3)등도 방사선 조사로 인하여 의미있게 감소하였다.
- 방사선치료 후에는 종양세포에서 발현이 증가되었던 세포성장과 증식 및 신호전달 관련 유전자들의 발현이 유의하게 감소되어, 종양세포의 분열과 증식이 저해되고 있음을 확인하였다. 방사선 항암화학 병용치료의 경우, 방사선 단독치료에 비해 세포성장과 증식 및 신호전달 관련 유전자들의 발현이 상대적으로 증가하였고,혈관형성 (angiopoietin-2), 면역반응(formyl peptide receptor-like 1), DNA 손상회복(cAMP phosphodiesterase)에 관련된 유전자 등의 발현은 증가되고, 세포고사(DAP-kinase)에 관련된 유전자는 발현감소를 보이는 등 유전자 수준에서의 작용 기전이 달랐다. 향후 이번 연구에서 나타난 유전자들에 대한 추가연구가 필요할 것이며, 방사선 단독치료와 항암제 병용치료에 따른 유전자 수준에서의 차이점과 그 기전연구를 더욱 진행하면 궁극적으로 개별화된 맞춤형 치료법의 개발이 가능할 수 있을 것으로 기대된다.
- 이에 따라 자궁경부암의 분열과 증식은 ILK에의한 신호시작, Spry 2에 의한 신호의 증폭, MAPK signaling의 활성증가, Cdc 2 및 cell division kinase 등에 의한 세포분열의 증가 등 여러 유전자의 다발적 활성 증가가 관여하리라고 유추 할 수 있었다. 방사선치료 후에는 종양세포에서 발현이 증가되었던 세포성장과 증식 및 신호전달 관련 유전자들의 발현이 유의하게 감소되어, 종양세포의 분열과 증식이 저해되고 있음을 확인하였다. 방사선 항암화학 병용치료의 경우, 방사선 단독치료에 비해 세포성장과 증식 및 신호전달 관련 유전자들의 발현이 상대적으로 증가하였고,혈관형성 (angiopoietin-2), 면역반응(formyl peptide receptor-like 1), DNA 손상회복(cAMP phosphodiesterase)에 관련된 유전자 등의 발현은 증가되고, 세포고사(DAP-kinase)에 관련된 유전자는 발현감소를 보이는 등 유전자 수준에서의 작용 기전이 달랐다.
- 방사선치료를 약 2주간 시행하여 18-27 Gy를 조사한 후에 실시한 조직생검에서 관찰되는 자궁경부암종의 병리 학적소견에서 단일 세포의 괴사는 있었으나 광범위한 부위의 괴사는 관찰되지 않았고 주로 방사선조사에 의한 세포사(cell death)를 시사하는 소견이 관찰되어 본 실험을 통한 유전자 발현실험을 진행하는데 지장이 없다고 판단되었다. 방사선 조사에 따른 유전자 발현 양상을 살펴보면 종양세포에서 증가되었던 세포성장과 증식, 세포주기, 신호전달 관련 유전자들이 전반적으로 감소되는 경향을 나타내었다(Qable 2).
- 1). 방사선치료를 약 2주간 시행한 후 채취한 자궁경부암종 조직에서 단일 세포괴사는 있었으나 광범위한 부위의 괴사는 관찰되지 않았고, 주로 방사선조사에 의한 세포사를 시사하는 변화가 보였다(Fig. 1Q.
- 37)고형암에서 기존의 정상(host) 혈관은 angiopoietin-2의 작용으로 불안정화 되고 혈관내피세포의 세포고사가 일어나게 되며, VEGF가 angiopoietin-2과 함께 존재하면 종양혈관이 새로이 생성되는 것이다. 방사선치료와 항암제 병용치료시 방사선 단독치료의 경우보다 angi-opoietin-2의 발현이 Z-ratio 2.90으로 증가되고 VEGF의 발현증가는 없었는데, 따라서 병용치료의 경우 종양혈관들의 흡수와 퇴화가 방사선치료 단독보다 더욱 빨리 진행되리라고 추측하였다.
- 방사선치료와 항암화학요법을 병용했을 때 방사선 단독치료에 비하여 Z-ratio 2.0 이상의 발현증가를 보인 유전자들에는 세포 성장과 증식에 관여하는 유전자들인 ILK, casein kinase I gamma 2, 68 kDa type I phosphatidylinositol-4-phos- phate 5-kinase alpha, tyrosine phosphatase, serine-threonme phosphatase (PP5), Protein tyrosine phosphatase (receptor-type, zeta polypeptide 1) 등과 세포주기 관련 유전자인 cell division protein kinase 8, CDC28 protein kinase 2 및 신호전달 관련 유전자들인 Sprouty 2 (SPRY2), ERK3, sds22-like mRNA, phosphatidyl inositol 3-kinase catalytic subunit alpha isoform, TAK1 binding protein 1 (TAB1), serine kinase SRPK2, Diacylglycerol kinase delta, Ins P35-phosphatase, Protein tyrosine phosphatase (non-receptor type 1) 등이 포함되어 방사선 단독치료에서는 그 발현이 감소되었던 유전자들의 발현이 상대적으로 증가하는 양상을 보였다(Table 2). 또한 암유전자인 K-ras onco- gene, 암억 제 유전자인 protein phosphatase 2A B56-beta (PP2A), protein phosphatese PP2A 65 xD, regulatory subunit alpha isoform 등과 혈관형성에 관여하는 angiopoietin-2의 발현도 증가하였다.
- Membrane with colorimetric probes, 셋째 Membrane with[P-33] probes 등 크게 3가지로 나누어 질 수 있다. 본 연구에서 시행한 방사성동위원소 [P-33] probes를 이용한 종양 cDNA Microarray의 특징은 소량의 total RNA를 추출할 수밖에 없는 실험조건에서도 적용이 가능하여 임상에서 얻어진 인간의 검체와 같이 소량의 재료를 분석할 수 있으며, Glass with fluorescent probes를 이용한 상품화된 kit 에 비하여 저렴한 비용으로 실험을 진행할 수 있고, 일반적인 생화학, 분자생물학적인 방법을 이용한 실험들을 확인, 증명하는 보조적인 수단으로서의 이용이 가능하다는 점이다.
- 실험의 재현성과 안정성을 확인하기 위해 cDNA가 좌 . 우 두 패널로 배열 되었던 멤브레인에서 얻은 클러스터 그램은 동일한 유전자에 대해서 두 개의 컬럼(column)으로 그 발현 정도가 표현되는데, 본 실험 결과 각각의 유전자에 대한 중복실험결과 각각의 컬럼의 색상이 거의 일치(R2 value>0.95)하여 실험의 안정성이 높다고 판단되었다.
- 이번 cDNA microarray 연구 결과, 정상자궁경부에 비하여 자궁경부암에서 의미있게 발현이 증가된 유전자들은 주로 세포 성장과 증식, 세포주기, 신호전달 등에 속하는 것이었다(Table 2).
- 확인할 수 있었다. 이에 따라 자궁경부암의 분열과 증식은 ILK에의한 신호시작, Spry 2에 의한 신호의 증폭, MAPK signaling의 활성증가, Cdc 2 및 cell division kinase 등에 의한 세포분열의 증가 등 여러 유전자의 다발적 활성 증가가 관여하리라고 유추 할 수 있었다. 방사선치료 후에는 종양세포에서 발현이 증가되었던 세포성장과 증식 및 신호전달 관련 유전자들의 발현이 유의하게 감소되어, 종양세포의 분열과 증식이 저해되고 있음을 확인하였다.
- 여기에는 세포의 성장과 증식 및 신호전달에 관련된 유전자들이 일부 포함되었는데, 이는 병용치료의 경우 이들 유전자의 발현이 치료 후에도 여전히 높았다는 의미가 아니라, 방사선 단독치료에 비해서 상대적으로 높았다는 의미로서 해석상 주의를 요한다. 일반 조직학적 소견으로는 방사선치료 단독과 항암화학요법 병용 치료시의 차이를 구별할 수 없었으나, 유전자 발현양상에는 큰 차이를 보여, 유전자 수준에서의 작용기 전에 많은 차이가 있음을 시사하였다. 특히 Angiopoietin-2, NKG2-D type U integral membrane protein, cAMP phosphodiesterase 등 혈관형성, 면역반응, DNA 손상회복에 관련된 유전자의 발현 증가와 death-associated protein (DAP)-kinase 등 세포고사에 관련된 유전자의 발현 감소는 방사선 단독치료 시와 병용치료의 차이를 설명할 수 있는 변화로 추측되었으며, 향후 이에 대한 연구가 더욱 진행되어야 할 것으로 생각되었다.
후속연구
- K 유전자가 포함되지 않았기 때문으로 추측된다.'E6)이번 연구 결과 ILK의 Z-ratio가 2.43으로 그 발현이 유의하게 증가하였음이 처음 밝혀져 향후 이에 대한 확인연구 및 임상적 의의 등에 대한 추가 연구가 필요하다고 생각된다.
- 29, 30) 현재까지 약 60여 종이 발견되 었으며, 세포막에 수용체 기능을 가진 tyrosine phcsphatase도 다수 발견되었으나 기능은 아직 밝혀지지 않았다.31) 자궁경부암에서의 tyrosine phosphatase의 활성도에 대해서는 아직 명확하지 않으며, 이번 연구를 통해 Z-ratio 2.40의 발현강도로서 증가된 양상을 보여 향후 이에 관한 연구를 진행할 필요성이 있겠다.
- 3, 4) 전통적 기법인 병기, 암종의 크기, 침윤정도 조직학적 유형, 림프절 전이유무 등의 예후인자를 분석하여 어느 정도 치료 결과를 예측할 수는 있지만, 같은 치료를 실시하고도 완치가 되는 경우와 실패하는 경우의 이유는 규명할 수 없었다. 만약 이를 사전에 미리 예측할 수 있는 방법이 개발된다면, 방사선 조사선량의 조절과 항암제 병용 여부 및 최적의 약제 선택 등을 골자로 하는, 최소의 치료로 최대의 치료 효과를 얻고 독성은 최소화하는 개별화된 맞춤형 치료법(individualized therapy)을 각 환자에게 시행할 수 있게될 것이다.
- 일반 조직학적 소견으로는 방사선치료 단독과 항암화학요법 병용 치료시의 차이를 구별할 수 없었으나, 유전자 발현양상에는 큰 차이를 보여, 유전자 수준에서의 작용기 전에 많은 차이가 있음을 시사하였다. 특히 Angiopoietin-2, NKG2-D type U integral membrane protein, cAMP phosphodiesterase 등 혈관형성, 면역반응, DNA 손상회복에 관련된 유전자의 발현 증가와 death-associated protein (DAP)-kinase 등 세포고사에 관련된 유전자의 발현 감소는 방사선 단독치료 시와 병용치료의 차이를 설명할 수 있는 변화로 추측되었으며, 향후 이에 대한 연구가 더욱 진행되어야 할 것으로 생각되었다.
- 한 장의 슬라이드 위에 수천개의 cDNA를 집적(spotting)하여 동시에 대량으로 유전자발현 양상을 검사할 수 있는 cDNA microairay는 각 질환에 특이한 유전자를 분리, 규명하고, 질병 특이 단백질을 발굴하는 등의 기능적 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라, 나아가 유전자 진단 및 치료 등에 광범위하게 이용될 전망이다.5, 6)현재 cDNA microarray# 통하여 악성 림프종, 유방암 등에서 형태학적 종양분류의 한계를 넘어 분자생물학적 분류의 가능성을 제시하고 있다.
- 방사선 항암화학 병용치료의 경우, 방사선 단독치료에 비해 세포성장과 증식 및 신호전달 관련 유전자들의 발현이 상대적으로 증가하였고,혈관형성 (angiopoietin-2), 면역반응(formyl peptide receptor-like 1), DNA 손상회복(cAMP phosphodiesterase)에 관련된 유전자 등의 발현은 증가되고, 세포고사(DAP-kinase)에 관련된 유전자는 발현감소를 보이는 등 유전자 수준에서의 작용 기전이 달랐다. 향후 이번 연구에서 나타난 유전자들에 대한 추가연구가 필요할 것이며, 방사선 단독치료와 항암제 병용치료에 따른 유전자 수준에서의 차이점과 그 기전연구를 더욱 진행하면 궁극적으로 개별화된 맞춤형 치료법의 개발이 가능할 수 있을 것으로 기대된다.
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