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문제 정의
- 본 실험에서는 여정자 메탄올추출물을 용매별 분획을 실시하여 여정자 헥산 층이 B16F10 세포에서 tyrosinase의 활성과 멜라닌 합성을 억제하는 것을 확인하였으며, 여정자 헥산추출물(Hexane extract of Fructus Ligustri Lucidi; HFLL)이 멜라닌 합성을 억제하는 조절 기전을 조사하고자 tyrosinase, TRP-1와 TRP-2의 발현과 이들의 전사 조절 인자인 MITF의 변화를 조사하였다.
- 여정자 헥산추출물(HFLL)이 직접적으로 tyrosinase 활성을 억제시키는 것 인지 알아보기 위하여 기본 조건 하에서 배양된 B16F10 세포를 용해하여 tyrosinase 활성도 측정에 사용될 효소를 얻었다. 세포 용해액에 여정자 헥산추출물(HFLL)을 농도별로 처리하고 DOPA oxidation 활성을 측정한 결과 여정자 헥산추출물(HFLL)은 대조군의 100 ± 2.
제안 방법
- B16F10 세포를 10 cm 배양용기에 3×105 개씩 세포를 부착시키고 25, 50 ㎍/㎖씩 여정자 헥산추출물을 처리하고 3일 동안 배양하였다.
- B16F10 세포를 10 ㎝ 배양용기에 3×105 개씩 분주하여 4일간 배양하여 세포를 수거하고, 5 mM EDTA가 포함된 0.1 M sodium phosphate buffer(SPB, pH 6.8) 1 ㎖에 1%(V/V) triton X-100과 0.1%(V/V)의 0.1 M PMSF를 혼합한 lysis buffer로 용해하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성 측정에 사용하였다.
- B16F10 세포를 chamber slide에 5×103 개씩 분주한 후 24시간 배양하고, 여정자 헥산추출물을 25, 50 ㎍/㎖씩 처리한 다음 1시간 뒤 α-MSH(10 nM)를 처리하였다.
- Effect of HFLL on MITF in B16F10 cells. Cells were treated with 25, 50 ㎍/㎖ of HFLL for 3 days. Whole cell lysates were then subjected to Western blot analysis using antibody against MITF.
- 1% L-DOPA와 실온에서 4시간 반응 시켰다. PBS로 2회 세척하고 10% formalin 용액으로 30분간 고정한 후 PBS로 2회 세척하고 에탄올로 탈수시킨 다음 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 5-10% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다. PVDF membrane로 전이시키고 5% non-fat skim milk로 blocking 시킨 후, tyrosinase, actin, TRP-1, TRP-2(DCT), MITF의 antibody를 1:1000으로 희석하여 각각 실온에서 2시간 30분 동안 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후, HRP conjugate 2차 antibody를 1:4000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
- TBST로 3회 세척한 후, HRP conjugate 2차 antibody를 1:4000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 세척한 후 ECL 용액으로 발색 후 ChemiDoc을 이용하여 band의 사진을 촬영하였다.
- MITF는 tyrosinase의 프로모터 영역인 M box, E box에 결합하여 전사를 조절하는 역할을 한다. Tyrosinase 단백질 발현의 감소가 MITF 발현 감소로 인한 결과인지 알아보기 위하여 여정자 헥산추출물(HFLL)을 처리하고 72시간 배양 후 세포를 수거하여 MITF 단백질 발현의 변화를 측정하였다. 여정자 헥산추출물(HFLL)은 MITF 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다(Fig.
- 18 g을 얻었다. 남은 수용액에 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올 (n-butanol)을 넣고 동일한 방법으로 추출하였으며 감암 농축 후 동결건조 하였다. 각각 추출물은 에틸아세테이트 52.
- 1 M PMSF를 혼합한 lysis buffer를 200 ㎕ 씩 분주하고 세포를 수거하여 얼음에서 30분간 용해시킨 다음 4℃, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성 측정에 사용하였다. 단백질 정량은 Bradford 시약으로 595 nm에서 흡광도를 측정하여 동량의 단백질 양을 계산하였으며, 계산된 단백질과 0.1 M SPB(pH 6.8)의 총량이 150㎕가 되도록 분주 하고 0.1%(W/V) L-DOPA를 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰으며, 30분 간격으로 405 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 여정자 헥산추출물이 B16F10 세포에 미치는 독성을 평가하기 위하여 MTT assay를 시행하였다. 여정자 헥산추출물(HFLL)을 12.5에서 50 ㎍/㎖까지 처리하고 3일간 배양한 후 세포 생존율을 대조군과 비교하여 백분율로 나타내었다. 여정자 헥산추출물은 세포독성이 없는 것으로 나타났다(Fig.
- 여정자 헥산추출물(HFLL)을 처리하고 3일 동안 배양한 세포를 용해시켜 tyrosinase 활성을 측정하였다. 실험 결과 여정자 헥산추출물은 대조군 100 ± 4.
- 여정자 헥산추출물을 25, 50 ㎍/㎖과 α-MSH를 처리하고 3일 동안 배양한 후 배지를 제거하고 고정 과정을 거쳐 DOPA와 4시간 실온에서 반응 시켰다.
- 여정자 헥산추출물의 tyrosinase 활성 억제를 통한 멜라닌 합성 조절 효과를 세포 수준에서 관찰하기 위하여 DOPA 염색을 시행하였다. 여정자 헥산추출물을 25, 50 ㎍/㎖과 α-MSH를 처리하고 3일 동안 배양한 후 배지를 제거하고 고정 과정을 거쳐 DOPA와 4시간 실온에서 반응 시켰다.
- 1 M PMSF를 혼합한 lysis buffer로 용해하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성 측정에 사용하였다. 이 상층액에 여정자 추출물을 농도별로 처리한 후 L-DOPA를 넣고 37℃에서 30분 간격으로 1시간동안 405 nm로 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 이상의 결과에서 여정자 헥산추출물(HFLL)은 tyrosinase 활성을 효과적으로 억제하였는데, 이러한 효소 활성 억제가 단백질 발현 억제를 통한 결과인지 알아보기 위하여 B16F10 세포의 멜라닌 합성 관련 단백질인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질들의 발현을 Western blot으로 조사하였다. 실험 결과 tyrosinase와 TRP-1 발현은 여정자 헥산추출물(HFLL)에 의해 현저하게 감소되었으며, TRP-2의 발현은 소량 감소되었다(Fig.
- incubator에서 배양하였다. 주 1회 계대배양 하였으며, 세포를 심은 후 24시간 부착시키고 여정자 헥산추출물을 처리하여 배양하였다.
대상 데이터
- Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS)은 Gibco(NY, USA)사 제품을, goat polyclonal IgG tyrosinase, TRP-1, TRP-2은 Santa Cruz(CA, USA)사 제품을 mouse monoclonal IgG Microphthalmia Ab-1은 NeoMarkers(CA, U.S.A.)사 제품을, non-fat skim milk는 Becton(Le Pont de Claix, France)사 제품을, dimethylsulfoxide(DMSO), α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH), bovine serum albumin(BSA), phenylmethyl sulfonyl fluoride(PMSF), leupeptin, aprotonin, sodium fluoride(NaF), sodium orthovanadate(Na3VO4), N,N,N',N'-tetrametylethylenediamine(TEMED), thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT), L-3,4-dihydroxyphenyl alanine(L-DOPA), 단백질 정량 시약은 Bio-Rad(CA, USA)사 제품을 사용하였다.
- 또한 여정자는 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 항산화 활성에서 비타민 C, E와 합성항산화제인 butylated hydroxytoluene(BHT)와 유사한 수준으로 나타났다고 하였으며, 혈관운동성에 미치는 영향에 대한 실험 결과 혈관이완효과가 있다고 보고되었고15), 여정자 에탄올추출물은 mesenchymal stem cell의 osteogenic differentiation을 강화시켜 골형성을 자극한다고 하였다16). 본 실험에 사용된 여정자는 메탄올추출 후 용매별 분획을 실시하였으며 그 중 헥산 층을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 여정자의 주요성분은 올레아놀산, 아세트 올레아놀산, 울손, 만니톨, 포도당, d-mannite, oleic acid, linoleic acid 등이 있다. 올레아놀산 성분은 간 보호 작용, 강심 이뇨작용을 일정하게 나타내고 화학요법이나 방사선 치료를 한 후에 적어진 백혈구수를 늘이는 작용을 나타낸다.
- 실험에 사용된 여정자(Fructus Ligustri Lucidi)는 제주도에서 생산된 자연산을 제천약초를 통해 구입하여 사용하였다. 건조된 여정자 1,000 g에 100% 메탄올 10 ℓ를 가하여 7일 동안 실온에서 추출한 것을 거즈로 여과하고 감압 농축 하여 162.
데이터처리
- 실험 결과는 student's t-test를 이용하여 p-value를 구하였으며, p<0.05인 경우 *로 표기하였고 p<0.01인 경우 **(##)로 표기하여 유의성을 나타내었다.
이론/모형
- After 3 days, cells were analysed using Western blot as described in materials & methods.
- 세포내 tyrosinase 활성은 Martinez-Esparza 등의 방법14)으로 측정하였다. 6-well 배양용기에 B16F10 세포를 8×104 개씩 분주하여 24시간 배양한 후, 여정자 헥산추출물을 처리하였다.
- 세포생존율 측정은 Mosmann의 방법13)에 의하여 실시하였다. 24-well 배양 용기에 B16F10 세포를 5×103 개씩 분주하고 24시간 배양 후 여정자 헥산추출물을 여러 농도로 처리한 다음 37℃, 5% CO2 하에서 3일간 배양하였다.
- 여정자 헥산추출물이 B16F10 세포에 미치는 독성을 평가하기 위하여 MTT assay를 시행하였다. 여정자 헥산추출물(HFLL)을 12.
성능/효과
- 이러한 결과는 미백효과를 나타내는 물질이 헥산 층에 다량 존재함을 의미하는 것이다. 따라서 헥산 층에 존재하는 물질이 어떠한 기전을 통해 멜라닌 합성을 조절하는지 조사하였으며, 여정자 헥산추출물(HFLL)이 세포 증식에 미치는 영향을 조사한 결과 독성이 없는 것으로 나타났다. 한편, 여정자 헥산추출물(HFLL)의 tyrosinase 활성 억제효과가 단백질 발현 조절에 의한 것인지 알아보기 위하여 Western blot을 시행한 결과 tyrosinase와 TRP-1 단백질 발현이 감소되었다.
- 반면 여정자 헥산추출물을 처리한 세포에서는 수지상 돌기가 감소됨을 관찰 할 수 있는데 농도가 증가 할수록 그 차이는 더욱 확실해졌다. 또한 DOPA 산화에 의한 멜라닌 합성도 농도 의존적으로 억제되고 있음을 관찰 할 수 있었다(Fig. 2B)
- 또한 여정자 헥산출물(HFLL)이 tyrosinase 효소의 활성을 직접 억제하는지 알아보기 위해 기본 배지로만 배양한 B16F10세포를 용해하여 얻은 효소 액에 여정자 헥산추출물을 처리하여 tyrosinase 활성을 측정한 결과, 양성 대조군으로 사용한 코직산은 tyrosinase 활성을 현저하게 억제시킨 반면 여정자 헥산추출물은 4.7%에서 8.2%정도의 억제효과를 보였다. 이러한 결과는 세포내 tyrosinase 활성 억제효과가 세포내 신호전달 경로를 경유하여 멜라닌 생성이 억제되었음을 의미한다.
- 염색된 세포를 현미경으로 관찰한 결과 대조군에서는 수지상 돌기가 잘 발달되어 있으며 tyrosinase 활성에 의한 멜라닌 합성 또한 관찰되었다. 반면 여정자 헥산추출물을 처리한 세포에서는 수지상 돌기가 감소됨을 관찰 할 수 있는데 농도가 증가 할수록 그 차이는 더욱 확실해졌다. 또한 DOPA 산화에 의한 멜라닌 합성도 농도 의존적으로 억제되고 있음을 관찰 할 수 있었다(Fig.
- 본 실험에서 여정자 헥산추출물(HFLL)이 B16F10세포의 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 조사한 결과 농도의존적으로 활성을 억제하였다. 이러한 결과는 미백효과를 나타내는 물질이 헥산 층에 다량 존재함을 의미하는 것이다.
- 본 연구 결과 여정자 헥산추출물(HFLL)은 MITF 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. MITF 전사인자는 tyrosinase, TRP-1과 TRP-2의 멜라닌 합성에 관여하는 일련의 효소들의 전사를 유도한다.
- 세포 용해액에 여정자 헥산추출물(HFLL)을 농도별로 처리하고 DOPA oxidation 활성을 측정한 결과 여정자 헥산추출물(HFLL)은 대조군의 100 ± 2.7%에 비해 25 ㎍/㎖에서 92.8 ±3.7%, 50 ㎍/㎖에서 95.3 ± 2.4%로 tyrosinase 활성도를 약간 감소시켰고 양성 대조군으로 사용한 코직산은 50 ㎍/㎖에서 27.8 ±1.1%로 현저하게 감소시켰다(Fig. 5).
- 이상의 결과에서 여정자 헥산추출물(HFLL)은 tyrosinase 활성을 효과적으로 억제하였는데, 이러한 효소 활성 억제가 단백질 발현 억제를 통한 결과인지 알아보기 위하여 B16F10 세포의 멜라닌 합성 관련 단백질인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질들의 발현을 Western blot으로 조사하였다. 실험 결과 tyrosinase와 TRP-1 발현은 여정자 헥산추출물(HFLL)에 의해 현저하게 감소되었으며, TRP-2의 발현은 소량 감소되었다(Fig. 3).
- 실험 결과 여정자 헥산추출물은 대조군 100 ± 4.2%에 비해 25 ㎍/㎖에서 73.8 ±3.7%, 50 ㎍/㎖에서 48.1 ± 2.6%로 tyrosinase 활성을 현저하게 억제시켰다(Fig. 2A).
- 여정자 헥산추출물을 25, 50 ㎍/㎖과 α-MSH를 처리하고 3일 동안 배양한 후 배지를 제거하고 고정 과정을 거쳐 DOPA와 4시간 실온에서 반응 시켰다. 염색된 세포를 현미경으로 관찰한 결과 대조군에서는 수지상 돌기가 잘 발달되어 있으며 tyrosinase 활성에 의한 멜라닌 합성 또한 관찰되었다. 반면 여정자 헥산추출물을 처리한 세포에서는 수지상 돌기가 감소됨을 관찰 할 수 있는데 농도가 증가 할수록 그 차이는 더욱 확실해졌다.
- 5). 이러한 결과는 여정자 헥산 추출물(HFLL)이 tyrosinase에 직접적으로 작용하기 보다는 세포 내 대사과정에 영향을 주어 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 조절하고 있음을 나타낸다.
- 이상의 결과 여정자 헥산추출물은 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성 억제효과를 갖고 있으며, 이러한 효과는 MITF 발현 억제를 통하여 tyrosinase와 TRP-1의 발현 감소에 의한 것으로 사료된다.
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