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문제 정의
- 각각의 여정자 분획물이 B16F10 세포증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 여정자 헥산추출물(Hexane extract of Fructus Ligustri Lucidi; HFLL), 부탄올추출물(Butanol extract of Fructus Ligustri Lucidi; BFLL), 물추출물(water extract of Fructus Ligustri Lucidi; WFLL)은 12.
- 멜라닌 합성 초기단계에서 중요한 역할을 하는 tyrosinase 활성은 여정자 헥산추출물에 의해 효과적으로 억제되었다. 따라서 tyrosinase에 의해 촉매 되는 반응의 최종 산물인 멜라닌의 양을 측정하고자 하였다. B16F10 세포에 여정자 헥산추출물과 에틸아세테이트, 부탄올, 물 추출물을 각각 농도별로 처리하고 3일 동안 배양하였다.
- 또한 세포내 cAMP 경로를 활성화 시켜 tyrosinase 활성을 증가시키는 것으로 알려진 α-MSH를 처리하고 여정자 메탄올추출물이 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다.
- 이러한 활성 산소종에 대한 방어체계를 향상 시켜준다면 노화를 지연시키고 각종 질병을 예방하는데 기여할 것이다. 본 실험에서는 항산화 물질의 환원력을 측정하는데 가장 널리 쓰이는 DPPH를 사용하여 여정자 분획물을 대상으로 환원력을 평가 하였다. 헥산추출물은 환원력이 거의 나타나지 않았으며 물추출물은 농도 증가에 따른 환원력 증가가 크지 않았지만, 다른 분획물은 농도 증가에 따른 환원력이 비례적으로 증가하였다.
- 본 연구에서는 여정자 메탄올추출물이 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 여정자 메탄올추출물은 B16F10 세포에서 tyrosinase 활성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 멜라닌 합성 양 또한 현저하게 억제시켰다.
제안 방법
- α-MSH 10 nM 과 여정자 헥산, 부탄올, 물 추출물 25, 50 ㎍/㎖ 그리고 여정자 에틸아세테이트추출물 10, 12.5 ㎍/㎖을 병용 처리하고 3일 동안 배양한 후 2×106 개의 세포를 수거하여 세포내 멜라닌 함량을 측정하였다.
- 6-well 배양용기에 B16F10 세포를 8×104 개씩 분주하여 24시간 배양한 후, 여정자 추출물을 처리하고 1시간 후 α-MSH(10 nM)를 처리하였다.
- B16F10 세포 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 여정자 메탄올추출물(Methanol extract of Fructus Ligustri Lucidi; MFLL)을 12.5～200 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 3일간 배양하여 MTT assay를 실시하였다. 대조군을 100 ± 5.
- 따라서 tyrosinase에 의해 촉매 되는 반응의 최종 산물인 멜라닌의 양을 측정하고자 하였다. B16F10 세포에 여정자 헥산추출물과 에틸아세테이트, 부탄올, 물 추출물을 각각 농도별로 처리하고 3일 동안 배양하였다. 배양된 세포로부터 멜라닌 함량을 측정한 결과 여정자 헥산추출물은 대조군 100 ± 3.
- 멜라닌합성은 tyrosine을 DOPA로 전환 시키는 tyrosine hydroxylase와 DOPA를 DOPAquinone으로 전환시키는 DOPA oxidase로서 처음 두 단계의 반응을 촉매 하는 tyrosinase의 작용에 의해 시작된다. 기본적인 조건에서 배양된 B16F10 세포에 여정자 메탄올추출물을 50, 100 ㎍/㎖로 처리하고 3일간 배양한 후 tyrosinase 활성도를 측정하였다. 대조군 100 ± 3.
- 18 g을 얻었다. 남은 수용액에 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(n-butanol)을 넣고 동일한 방법으로 추출하였으며 감암 농축 후 동결건조 하였다. 각각 추출물은 에틸아세테이트 52.
- 1 M PMSF 를 혼합한 lysis buffer를 200 ㎕씩 분주하고 세포를 수거하여 얼음에서 30분간 용해시킨 다음 4℃, 15,000 rpm에서 30분간 원심 분리 하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성 측정에 사용하였다. 단백질 정량은 Bradford 시약으로 595 nm에서 흡광도를 측정하여 동량의 단백질 양을 계산하였으며, 계산된 단백질과 0.1 M SPB(pH 6.8)의 총량이 150 ㎕가 되도록 분주 하고 0.1%(W/V) L-DOPA를 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰으며, 30분 간격으로 405 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 앞선 실험을 통해 여정자 메탄올추출물이 뛰어난 미백효능이 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 미백 효능을 유도하는 물질을 분리하기 위한 일환으로 용매별 분획을 실시하여 효능을 측정하였다.
- DPPH는 항산화 물질의 환원력을 측정하는데 가장 널리 쓰이는 것이다. 따라서 여정자 분획물의 항산화 효과는 DPPH 라디칼 소거능을 사용하여 평가하였다. 실험 결과 여정자 헥산추출물은 DPPH 라디칼 소거능이 나타나지 않았다.
- 멜라닌 정량은 Hosei 등의 방법17)을 변형하여 사용하였다. 직경 6 ㎝ 배양용기에 1.
- 여정자 메탄올추출물 50, 100 ㎍/㎖씩 처리하여 3일 동안 배양하고, 각 군당 2×106 개의 세포를 수집한 다음 멜라닌 합성양을 측정하였다.
- 여정자 분획물들이 tyrosinase 활성에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위하여, 각각의 분획물들을 농도별로 처리하고 3일 동안 배양한 세포를 용해시켜 tyrosinase 활성을 측정하였다. 실험 결과 여정자 헥산추출물은 대조군 100 ± 4.
- 각각의 여정자 분획물이 B16F10 세포증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 여정자 헥산추출물(Hexane extract of Fructus Ligustri Lucidi; HFLL), 부탄올추출물(Butanol extract of Fructus Ligustri Lucidi; BFLL), 물추출물(water extract of Fructus Ligustri Lucidi; WFLL)은 12.5에서 50 ㎍/㎖까지, 에틸아세테이트추출물(Ethyl acetate extract of Fructus Ligustri Lucidi; EFLL)은 10에서 50 ㎍/㎖까지 처리하고 3일간 배양하였다. 세포 생존율은 MTT를 처리하여 570 nm로 흡광도를 측정하고 대조군과 비교하여 백분율로 나타내었다(Fig.
- 게다가 α-MSH로 유도된 과색소침착시 증가된 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성 또한 유의성 있게 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 미백효과를 나타내는 물질을 알아보기 위한 일환으로 용매별 분획을 실시하였다.
- 직경 6 ㎝ 배양용기에 1.5×105 개씩 분주하여 24시간 배양한 후, 여정자 추출물을 처리하고 1시간 후 α-MSH(10 nM)를 처리한 다음 3일간 배양 하였으며, 각 군당 2×106 개씩 수거하여 lysis buffer(5 mM EDTA, 0.1 M SPB(pH 6.8), 0.1% triton X-100)로 세포를 용해하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 여정자의 주요성분은 올레아놀산, 아세트 올레아놀산, 울손, 만니톨, 포도당, d-mannite, oleic acid, linoleic acid 등이 있다. 올레아놀산 성분은 간 보호 작용, 강심 이뇨작용을 일정하게 나타내고 화학요법이나 방사선 치료를 한 후에 적어진 백혈구수를 늘이는 작용을 나타낸다.
데이터처리
- 실험 결과는 student's t-test를 이용하여 p-value를 구하였으며, p<0.05인 경우 *로 표기하였고 p<0.01인 경우 **(##)로 표기하여 유의성을 나타내었다.
이론/모형
- 세포내 tyrosinase 활성은 Martinez-Esparza 등의 방법16)으로 측정하였다. 6-well 배양용기에 B16F10 세포를 8×104 개씩 분주하여 24시간 배양한 후, 여정자 추출물을 처리하고 1시간 후 α-MSH(10 nM)를 처리하였다.
- 세포생존율 측정은 Mosmann의 방법15)에 의하여 실시하였다. 24-well 배양 용기에 B16F10 세포를 5×103 개씩 분주하고 24시간 배양 후 여정자 추출물을 여러 농도로 처리한 다음 37℃, 5% CO2 하에서 3일간 배양하였다.
- 활성산소 소거능은 Blosis 방법18)에 의한 DPPH 라디칼 소거법으로 측정하였다. 즉, 여정자 추출물을 메탄올에 녹여 준비하고, 메탄올에 녹인 0.
성능/효과
- α-MSH 단독 처리군은 대조군에 비해 231.8 ± 16.5%로 멜라닌 합성 양이 증가한 반면 여정자 헥산추출물을 함께 처리한 경우 25 ㎍/㎖에서 203.7 ± 5.0%, 50 ㎍/㎖에서 121.7 ± 6.3%로 현저하게 감소됨을 알 수 있었다(Fig. 5A).
- cAMP 경로를 자극하는 α-MSH를 단독으로 처리했을 때 대조군 보다 108.5%증가한 208.5 ± 3.3%로 tyrosinase 활성이 증가하였다.
- 각각의 분획물들이 B16F10 세포 분화에 어떠한 영향을 미치는지 조사한 결과 헥산추출물과 부탄올, 물 추출물은 세포독성이 없는 것으로 나타났으며, 에틸아세테이트 추출물은 농도의존적인 세포독성을 나타내었다. 또한 각각의 분획물들이 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사한 결과 여정자 헥산 추출물은 농도 의존적으로 세포내 tyrosinase 활성을 억제하였으며, 멜라닌 생성 또한 현저하게 감소시켰다.
- 게다가 α-MSH로 유도된 과색소침착시 증가된 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성 또한 유의성 있게 억제하는 것으로 나타났다.
- 과색소침착시 여정자 분획물이 미치는 영향을 알아보고자 α-MSH로 자극하여 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성을 조사한 결과 여정자 헥산추출물은 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성을 강력하게 억제하였다.
- 대조군 100 ± 3.9%와 비교하여 여정자 메탄올추출물 처리군은 각각 50 ㎍/㎖에서 84.6 ± 1.6%, 그리고 100 ㎍/㎖에서 62.6 ± 13.5%로 tyrosinase 활성이 현저하게 감소하였다(Fig. 2A).
- 대조군을 100 ± 5.7%로 했을 때 12.5, 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖에서 각각의 생존율은 95 ± 0.6%, 105 ±8.6%, 102 ± 9.7%, 82 ± 0.8%, 57 ± 2.0%로 측정되었다(Fig. 1).
- 각각의 분획물들이 B16F10 세포 분화에 어떠한 영향을 미치는지 조사한 결과 헥산추출물과 부탄올, 물 추출물은 세포독성이 없는 것으로 나타났으며, 에틸아세테이트 추출물은 농도의존적인 세포독성을 나타내었다. 또한 각각의 분획물들이 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사한 결과 여정자 헥산 추출물은 농도 의존적으로 세포내 tyrosinase 활성을 억제하였으며, 멜라닌 생성 또한 현저하게 감소시켰다. 그러나 에틸아세테이트, 부탄올, 물 추출물은 tyrosinase 활성이나 멜라닌 생성에 일부 영향을 주었지만 유의성은 없었다.
- 이상의 결과 여정자 메탄올추출물은 멜라닌 합성 억제효과가 있었으며, 이러한 효과를 나타내는 물질이 헥산 분획 층에 존재하는 것으로 생각된다. 또한 부탄올, 에틸아세테이트, 물 추출물은 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 보여주었다. 따라서 여정자 추출물은 미백효과와 함께 항산화효과를 나타내는 천연물질로서 기능성 화장품개발의 우수한 후보 물질이 될 것으로 사료된다.
- 이러한 효과가 어떤 물질에 의해 나타나는 것인지 알아보기 위한 일환으로 용매별 분획을 실시하여 tyrosinase 활성 및 멜라닌 합성 조절과 과색소침착시 미치는 영향 조사한 결과 여정자 헥산추출물이 B16F10 세포의 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 억제하였다. 또한 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물은 항산화 작용이 있는 것으로 나타났다.
- 또한 에틸아세테이트추출물을 처리한 경우 tyrosinase 활성이 α-MSH 단독 처리군의 352.9 ± 14.4%에 비해 10 ㎍/㎖에서 24.9% 감소한 328 ± 13.7%, 12.5 ㎍/㎖에서 39.5% 감소한 313.4 ± 6.2%로 측정되었으나 억제효과가 크지 않았다.
- 또한 여정자 메탄올추출물 50, 100 ㎍/㎖과 α-MSH을 병용 처리하여 멜라닌 양을 측정한 결과 α-MSH 단일처리군은 348.0 ±18.2%로 대조군에 비해 약 3.5배 증가하였고, α-MSH와 여정자 메탄올추출물 50, 100 ㎍/㎖를 병용처리한 군은 각각 281.7 ±11.4%, 141.2 ± 13.7%로 현저하게 감소하였다(Fig. 2B).
- 배양된 세포로부터 멜라닌 함량을 측정한 결과 여정자 헥산추출물은 대조군 100 ± 3.8% 보다 25 ㎍/㎖에서 82.4± 9.0%, 50 ㎍/㎖에서 68.3 ± 1.6%로 멜라닌 합성 양을 감소시켰다(Fig. 5A).
- 본 실험에서 여정자 메탄올추출물은 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 억제하였다. 이러한 효과가 어떤 물질에 의해 나타나는 것인지 알아보기 위한 일환으로 용매별 분획을 실시하여 tyrosinase 활성 및 멜라닌 합성 조절과 과색소침착시 미치는 영향 조사한 결과 여정자 헥산추출물이 B16F10 세포의 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 억제하였다.
- 실험 결과 α-MSH와 여정자 메탄올추출물 50 ㎍/㎖을 병용 처리한 군에서는 유의성이 나타나지 않았지만 100 ㎍/㎖을 병용 처리한 군에서는 α-MSH 단독 처리군(318.1 ± 47.1%)보다 tyrosinase 활성이 현저하게 감소한 194.1 ± 13.7%로 나타났다(Fig. 2A).
- 실험 결과 대조군의 100 ± 11.7%와 비교하여 여정자 메탄올추출물을 처리한 경우 50 ㎍/㎖에서 86.9 ± 6.5%, 그리고 100 ㎍/㎖에서는 66.0 ± 4.9%로 멜라닌 양이 감소하였다.
- 따라서 여정자 분획물의 항산화 효과는 DPPH 라디칼 소거능을 사용하여 평가하였다. 실험 결과 여정자 헥산추출물은 DPPH 라디칼 소거능이 나타나지 않았다. 반면에 에틸아세테이트추출물은 200 ㎍/㎖에서 53.
- 실험 결과 여정자 헥산추출물은 대조군 100 ± 4.2%에 비해 25 ㎍/㎖에서 73.8 ± 3.7%, 50 ㎍/㎖에서 48.1 ± 2.6%로 tyrosinase 활성을 현저하게 억제시켰다.
- 앞선 실험을 통해 여정자 메탄올추출물이 뛰어난 미백효능이 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 미백 효능을 유도하는 물질을 분리하기 위한 일환으로 용매별 분획을 실시하여 효능을 측정하였다.
- 본 연구에서는 여정자 메탄올추출물이 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 여정자 메탄올추출물은 B16F10 세포에서 tyrosinase 활성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 멜라닌 합성 양 또한 현저하게 억제시켰다. 게다가 α-MSH로 유도된 과색소침착시 증가된 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성 또한 유의성 있게 억제하는 것으로 나타났다.
- 3A, C, D). 여정자 헥산추출물, 부탄올추출물과 물추출물은 B16F10 세포독성이 없는 것으로 나타났다. 그러나 에틸아세테이트추출물은 10 ㎍/㎖에서 93.
- 본 실험에서 여정자 메탄올추출물은 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 억제하였다. 이러한 효과가 어떤 물질에 의해 나타나는 것인지 알아보기 위한 일환으로 용매별 분획을 실시하여 tyrosinase 활성 및 멜라닌 합성 조절과 과색소침착시 미치는 영향 조사한 결과 여정자 헥산추출물이 B16F10 세포의 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 억제하였다. 또한 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물은 항산화 작용이 있는 것으로 나타났다.
- 이상의 결과 여정자 메탄올추출물은 멜라닌 합성 억제효과가 있었으며, 이러한 효과를 나타내는 물질이 헥산 분획 층에 존재하는 것으로 생각된다. 또한 부탄올, 에틸아세테이트, 물 추출물은 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 보여주었다.
- 헥산추출물은 환원력이 거의 나타나지 않았으며 물추출물은 농도 증가에 따른 환원력 증가가 크지 않았지만, 다른 분획물은 농도 증가에 따른 환원력이 비례적으로 증가하였다. 환원력은 부탄올추출물에서 가장 강력하였으며, 그 다음이 에틸아세테이트추출물로 나타났다. 이러한 결과는 여정자 메탄올추출물의 부탄올 및 에틸아세테이트 분획에 항산화 물질을 포함하고 있음을 나타내는 것이다.
후속연구
- 또한 부탄올, 에틸아세테이트, 물 추출물은 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 보여주었다. 따라서 여정자 추출물은 미백효과와 함께 항산화효과를 나타내는 천연물질로서 기능성 화장품개발의 우수한 후보 물질이 될 것으로 사료된다.
- 특히 피부는 자외선에 의한 광학적 반응을 통해 활성 산소종을 생성하는데, 이러한 활성 산소종은 피부의 항산화 방어체계의 균형을 붕괴시켜 피부 세포 및 조직의 손상, 피부 탄력 감소와 주름살 및 기미 주근깨 등의 피부 노화, 세포 사멸 등을 초래한다. 이러한 활성 산소종에 대한 방어체계를 향상 시켜준다면 노화를 지연시키고 각종 질병을 예방하는데 기여할 것이다. 본 실험에서는 항산화 물질의 환원력을 측정하는데 가장 널리 쓰이는 DPPH를 사용하여 여정자 분획물을 대상으로 환원력을 평가 하였다.
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