Codonopsis Lanceolata (CL) has been widely used in Oriental medicine for treatment of chronic inflammatory diseases, such as bronchitis, cough, and spasm; however, the mechanism of its anti-inflammatory activity has not been clarified. In this study, therefore, we investigated the inhibitory effect ...
Codonopsis Lanceolata (CL) has been widely used in Oriental medicine for treatment of chronic inflammatory diseases, such as bronchitis, cough, and spasm; however, the mechanism of its anti-inflammatory activity has not been clarified. In this study, therefore, we investigated the inhibitory effect of CL on LPS-induced inflammation. The effect of CL was analyzed by ELISA, RT-PCR and Western blotting in LPS-stimulated RAW264.7 cells. We found that CL suppressed not only the mRNA expression of pre-inflammatory cytokines, inducible nitric oxide synthase (iNOS), and cyclooxygenase (COX)-2, but also the phosphorylation of ERK1/2, JNK1/2 and p38 MAPK. These results suggest that CL exerts an anti-inflammatory effect through the regulation of the mitogen-activated protein kinases (MAPK) pathway, thereby decreasing production of pre-inflammatory cytokines, NO, and PGE2.
Codonopsis Lanceolata (CL) has been widely used in Oriental medicine for treatment of chronic inflammatory diseases, such as bronchitis, cough, and spasm; however, the mechanism of its anti-inflammatory activity has not been clarified. In this study, therefore, we investigated the inhibitory effect of CL on LPS-induced inflammation. The effect of CL was analyzed by ELISA, RT-PCR and Western blotting in LPS-stimulated RAW264.7 cells. We found that CL suppressed not only the mRNA expression of pre-inflammatory cytokines, inducible nitric oxide synthase (iNOS), and cyclooxygenase (COX)-2, but also the phosphorylation of ERK1/2, JNK1/2 and p38 MAPK. These results suggest that CL exerts an anti-inflammatory effect through the regulation of the mitogen-activated protein kinases (MAPK) pathway, thereby decreasing production of pre-inflammatory cytokines, NO, and PGE2.
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문제 정의
본 연구는 RAW264.7, murine macrophage cell line을 사용하여 CL의 항염증효과와 MAPK를 통한 조절 기전을 밝히기 위해 실시하였다.
이에 저자는 LPS로 유도된 RAW264.7 cells의 염증반응에서 CL의 항염증 효과와 세포내 MAPK를 통한 염증발현기전에 미치는 영향을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
새로운 DMEM배지로 교환한 후 CL (2 mg/ml)로 세포에 처리하여 1시간 동안 배양한 후 자극제 LPS를 처리하고 배양하였다. MAPK 활성을 측정하기 위하여 LPS (1 mg/ml)에 10분 동안 expose하였다. 반응이 종료된 후 배지를 제거하고 Cold PBS로 세척한 후 cell lysates는 lysis buffer (10 mM pH 7.
RAW264.7 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 96 well plate (Corning, USA)에 2 × 104 cells/ml의 세포수가 되도록 200 ml씩 분주하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 CL을 농도별 (0, 0.25, 0.5, 1, 2 및 4 mg/ml)로 처리한 후 4시간동안 배양하였다.
12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 pellet은 DEPC (diethyl pyrocarbonate)-DW 20 ml에 녹여 RT-PCR에 사용하였다. RT-PCR kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 45℃에서 30분, 94℃에서 5분 동안 반응시킨 후 94℃에서 30초 동안 denaturation시키고, 55～62℃에서 30초 동안 annealing시킨 다음, 72℃에서 1분동안 extension시키는 cycle을 30～35회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72℃에서 5분 동안 PCR machine(GeneAmp, PCR system 9700, USA)에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose gel에 loading하여 100 V 조건에서 30분 동안 전기영동을 통하여 분석하였다.
1% Tween 20)에 용해된 5% skim milk에 1시간동안 실온에서 blocking한 후 anti-phospho-ERK와 anti-ERK, anti-phospho-JNK와 anti-JNK, anti-phospho-p38과 anti-p38 MAP kinase와 β-actin primary antibody (1 : 1000 dilution)로 4℃에서 overnight 반응한 후 TBST로 3회 washing하고, HRP-conjugated secondary antibody (1 : 1000 dilution)로 1시간동안 실온에서 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후 면역반응성 단백질 밴드는 X-ray films에서 enhanced chemiuminescence regents (ECL) (Amersham, Little Chalfont, UK)을 이용하여 검출하였다.
RT-PCR kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 45℃에서 30분, 94℃에서 5분 동안 반응시킨 후 94℃에서 30초 동안 denaturation시키고, 55～62℃에서 30초 동안 annealing시킨 다음, 72℃에서 1분동안 extension시키는 cycle을 30～35회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72℃에서 5분 동안 PCR machine(GeneAmp, PCR system 9700, USA)에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose gel에 loading하여 100 V 조건에서 30분 동안 전기영동을 통하여 분석하였다. 각각의 primer의 염기서열은 다음과 같다(Table 1).
1). 따라서 이 농도 범위 내의 CL (2 mg/ml)를 사용하여 항 염증효과를 조사하였다.
5, 1, 2 및 4 mg/ml)로 처리한 후 4시간동안 배양하였다. 배양액을 제거 한 후 5 mg/ml의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어 준 후 4시간동안 37℃ incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO를 200 ml씩 분주하여 well에 생성된 formazan이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3 회의 측정으로 그에 대한 평균값과 표준 편차를 구하였다.
40071) (Seoul, Korea)에서 분양받았으며 세포의 배양을 위하여 10% heat-inactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM(Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였고, 2일마다 배지를 교환하였으며, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 계대 배양하였다.
대상 데이터
RAW264.7 cells는 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB, No. 40071) (Seoul, Korea)에서 분양받았으며 세포의 배양을 위하여 10% heat-inactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM(Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였고, 2일마다 배지를 교환하였으며, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 계대 배양하였다.
본 실험에 사용된 CL은 자연으로(제주, 한국)에서 구입한 국내산 더덕 300 g을 증류수로 水洗하여 1 L의 증류수를 加하여 3시간 동안 가열 추출하였다. 추출된 용액을 원심분리를 통하여 상층액을 분리하고, 0.
成績은 SPSS 17.0 K for Windows 통계 프로그램 패키지를 사용하여 평균치 ± 표준오차로 나타내었고 유의수준은 P<0.05로 하였다.
05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Dunett test 검정을 실시하였다.
이론/모형
5, 1, 2, and 4 mg/ml) of CL for 4 h. Cell viability was evaluated using a colorimetric assay based on MTT assay. Data represent the mean± S.
RAW264.7 cells의 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 아무런 처리를 하지 않은 대조군에서 3.
성능/효과
LPS로 자극한 RAW264.7 cells에서 ERK1/2, JNK1/2와 p38의 인산화에 미치는 영향을 살펴본 결과 LPS로 자극한 세포에서 phospho-ERK1/2, phospho-JNK1/2와 phospho-p38의 발현이 현저히 증가하였고 CL (2 mg/ml)을 전처리한 세포에서 발현을 현저히 억제하는 것으로 보아 CL이 ERK1/2, JNK1/2와 p38의 인산화를 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 4).
RAW264.7 cells에서 전구 염증 매개 사이토카인 유전자의 발현에 대해 조사한 결과, LPS로 자극한 세포에서 IL-1b, IL-6와 TNF-a mRNA 발현량이 현저하게 증가하였으며, CL (2 mg/ml)을 전처리한 세포에서 유전자의 발현이 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 2).
RAW264.7 cells에서 전구 염증 매개 효소 유전자의 발현에 대해 조사한 결과, LPS로 자극한 세포에서 iNOS와 COX-2 mRNA의 발현량이 현저하게 증가하였으며, CL (2 mg/ml)을 전처리한 세포에서 유전자의 발현이 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 3).
본 연구에서 MAPK 신호전달경로에 미치는 영향을 조사한 결과 CL이 RAW264.7 cells에서 LPS로 유도된 ERK1/2, JNK1/2와 p38의 인산화를 억제하는 것을 관찰하였다(Fig. 4). 이러한 결과는 CL가 ERK1/2, JNK1/2와 p38 활성화와 관련된 MAPK 신호전달경로의 억제를 통해 항염증 작용을 발휘하는 것으로 보인다.
본 연구에서 RAW264.7 cells의 생존률과 증식을 저해하지 않는 CL의 농도를 조사한 결과 4 mg/ml 이하의 농도에서 CL이 정상세포와 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 1). 따라서 이 농도 범위 내의 CL (2 mg/ml)를 사용하여 항 염증효과를 조사하였다.
본 연구에서 전구 염증 매개 사이토카인 유전자의 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 CL의 전처리가 LPS 자극에 의해 증가된 IL-1b, IL-6와 TNF-a mRNA 발현을 모두 억제하는 것을 알 수 있었다(Fig. 2).
본 연구에서 전구 염증 매개 효소 유전자의 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 CL의 전처리가 iNOS와 COX-2 mRNA 발현을 억제하는 것을 알 수 있었다(Fig. 3).
아무런 처리를 하지 않은 대조군에서 3.14 ± 0.14의 흡광도를 나타내었으며, CL (0.25, 0.5, 1, 2 and 4 mg/ml)의 농도를 처리한 세포에서 각각 3.35 ± 0.07, 3.21 ± 0.29, 3.41 ± 0.03, 3.30 ± 0.15 및 3.29 ± 0.14의 흡광도를 나타내어 모든 농도에서 정상세포에 비해 유의한 영향을 보이지 않았다(Fig. 1).
연구결과를 요약하면 CL가 LPS로 자극한 RAW264.7 cells에서 세포내 ERK1/2, JNK1/2와 p38 활성화와 관련된 MAPK 신호전달경로를 억제하고 전구 염증 매개인자들의 유전자 발현을 억제함으로써 염증반응을 촉발하는 전구 염증 매개인자들의 생산을 감소시킬 것으로 사료된다. 이는 CL이 임상에서 염증질환을 예방하고 초기단계에 효과적으로 제어할 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증은 무엇인가?
염증은 조직손상과 병원균의 침입으로부터 인체를 방어하는 가장 중요한 기전중의 하나로, 정상적인 염증반응은 전구 염증단백질의 발현을 감소시키고 항염증 단백질의 발현을 증가시키며 초기 면역세포 보충을 촉진시키기 위한 혈관의 변화를 복구하는 등의 조절이 일어난다1,2). 그러나 만성염증반응은 궁극적으로 만성피부질환, 류마티스 관절염, 기관지염, 위염, 다발성 경화증, 염증성 장질환 등의 염증질환으로 발전할 수 있으므로 적절한 치료가 요구된다2).
본 실험에 사용된 양유는 어디서 구입하였으며, 어떻게 추출하였는가?
본 실험에 사용된 CL은 자연으로(제주, 한국)에서 구입한 국내산 더덕 300 g을 증류수로 水洗하여 1 L의 증류수를 加하여 3시간 동안 가열 추출하였다. 추출된 용액을 원심분리를 통하여 상층액을 분리하고, 0.
만성염증반응은 어떤 염증질환으로 발전할 수 있는가?
염증은 조직손상과 병원균의 침입으로부터 인체를 방어하는 가장 중요한 기전중의 하나로, 정상적인 염증반응은 전구 염증단백질의 발현을 감소시키고 항염증 단백질의 발현을 증가시키며 초기 면역세포 보충을 촉진시키기 위한 혈관의 변화를 복구하는 등의 조절이 일어난다1,2). 그러나 만성염증반응은 궁극적으로 만성피부질환, 류마티스 관절염, 기관지염, 위염, 다발성 경화증, 염증성 장질환 등의 염증질환으로 발전할 수 있으므로 적절한 치료가 요구된다2).
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