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문제 정의
- , 2010) 등이 확인되어 있으나 김의 항염증 효과와 그에 대한 분자기전에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 염증반응으로 변화되는 세포 내부의 지표물질과 신호단백질을 측정하였으며, 김 추출물이 이에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다.
- 본 연구에서는 PYE가 NF-κB 활성화의 상위 신호 전달 경로인 MAPK 및 Akt 인산화에도 영향을 미치는지를 알아보기 위해 MAPK 및 Akt 신호경로에 관련된 단백질의 발현 수준을 western blot을 통해 확인하였다.
제안 방법
- 6시간 뒤에 PYE (10, 20 µg/mL)가 처리된 SFM으로 교체하고 4시간 후에 1 µg/mL LPS를 20시간 동안 처리한 후 phosphate buffered saline (PBS)용액으로 세척하고 1 mL Lysis buffer [1% Igepal CA-360, 20 mM Tris- HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, 10 µg/mL aprotinin, 10 µg/mL leupeptin, 10 µg/mL pepstatin]로 세포를 취한 다음 12,000 g, 5분동안 원심분리하여 상층액을 취해 Mouse Cytokine Array kit (R&D system Inc., Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 TNF-α와 IL-1β의 단백질 양을 측정하였다.
- Catalase의 측정은 catalase assay kit (Cayman chemical, Ann arbor, MI, USA)를 사용하여 측정하였다. PYE와 LPS가 처리된 RAW 264.
- PYE가 RAW 264.7 대식세포에 LPS를 처리하였을 때 생성되는 superoxide radical (O2-), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxy radical (•OH) 등의 ROS 생성에 미치는 영향을 알아보았다.
- PYE의 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 96-well plate에 96-well plate에 10×104 cells/well에 세포를 동일하게 분주한 후 세포부착을 위하여 24시간 배양하고, phenol red free-DMEM 배지에 12시간을더 배양한 후 PYE를 0, 5, 10, 20, 40 µg/mL씩 농도별로 처리한 후 24시간 배양하였다.
- RAW 264.7 대식세포에 LPS를 처리한 후 PYE를 농도별로 처리하고 mouse cytokines array를 이용하여 각 군별 TNF-α와 IL-1β의 발현정도를 비교하였다.
- RAW 264.7 세포를 5×104 cells/well 농도로 96-well plate에 배양한 후에 PYE를 0, 5, 10, 20, 40 µg/mL로 4시간 처리한 다음 LPS 1 µg/mL농도로 처리하여 24시간 배양시킨 후 배지를 모두 제거하고 PBS에 DCF-DA 첨가, 37℃, 30분 반응한 뒤 excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 530 nm에서 fluorescence microplate reader를 이용하여 활성산소를 확인하였다.
- RAW 264.7 세포에 PYE를 5, 10, 20, 40 µg/mL의 농도로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.
- 단백질 발현의 분석은 RAW 264.7 세포 세포를 100-mm dish에 배양하고 세포가 60-80%정도 증식하면 SFM으로 교체하였다. 6시간 뒤에 PYE (10, 20 µg/mL)가 처리된 SFM으로 교체하고 4시간 후에 1 µg/mL LPS를 20시간 동안 처리한 후 PBS용액으로 세척하고 Lysis buffer [50 mM Tris-hydrochloride (Tris-HCl), pH 7.
- 이렇게 생성된 O2-는 생물체 내에 가지고 있는 SOD에 의해 제거 된다. 대식세포의 LPS 처리는 SOD의 활성을 감소시켰으나 PYE를 LPS와 동시 투여함으로서 SOD의 활성이 대조군 수준으로 회복시켰다. 이것은 PYE 투여가 LPS처리로 인하여 생긴 내독소의 산화적 스트레스에 대한 항산화 작용이 있는 것으로 사료 된다.
- 세포내 활성 산소(ROS)를 측정하기 위하여 활성산소와 반응하면 형광을 발산하는 DCF-DA (2′7′-dichloro-fluorescein diacetate) (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 측정하였다.
- 세포의 SOD측정은 superoxide dismutase assay kit (Cayman chemical, Ann arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다. PYE와 LPS가 처리된 RAW 264.
- 이때 표준 분자량은 dual color marker를 사용하였다. 전기영동 시킨 membrane은 실온에서 1% bovine serum albumin/Tris-buffered saline-Tween 20 로 1시간 30분 동안 blocking 시킨 후 각각의 1차 antibody를 1:1,000으로 희석하여 4℃에서 16시간 반응시키고 2차 antibody를 1:10,000 비율로 희석하여 1시간 30분간 반응시킨 후 Super Signal West Pico Stable Peroxide Solution과 Super Signal West Pico Luminol/ Enhancer solution (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA)을 사용하여 KODAK X-ray film에 감광시켜 현상하여 시각화하였다.
대상 데이터
- 세포는 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, Gaitherberg, MD, USA)과 5% penicillin/streptomyocin (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)배지에 37℃, 5% CO2가 유지되는 incubator에서 배양하였다.
- 실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, Gaitherberg, MD, USA)과 5% penicillin/streptomyocin (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)배지에 37℃, 5% CO2가 유지되는 incubator에서 배양하였다.
- 실험에 사용한 방사무늬 김(Pyropia yezoensis)은 2012년 3월에 기장군에서 구입하였고, 수세한 후 염분을 제거하고 동결건조한 후 마쇄하여 김 분말을 제조하였다. 3구 플라스크에 증류수 1 L를 넣고 김 분말 40 g을 취하여 침지시킨 후 실온에서 4시간 교반하여 추출하였고 추출액을 원심분리(3,500 rpm, 20 min, 4℃)하여 얻어진 상층액에 95% 에탄올을 첨가한 뒤 당을 침전 시켰다.
데이터처리
- Values with different alphabets are significantly different at P<0.05 as analyzed by Duncan’s multiple range test.
- 모든 실험의 분석 결과는 각각의 군별로 평균과 표준편차 (mean±S.D.)로 나타내었으며 실험군 간의 유의성은 SPSS 프로그램(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc. Chicago, IL, USA)을 이용하여 나타내었다.
- 반복 측정에 의한 ANOVA Test로 검증한 후, Duncan's multiple range test를 통하여 P<0.05 수준에서 유의성을 비교하였다.
이론/모형
- LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 생성되는 COX-2, iNOS의 생성에 대한 PYE의 효과를 Western blot으로 분석하였다. Fig.
- PYE가 RAW 264.7 대식세포의 세포생존율에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 MTS assay를 이용하여 분석하였다. RAW 264.
- 7 cells were incubated with PYE for 24 h at the indicated concentration. The cell viability was determined by MTS assay. Each value is expressed as mean±SD in triplicate experiment.
성능/효과
- 이것은 PYE 처리에 의한 NO 생성의 감소가 iNOS 발현 억제에 의한 것임을 의미한다. COX-2의 단백질 발현도 iNOS와 마찬가지로 LPS 처리군에 비해 PYE를 처리한 군에서 COX-2의 단백질 발현 역시 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 염증은 생리적인 보호기전으로 방어기전을 활성화 시키거나 손상을 제한하지만 활성산소의 파괴적 성향으로 인하여 과다 생성되면 세포와 조직의 손상을 유도하고 더 나아가 만성질환 및 노화를 일으킨다(Azard et al.
- Fig. 3 (A)를 보면 LPS 단독 처리 후 대조군 보다 SOD활성이 유의적으로 감소 하였고 PYE를 10, 20 µg/ mL 농도로 처리한 군에서는 LPS단독 처리군보다 유의적으로 SOD 활성이 증가하는 것이 확인되었다.
- Fig. 6에서 LPS처리 후 TNF-α의 발현이 LPS를 처리하지 않은 군보다 급격히 증가하였고 Fig. 6과 동일한 결과로 TNF-α의 발현이 PYE를 20 µg/mL로 처리하였을 때 유의적으로 낮은 수치를 보였으며, 이는 PYE가 TNF-α 발현에 관여하는 것을 보여주고 있다.
- Fig. 6에서 보는 바와 같이 TNF-α의 경우 LPS 단독 처리군에 비해 PYE를 20 µg/mL농도로 처리하였을 때 발현이 감소하였고 IL-1β 역시 LPS 단독 처리군에 비해 PYE를 처리하였을 때 농도유의적으로 감소하는 것이 관찰되었다.
- 본 연구에서는 PYE가 NF-κB 활성화의 상위 신호 전달 경로인 MAPK 및 Akt 인산화에도 영향을 미치는지를 알아보기 위해 MAPK 및 Akt 신호경로에 관련된 단백질의 발현 수준을 western blot을 통해 확인하였다. Fig. 8에서 보는 바와 같이 Akt, p38, JNK, ERK의 활성화 형태인 p-Akt, p-p38, p-JNK, p-ERK는 LPS 처리시 증가하였으나 PYE 처리에 의하여 농도유의적으로 감소하는 것이 관찰되었다. 따라서 PYE가 NF-κB pathway와 MAPK 및 Akt 경로에도 관여함으로써 NF-κB 활성화에 영향을 주는 것으로 보인다.
- 4에서 보는 바와 같다. LPS 처리군은 대조군에 비하여 NO생성이 유의적으로 증가하였고 LPS와 PYE를 병행 처리한 군에서는 NO생성이 LPS 처리군에 비해 농도 유의적으로 감소하는 효과가 관찰되었다.
- 7 세포에 PYE를 5, 10, 20, 40 µg/mL의 농도로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 결과 Fig. 1에서 나타난 바와 같이 PYE는 RAW 264.7 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 7 대식세포에 LPS를 처리하였을 때 생성되는 superoxide radical (O2-), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxy radical (•OH) 등의 ROS 생성에 미치는 영향을 알아보았다. 대조군에 비해 LPS를 단독처리한 군에서 ROS가 유의적으로 증가하였고 PYE를 농도별로 처리한 군은 LPS 대조군에 비해 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 특히 PYE 농도가 높을수록 ROS 농도가 크게 감소되는 것을 볼 수 있었다(Fig.
- 본 연구에서는 Fig. 7에서 보는 바와 같이 LPS처리에 의해 NF-κB와 IκB는 감소하지만 PYE 농도에 따라 증가하는 것을 확인하였고 LPS 처리에 의해 증가되는 IκB 인산화는 PYE처리로 감소하였다.
- , 2006). 본 연구의 결과에서 LPS로 인한 산화적 스트레스에 대해서 PYE가 방어작용으로 SOD, catalase 등의 항산화 효소를 활성화 시켜 세포를 보호하는 효과를 가지는 것으로 사료된다.
- 3 (B)에서 catalase의 효소 활성은 LPS만 처리 했을 때는 유의적으로 감소하였고 PYE 20 µg/mL 처리시 유의적으로 증가하였다. 이 결과 PYE가 LPS를 처리한 대식세포에 대해 항산화작용을 하여 catalase 활성을 증가시켜 ROS 생성을 저해시켰음을 확인할 수 있었다. catalase는 조직 내의 SOD가 효소 반응에 의해 O2-를 제거 한 후 TNF-α, IL-1β, IL-6 과 같은 염증성 인자인 cytokine 생산의 2차 messenger 역할을 하는 H2O2를 물로 분해 시켜 생체를 방어하는 항산화 효소이다(Yasui and Baba.
- 이상의 결과에서 PYE는 IκB 인산화를 억제시켜 NF-κB 활성을 저해하고 또한 NF-κB 활성화의 상위 신호 전달 경로인 MAPK 및 Akt 인산화에도 영향을 주어 NF- κB 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 이를 통해 iNOS단백질과 COX-2 단백질 발현을 억제하여 염증성 매개체인 NO생성 감소와 염증촉진성 cytokines 생성 억제에 연관되어 있는 것으로 나타났으며 항산화 효소인 SOD, catalase의 활성을 증가시켜 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 PYE가 LPS로 자극한 RAW 264.7 대식 세포의 염증발현을 억제하는 것을 확인하였다. 따라서 PYE가 생체의 염증작용을 억제하는 효능을 가지고 있음을 알 수 있다.
- 이상의 결과에서 PYE는 IκB 인산화를 억제시켜 NF-κB 활성을 저해하고 또한 NF-κB 활성화의 상위 신호 전달 경로인 MAPK 및 Akt 인산화에도 영향을 주어 NF- κB 활성을 저해하는 것으로 나타났다.
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