Objectives : To provide the information of efficacy for Sagunja-tang (Sijunzi-tang; SG), it was evaluated the anti-inflammatory effect. SG, a widely used herbal formula in tranditional Korean medicine, has been used to treat for the Boki-invigorating. In many studies, plant-derived anti-inflammatory...
Objectives : To provide the information of efficacy for Sagunja-tang (Sijunzi-tang; SG), it was evaluated the anti-inflammatory effect. SG, a widely used herbal formula in tranditional Korean medicine, has been used to treat for the Boki-invigorating. In many studies, plant-derived anti-inflammatory efficacies have been investigated for their potential inhibitory effects on lipopolysaccharide (LPS)-stimulated macrophages. This study was performed to examine the anti-inflammatory effects of SG extract on LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Methods : The productions of nitric oxide (NO), prostaglandin (PG)$E_2$, interleukin (IL)-6 and tumor necrosis factor (TNF)-$\alpha$ were examined in a macrophage cell line, RAW 264.7 cells, in the presence of the SG extract. RAW 264.7 cells were incubated with LPS $1\;{\mu}g/mL$ and SG extract for 18 hours. The anti-inflammatory activity of SG was investigated by carrageenin-induced paw edema in rats. The paw volume was measured at 0, 2 and 4 hours following carrageenin-induced paw edema in rats. Results : SG extract showed inhibitory effect on $PGE_2$, IL-6 and TNF-$\alpha$ by LPS-stimulated RAW 264.7 cells. But SG extract was not inhibitory effect on NO by LPS-stimulated RAW 264.7 cells. And administration of SG extract (1 g/kg) showed a reduction in carrageenin-induced paw edema on rats. Conclusions : These results suggest that SG extract has anti-inflammatory activities in vitro and in vivo models.
Objectives : To provide the information of efficacy for Sagunja-tang (Sijunzi-tang; SG), it was evaluated the anti-inflammatory effect. SG, a widely used herbal formula in tranditional Korean medicine, has been used to treat for the Boki-invigorating. In many studies, plant-derived anti-inflammatory efficacies have been investigated for their potential inhibitory effects on lipopolysaccharide (LPS)-stimulated macrophages. This study was performed to examine the anti-inflammatory effects of SG extract on LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Methods : The productions of nitric oxide (NO), prostaglandin (PG)$E_2$, interleukin (IL)-6 and tumor necrosis factor (TNF)-$\alpha$ were examined in a macrophage cell line, RAW 264.7 cells, in the presence of the SG extract. RAW 264.7 cells were incubated with LPS $1\;{\mu}g/mL$ and SG extract for 18 hours. The anti-inflammatory activity of SG was investigated by carrageenin-induced paw edema in rats. The paw volume was measured at 0, 2 and 4 hours following carrageenin-induced paw edema in rats. Results : SG extract showed inhibitory effect on $PGE_2$, IL-6 and TNF-$\alpha$ by LPS-stimulated RAW 264.7 cells. But SG extract was not inhibitory effect on NO by LPS-stimulated RAW 264.7 cells. And administration of SG extract (1 g/kg) showed a reduction in carrageenin-induced paw edema on rats. Conclusions : These results suggest that SG extract has anti-inflammatory activities in vitro and in vivo models.
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제안 방법
2.5×105 cells/well (48 well plate) 분주한 RAW 264.7 세포에 LPS (1 μg/mL)로 자극하고, 사군자탕 추출물을 농도별로 (2, 20, 200 μg/mL)로 처리하여 18시간 동안 배양하였다.
2.5×105 cells/well (48 well plate) 분주한 RAW 264.7 세포에 LPS (1 μg/mL)로 자극하고, 사군자탕 추출물을 농도별로 (25, 50, 100, 200 μg/mL)로 처리하여 18시간 동안 배양하였다.
Arachidonic acid를 최종 30 μM이 되도록 처리해 15분간 반응시킨 후 배양 상층액을 취하여 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 PGE2양을 측정하였다.
Carrageenin 유발 족부종 모델에서 사군자탕의 항부종 효과를 검색하기 위하여 7일간 사군자탕 추출물 1g/kg을 경구 투여하고 carrageenin으로 족부종을 유발한 후 2시간 및 4시간째 발의 부피를 측정하였다. 그 결과 정상상태보다 족부종 유발 후 발의 부피가 2시간, 4시간째 각각 28.
RAW 264.7 세포에 사군자탕 추출물 (2, 20, 200 μg/mL)을 처리하고, 24시간동안 배양한 후, CCK-8 방법으로 세포독성을 관찰하였다.
배양 상층액을 취하여 ELISA kit를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 IL-6와 TNF-α양을 측정하였다.
7 세포에 LPS (1 μg/mL)로 자극하고, 사군자탕 추출물을 농도별로 (2, 20, 200 μg/mL)로 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 취하여 Griess reagent를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 nitrite 양을 측정하였다. 양성대조군으로 NOS inhibitor인 NG-methyl-L-arginine (L-NMMA)
본 연구에서는 한방 처방중 補氣의 기본인 四君子湯을 선정하였다. 사군자탕의 면역기능 향상효과 등은 이미 보고되어 있으나 이와 관련된 항염증 효과에 대한 연구는 발표된 바 없었다.
사군자탕 추출물의 NO 생성 억제 능력을 알아보고자 RAW 264.7 cell에 LPS 1 μg/mL를 처리하여 염증반응을 유발시키고, 사군자탕 추출물을 처리하여 NO 생성량을 측정하였다.
사군자탕 추출물의 PGE2 생성 억제 효과를 검색하고자 RAW 264.7 cell에 LPS 1 μg/mL를 처리하여 염증반응을 유발시키고, 사군자탕 추출물을 처리하여 PGE2 생성량을 측정하였다.
산출법은 (족부종 유발 후 발의 부피-족부종 유발 전 발의 부피)/(족부종 유발 전 발의 부피)×100으로 하였다.
생후 4주된 수컷 SD 랫트 (오리엔트바이오, 성남)를 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 12시간 간격으로 명암이 조절되는 한국한의학연구원 동물사육실에서 1주일간 환경에 적응하도록 순화시켰다.
수컷 SD 랫트에게 7일간 사군자탕 추출물 1 g/kg을 경구투여하고, 랫트의 오른쪽 발바닥 피하에 1% carrageenin 생리식염액을 0.1 mL씩 주사하고, 발생한 족부종을 수용적법으로 carrageenin 주사 직전과 주사 2시간 및 4시간 후 plethymometer (Ugo Basile, Italy)를 이용하여 측정하였다.
산출법은 (족부종 유발 후 발의 부피-족부종 유발 전 발의 부피)/(족부종 유발 전 발의 부피)×100으로 하였다. 양성대조군으로 indomethacin 투여군 (10 mg/kg)을 사용하였다.
PGE2는 면역관련 세포의 활성을 유도하여 염증반응을 항진시켜 염증성 사이토카인을 대량 생성하게 한다20). 이러한 과정을 설명하기 위해 생쥐 대식세포인 RAW 264.7에 LPS를 처리하여 염증반응을 유발시키고 사군자탕 추출물을 처리하여 NO와 PGE2를 정량하여 측정하였다. LPS처리로 NO는 정상군의 27배로 증가되었으나 사군자탕은 유의성 있는 NO 억제 효과를 나타내지 않았다.
96 well plate에 5×103 cells/well씩 분주한 세포에 사군자탕 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이어서 CCK-8 용액 10 ㎕를 첨가하여 4시간 동안 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하고 대조군과의 비교를 통해 상대적인 세포 생존율 (% of control)을 계산하였다. 이후의 실험은 세포 독성이 나타나지 않는 최고 농도를 기준으로 실험하였다.
생쥐 대식세포주인 RAW 264.7 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.
생후 4주된 수컷 SD 랫트 (오리엔트바이오, 성남)를 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 12시간 간격으로 명암이 조절되는 한국한의학연구원 동물사육실에서 1주일간 환경에 적응하도록 순화시켰다. 순화기간 중, 육안적으로 관찰하여 건강한 동물을 선별하여 각 군당 5마리씩 총 3군으로 무작위 법에 의하여 실험에 사용하였다.
배양 상층액을 취하여 Griess reagent를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 nitrite 양을 측정하였다. 양성대조군으로 NOS inhibitor인 NG-methyl-L-arginine (L-NMMA)
를 사용하였다.
Arachidonic acid를 최종 30 μM이 되도록 처리해 15분간 반응시킨 후 배양 상층액을 취하여 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 PGE2양을 측정하였다. 양성대조군으로 indomethacin을 사용하였다.
추출액은 sieve를 사용하여 거른 후 동결건조기 (일신 동결건조기 PVTFD100R)를 사용하여 처방 추출물 분말 (수율 22.3%)을 얻었다.
데이터처리
모든 측정 결과는 mean±S.E.M.으로 나타냈으며 실험군 간의 차이는 Student's t-test를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였으며 p<0.05일 경우에 유의성이 있다고 하였다.
이론/모형
본 실험에 사용한 사군자탕의 처방 구성은 <東醫寶鑑>15)에 준하였으며 1첩의 분량은 Table 1과 같다. 처방구성은 人蔘, 白朮, 白茯苓, 甘草를 동량으로 하여 약재를 배합한 후 이의 10배에 해당하는 양의 증류수와 함께 100℃에서 2시간 동안 무압환류 추출법 (추출기: 경서메디텍 COSMOS660)을 이용하여 추출하였다.
사군자탕 추출물의 세포 독성을 알아보기 위해 CCK-8을 제조사의 protocol에 따라 사용하였다. 96 well plate에 5×103 cells/well씩 분주한 세포에 사군자탕 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
에 준하였으며 1첩의 분량은 Table 1과 같다. 처방구성은 人蔘, 白朮, 白茯苓, 甘草를 동량으로 하여 약재를 배합한 후 이의 10배에 해당하는 양의 증류수와 함께 100℃에서 2시간 동안 무압환류 추출법 (추출기: 경서메디텍 COSMOS660)을 이용하여 추출하였다. 추출액은 sieve를 사용하여 거른 후 동결건조기 (일신 동결건조기 PVTFD100R)를 사용하여 처방 추출물 분말 (수율 22.
1 mL씩 주사하고, 발생한 족부종을 수용적법으로 carrageenin 주사 직전과 주사 2시간 및 4시간 후 plethymometer (Ugo Basile, Italy)를 이용하여 측정하였다. 측정한 발의 부피를 이용하여 산출법에 의하여 부종증가율을 계산하였다. 산출법은 (족부종 유발 후 발의 부피-족부종 유발 전 발의 부피)/(족부종 유발 전 발의 부피)×100으로 하였다.
성능/효과
Carrageenin에 의해 염증 매개물질을 생성하는 효소인 NOS와 COX가 발현되고24), 국소에서 생성되는 NO는 혈관 투과성을 증가시켜 부종을 형성하는데 중요한 역할을 한다25). Carrageenin 유발 족부종에서 사군자탕의 항부종 효과를 검색하기 위하여 7일간 사군자탕 추출물 1g/kg을 경구 투여하고 Carrageenin으로 족부종을 유발한 후 2시간 및 4시간에 발의 부피를 측정한 결과 정상상태보다 족부종 유발 후 발의 부피가 2시간 및 4시간에 증가되었고 사군자탕의 투여로 족부종이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.
TNF-α는 사군자탕 추출물 처리군에서 각각 9.3%, 14.3%, 17.7%, 34%로 농도의존적으로 생성 억제효과가 나타났으며(Fig. 2C) 200 μg/mL에서 34%의 TNF-α 생성 억제 효과가 나타났다(p<0.05)
그 결과 LPS 처리로 인하여 PGE2는 정상군의 9.6배로 유발되었고, 사군자탕 추출물을 2, 20, 200 μg/mL 처리한 결과 각각 5.83 ng/mL, 5.33 ng/mL, 4.49 ng/mL로 농도의존적으로 PGE2 생성 억제 효과가 나타났다(Fig. 2A).
그 결과 정상상태보다 족부종 유발 후 발의 부피가 2시간, 4시간째 각각 28.5, 31.8% 증가되었고, 양성대조군으로 사용한 indomethacin (10 mg/kg) 투여군은 족부종 유발군보다 2시간 및 4시간에 각각 45.8%, 53.56%로 감소하였으며, 사군자탕의 투여군은 족부종 유발군보다 2시간 및 4시간에 각각 22.4%, 34.3%로 발의 부피가 감소되었으나 통계적으로 유의한 수치는 아니었다(Fig. 3).
방제학에서 補氣의 기본 처방인 四君子湯은 LPS 처리된 RAW 264.7 세포에서 염증매개 물질인 PGE2, IL-6, TNF-α 생성을 억제하고 carrageenin으로 유발된 부종을 억제하는 항염증 효능이 있는 것으로 나타났다. 따라서 사군자탕은 면역 활성화 효능과 항염증 효과를 나타내므로 염증과 관련된 질환에 적용 가능할 것으로 사료된다.
본 연구에서 사군자탕 추출물을 처리한 그룹에서 농도의존적으로 IL-6와 TNF-α의 생성 억제 효과가 나타났다(Fig. 2B and C).
이에 사군자탕 추출물의 농도의존적인 억제효과를 관찰하기 위해 25, 50, 100, 200 μg/mL에서 재검색한 결과, 각각 8.4%, 13%, 16%, 26%로 농도의존적으로 IL-6 생성 억제 효과가 나타났다(Fig. 2B).
후속연구
7 세포에서 염증매개 물질인 PGE2, IL-6, TNF-α 생성을 억제하고 carrageenin으로 유발된 부종을 억제하는 항염증 효능이 있는 것으로 나타났다. 따라서 사군자탕은 면역 활성화 효능과 항염증 효과를 나타내므로 염증과 관련된 질환에 적용 가능할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증반응이란?
염증반응은 생체의 세포나 조직에 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 및 재생하기 위한 생체방어 반응과정으로, 이 과정에서 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 이 중 대식세포는 자연면역 (innate immunity) 뿐만 아니라 획득면역 (adaptive immunity)에 의해서 유도되는 다양한 면역반응을 매개하여, 병원성 물질로부터 숙주를 방어하고 면역계의 항상성 유지에 중요한 대표적인 면역세포이다1).
본 실험에 사용한 사군자탕의 처방 구성은?
본 실험에 사용한 사군자탕의 처방 구성은 <東醫寶鑑>15)에 준하였으며 1첩의 분량은 Table 1과 같다. 처방구성은 人蔘, 白朮, 白茯苓, 甘草를 동량으로 하여 약재를 배합한 후 이의 10배에 해당하는 양의 증류수와 함께 100℃에서 2시간 동안 무압환류 추출법 (추출기: 경서메디텍 COSMOS660)을 이용하여 추출하였다. 추출액은 sieve를 사용하여 거른 후 동결건조기 (일신 동결건조기 PVTFD100R)를 사용하여 처방 추출물 분말 ( 율 22.
대식세포는 어떤 역할을 하는 면역세포인가?
염증반응은 생체의 세포나 조직에 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 및 재생하기 위한 생체방어 반응과정으로, 이 과정에서 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 이 중 대식세포는 자연면역 (innate immunity) 뿐만 아니라 획득면역 (adaptive immunity)에 의해서 유도되는 다양한 면역반응을 매개하여, 병원성 물질로부터 숙주를 방어하고 면역계의 항상성 유지에 중요한 대표적인 면역세포이다1). 활성화된 대식세포는 interleukin (IL)-1β, IL-6 그리고 tumor necrosis factor (TNF)-α, nitric oxide (NO), prostaglandin (PG)E2 등과 같은 염증 매개자들을 분비하여 강력한 염증반응을 일으킨다2-3).
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