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문제 정의
- 본 연구는 구강 함수제 개발을 위해, 임상에서 빈용 되는 한약재 중에 구강 함수제로서 효과가 있을 것으로 기대되는 약재를 탐색하여 구취억제의 효능과 그 기전을 확인하고자 하였다.
- 이 과정을 통해 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴이 구취제거용 구강 함수제로써의 효능이 기대되는 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 균주 액의 100 μl를 tryptic soy broth에 yeast extract (1 mg/ml), hemin (5 μg/ml), vitamin K (0.2 μg/ml), micro agar (1.5%), 면양적혈구 (sheep blood)가 첨가된 고체배지에 무균적으로 도말하고 37℃ 혐기 배양기에서 48시간 배양하여 colony의 형성 여부를 관찰하였다.
- Halimeter® 주입구에 10cm 정도의 튜브를 부착하여 각 배양 혼합물의 head space에 삽입한 후 측정하였다.
- In vivo 연구로, cysteine 가글을 통해 구취를 유발한 후 무처치 시 시간 경과에 따른 VSC 농도 변화를 측정하였고, 한약재와 가그린 민트®를 가글하였을 때와 비교하였다.
- intermedia ATCC 25611을 Half-strength brain heart infusion(BHI; BD)와 yeast extract (5 mg/ml ; Duchefa Biochemie, Netherlands), hemin (5 μl/ml), vitamin K (0.2 μg/ml)가 첨가된 액체배지에서 12시간동안 37℃의 조건으로 혐기적 (N2 85%, H2 10%, CO2 5%) 배양을 하였다.
- 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴의 2% 수용액 (v/v) 및 가그린 민트® 4 ml와 0.2 M potassium phosphate buffer (PPB) 1 ml를 내용량 50 ml의 vial에 넣고 pH를 7.5로 조절하였다.
- 각 실험의 시간대별로 대조군의 측정치와 비교하여 VSC 농도가 기저치의 몇 배로 상승하였는지 비교하였다(Fig. 1).
- 각각의 액체배지 10 ml에 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴의 농도가 0.05, 0.1, 0.5, 1 및 2%가 되도록 약재건조 분말을 첨가한 후 121℃에서 15분간 멸균하였다. 혐기적으로 12시간 배양한 실험균주를 각각 한약재가 첨가되지 않은 대조군배지에 접종하여 분광광도계 (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, USA)로 600 nm에서 흡광도가 0.
- 구강내 구취 유발 원인균에 대해 항균작용이 있는 구강 함수제 개발을 위해 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴의 항균효과를 확인하였고, gas chromatography(GC)를 이용한 실험과 타액 침전물 모델을 이용해 구취억제효과를 확인하였으며, 임상실험을 통해 cysteine으로 구취를 유발한 후 이에 대한 억제 효과를 확인하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 구취 억제 효과 관찰을 위한 양성 대조군으로 동아제약 주식회사의 가그린 민트®를 사용하였다 .
- 또한 gas chromatography (GC)를 이용하여 구취와 관련된 주요 VSC 중 하나인 methyl mercaptan에 대한 한약재의 deodorizing activity를 측정하였으며, salivary sediment system을 이용해서 전타액에서 기인한 구취에 대한 억제 정도를 평가하였다.
- 먼저 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴의 구강 함수제로서의 역할을 확인하기 위해 실험 대상 약물이 구취를 유발하는 것으로 알려진 미생물에 대해 항균효과가 있는지를 확인하였다.
- 먼저 대조군은 구취 유발을 위해 3 mM의 cysteine 용액 10 ml를 30초간 가글한 후, 다른 처치 없이 4분 30초간 안정한 후를 기준점 (0분)으로 체크하고, 4, 8, 12, 16, 20, 40 및 60분 경과 시간에 VSC의 농도를 측정하여, 구강내의 시간에 따른 자연적인 변화를 관찰하였다.
- 먼저 이들 한약재가 구취와 관련된 것으로 알려진 주요 구강 내 병원성 미생물인 Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), Prevotella intermidia (Pr. intermedia)13)에 대하여 항균효과가 있는지 확인하였고, 약재에 노출된 시간에 따른 균주의 변화를 관찰하였다.
- 모든 개별 실험은 2명의 실험참가자가 3회씩 반복 측정 하였고, 실험에서 얻어진 결과인 VSC의 농도를, 각 실험에 앞서 측정해둔 baseline으로 나누어 VSC relative ratio로 표시하였다.
- 본 실험의 방법은 Kleinberg 등15)의 cysteine challenge test를 본 연구에 적합하게 수정하여 이용하였고, 실험은 경희의료원 임상시험 심사위원회의 심사를 거쳐 피험자로부터 동의서를 얻은 후 실시되었다.
- 실험군은 cysteine 용액으로 가글하는 과정까지는 대조군과 동일하게 하고, 4분안정 뒤 黃芩2% 수용액 (v/v) 10 ml로 30초간 가글하고, 이 때를 기준점(0분)으로 하여 앞서와 동일한 경과시간에 구강내의 VSC 농도를 측정하였다.
- 여기에 methyl mercaptan 표준액 (1 μg/ml) 1 ml를 가하여 즉시 실리콘 캡으로 밀봉하여 vortex mixer로 5초간 교반하고 37℃에서 6분간 배양한 후, syringe를 이용하여 vial의 headspace에서 유리된 methyl mercaptan 200 μl를 취하여 불꽃광전감지기 (flame photometric detector; FPD)가 장착된 가스 분석기 (gas chromatography; GC)에 주입하여 methyl mercaptan 함량을 분석하였다.
- 여기에 실험군은 각각 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴의 2% 수용액 (v/v) 250 μl와 가그린 민트® 250μl를 넣었고, 대조군에는 무균의 증류수 250 μl를 넣었다.
- 측정치는 배양시작점부터 0, 15, 30 min과 1, 2, 3, 4 및 24 hr에 측정하였다.
- 5, 1 및 2%가 되도록 약재건조 분말을 첨가한 후 121℃에서 15분간 멸균하였다. 혐기적으로 12시간 배양한 실험균주를 각각 한약재가 첨가되지 않은 대조군배지에 접종하여 분광광도계 (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, USA)로 600 nm에서 흡광도가 0.1이 되도록 하였다. 대조군배지에서 흡광도 0.
- 희석된 균액 100 μl를 고체배지에 고르게 퍼지도록 유리막대로 도말하여 혐기적으로 배양하면서, 0, 0.5, 5, 24 및 48 hr에 형성된 집락수를 관찰하여, 시간에 따른 생균수의 변화를 정량적으로 측정하였다.
대상 데이터
- 2명의 실험참가자는 최근 6개월 이내 특별한 투약 경력이 없는 건강한 사람으로 실험 전 3시간 동안 음식물 섭취 및 양치질과 같은 일체의 구강위생이 제한되었다.
- 경희의료원 한방병원 약제과에서 품질관리가 이루어진 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴을 구입하여 사용하였다(Table 1). 각 한약재 용량 500 g 당 2.
- 문헌 검색을 통해, 기존에 항균작용이 우수하다고 보고되고, 독성이 없으며, 임상에서 쉽게 이용이 가능한 한약재를 선별하였고20,21), 구취억제를 위한 내복 처방 혹은 함수제에 다빈도로 이용되었거나22,23), 초보적인 연구에서 구취억제 효과가 있을 것으로 보고된24) 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴을 실험 대상 약물로 선정하였다.
- 배양혼합물은 각각 750 μl로 준비하였다.
- 본 연구에서는 구강 내 구취의 원인균들에 대한 항균작용이 있는 구강 함수제의 개발을 위해, 임상에서 빈용 되는 한약재 중에 기존 연구에서 여러 병원성 미생물에 항균효과가 있음이 알려져 있고, 구취억제를 위한 내복 처방 혹은 함수제에 이용된 바 있는 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴을 실험대상 약물로 선정하였다.
- 실험은 경희의료원 임상시험 심사위원회의 심사를 거쳐 피험자로부터 동의를 얻은 후 실시되었고, 타액은 특별한 투약 경력이 없는 건강인 2인에게서 채취되어 모아졌다.
- 혼합된 박테리아로 구성된 타액 내 침전물을 사용하는 실험을 위하여 파라핀 왁스로 자극하여 전타액을 수집하였다. 실험은 경희의료원 임상시험 심사위원회의 심사를 거쳐 피험자로부터 동의를 얻은 후 실시되었고, 타액은 특별한 투약 경력이 없는 건강인 2인에게서 채취되어 모아졌다.
데이터처리
- Salivary sediment system은 Wilcoxon signed rank tests를 이용하였고, Halimeter®를 이용한 임상실험은 Mann-Whitney test를 이용하였다.
이론/모형
- Tokita14 등의 방법을 이용하여 냄새 제거 활성을 측정하였다.
성능/효과
- intermedia에 대해 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴모두 일정한 항균효과가 있었다.
- 5%, 厚朴과 牧丹皮 1% 농도에서 살균되었다. 1% 농도의 약물에 노출되었을 때, 牧丹皮는 5시간, 黃芩, 黃柏, 厚朴은 24시간 경과 후 모든 균이 사멸되었다. 이 결과로 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴이 구취발생과 관련된 주요 균주에 대해 적절한 항균력을 담보하는 한약재 선택의 후보임을 알 수 있다.
- 2. methyl mercaptan의 활성 억제를 통한 구취감소효과는 牧丹皮와 厚朴이 100%, 黃芩82.22%, 黃柏66.60%로 가그린 민트® 40.54%에 비해 우수하였다.
- 3. 타액 침전물 모델을 이용한 실험에서는 黃柏, 牧丹皮만 유의한 억제효과가 있었고, 黃芩, 厚朴, 가그린 민트®에서는 유의성이 없었다.
- 4. 임상실험에서는 목단피는 40분까지, 黃柏과 厚朴은 60분까지 모든 측정시간에서 대조군에 비해 유의한 구취억제 효과가 있었다.
- Salivary sediment system의 방법으로 타액에 혼합되어 있는 세균이, 탈락된 상피세포나 cysteine 등을 분해하는 과정에서 생성된 악취에 대한 한약재의 억제작용을 살펴 본 결과, 黃柏과 牧丹皮가 유의한 억제작용을 보였고, 黃芩과 厚朴은 유의성이 없었다.
- cysteine 가글 후 가그린 민트®로 가글한 군은 대조군에 비해 모든 시간대에서 구취를 감소시키는 유의한 효과가 없었으며, 12, 16, 20분 측정시점에서는 오히려 대조군 보다 더 높게 측정되는 결과를 보였다.
- methyl mercaptan에 대한 냄새 제거 활성은, 가그린 민트®는 40.54%인데 비하여, 厚朴과 牧丹皮는 각각 100%로 우수한 냄새 제거 활성을 나타내었고, 黃芩은 82.22%, 黃柏은 66.60% 였다(Fig. 4).
- methyl mercaptan에 대해, 다른 세 가지 약재에 비해 상대적으로 낮은 66%정도의 억제력을 나타낸 黃柏은 전타액에서 기인한 구취에 대해서는 유의한 억제효과를 보였고 임상실험에서도 1시간까지 유지되는 특징을 보였다.
- 牧丹皮는 methyl mercaptan에 대해서 100% 억제하였고, 전타액에서 활성화된 구취에 대해서도 유의한 억제효과가 있었으며, 임상실험에서는 40분 정도까지 유의한 억제효과를 보였다.
- 黃芩을 가글한 경우에는 0, 4, 8, 20, 60분 경과 시점에서는 대조군에 비해 유의한 억제 효과가 있었고, 12, 16, 40분에서는 측정값이 대조군보다 낮았으나 유의한 차이는 없었다.
- 마지막으로 methyl mercaptan에 대해서 82% 정도 억제효과를 보인 黃芩은 전타액에서 유래된 구취에 대해서 유의한 효과가 없었고, 임상실험에서 구취억제효과가 1시간에서도 유지되었지만, 중간 과정의 측정 시간대에서 유의한 차이를 보이지 않는 경우도 있었다.
- 실험에 이용한 한약재인 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴은 주요 구취유발 원인균인 P. gingivalis와 Pr.intermedia 에 대해 우수한 항균효과를 보였으며, 이는 이들 한약재가 적절한 항균력을 가진 구강 함수제로 개발가능성이 있음을 보여준다. 牧丹皮는 methyl mercaptan에 대해서 100% 억제하였고, 전타액에서 활성화된 구취에 대해서도 유의한 억제효과가 있었으며, 임상실험에서는 40분 정도까지 유의한 억제효과를 보였다.
- 이 결과로 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴이 구취발생과 관련된 주요 균주에 대해 적절한 항균력을 담보하는 한약재 선택의 후보임을 알 수 있다.
- 이와 같이 실험에 이용된 한약재들은 모두 일정정도의 항균력이 있으면서, VSC를 비롯한 냄새성분을 화학적으로 제거하는 능력이 있음이 확인되었고, 약간의 차이가 있지만 40분～1시간 정도에서 억제효과가 지속되는 결과를 보였다.
- 전타액의 원심 분리 후 얻어진 침전물 중의 세균과 첨가된 cysteine의 대사과정에서 발생하는 VSC에 대하여 黃柏과 牧丹皮는 p<.05의 유의한 억제효과를 나타내었고 (Fig. 6,7), 黃芩과 厚朴 및 가그린 민트®의 경우 유의한 차이가 없었다(Fig. 5,8,9).
- 즉 구취의 원인이 methyl mercaptan인 경우 牧丹皮와 厚朴이 다소 우위의 억제력을 가지고, 黃柏은 methyl mercaptan에 대해서는 다른 세 약재보다 억제효과가 덜하지만, 전타액에서 유래된 구취 및 임상실험에서 유의한 억제효과가 보인 것으로 보아, hydrogen sulfide나 다른 요인에 의한 구취에 대해 억제 효과가 있을 것으로 생각된다.
- 한약재 1%를 첨가하여 배양시간에 따른 균주의 변화를 관찰한 결과 厚朴은 5시간 경과부터 colony가 관찰되지 않았고, 黃芩, 黃柏은 24시간에, 牧丹皮는 48시간에 모두 사멸하였다(Table 2, Fig. 2).
후속연구
- 黃芩, 黃柏, 牧丹皮, 厚朴추출물은 구강내 구취 유발 원인균에 대해 일정한 항균력을 담보하면서 화학합성 함수액보다 우수한 구취억제작용을 보였으므로 임상에서 활용가능 할 것으로 판단된다.
- 그러나 실제 함수제의 경우 30초～1분 정도 노출되는 것이므로, 적정한 함수 시간 및 함수제의 이용 간격에 따른 효과에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 향후 추가적인 실험을 통해 농도별 구취억제효과에 대한 연구, 복합처방과 개별약제 사용 시의 구취 억제효과에 대한 비교연구가 필요할 것을 생각된다.
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