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문제 정의
- 그러나 위와 같이 일부 용매와 S. mutans 만을 이용하여 표고버섯 추출액에 대한 항균작용 관련 활성만이 지금까지 보고되었기 때문에, 본 연구에서는 다양한 생리활성물질을 가진 표고버섯을 여러 용매로 추출한 이후, 치면에 점착성이 강한 세균막을 형성하여 치아우식증 유발에 관여하는 S. mutans, Streptococcus anginosus(S. anginosus), Streptococcus ratti(S. ratti), Streptococcus sanguinis(S. sanguinis), S. sobrinus, Actinomyces viscosus(A. viscosus), Actinomyces naeslundii(A. naeslundii), 구강의 혀나 타액에 존재하는 정상 상재균으로 치과 치료 이후 병원성 감염을 유발시키는 Staphylococcus aureus(S. aureus), 치주질환에 관여하는 A. actinomycetemcomitans 등에 적용하여, 표고버섯의 구강세균에 대한 생장 억제 효과를 탐색하고자 한다.
- 이러한 구강 내 세균의 생장을 억제하여 구강질환을 치료하고자 chlorhexidine와 같은 항생제를 이용하였으나, 항생제의 내성과 부작용으로 항생제를 대체할 수 있는 천연 항생제의 연구가 활발히 진행되고 있다4-9). 이에 본 연구는 S. mutans을 포함한 9종의 치아우식증 유발균 및 치주질환 병원균 등에 적용하여 표고버섯의 9종의 구강세균에 대한 항균활성 및 A. viscosus에 대한 생장 억제 효과를 알아보았다.
제안 방법
- 0∼12시간까지 배양하면서 600 nm에서 흡광도를 측정(MECASYS, Daejeon, Korea)하여 표고버섯 추출물의 구강세균 생장 저해효과를 확인하였다.
- Acetone, ethanol 및 ethyl acetate 등의 유기용매로 추출된 표고버섯 추출물의 구강세균에 대한 항균효과를 디스크 확산법을 이용하여 9종의 구강세균에 대하여 조사하였으며, 얻어진 결과를 [Table 2]에 나타내었다. 표고버섯의 ethanol 추출물에서는 모든 실험 균주에 대하여 항균활성이 관찰되지 않았으나, acetone 및 ethyl acetate 추출물에서는 9종의 구강세균 중 S.
- 균배양액 100 μl에 추출물을 2-fold 단계 희석한 추출물을 주입하여 37°C CO2 incubator에서 24시간 배양 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하고 생육 저해율을 다음 식으로 확인하였다.
- 5 mg/disc의 농도로 paper disc(Φ 6 mm)에 30 μl씩 흡수 건조하여, 도말한 plate 위에 밀착시킨 다음, 37°C CO2 incubator에서 24시간 배양하여 disc 주위의 clear zone 생성 유무를 확인하고 그 크기를 측정하였다. 대조군으로 DMSO를 사용하였으며, 각각의 실험은 3회 반복 측정하였다.
- 디스크 확산법을 통해 우수한 항균성을 보인 acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물의 A. viscosus 균에 대한 항균 활성을 MIC를 측정하여 추가 확인하였다. 표고버섯 acetone 및 ethyl acetate 추출물의 A.
- 디스크 확산법을 통해 표고버섯 acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물의 항균활성을 확인하였으며, 이를 바탕으로 acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물이 A. viscosus 균의 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 표고버섯 acetone 추출물 및 ethyl acetate 추출물 등을 25.
- 또한, 생육 저해율을 통해 균의 증식이 없거나 적어도 90% 저해율을 보이는 농도를 MIC(최소생육저해농도, Minimum Inhibition Concentration)로 설정하였다.
- 배양된 약 1.5×106 세균을 미리 준비한 agar plate에 도말한 후, 각 추출물을 1.5 mg/disc의 농도로 paper disc(Φ 6 mm)에 30 μl씩 흡수 건조하여, 도말한 plate 위에 밀착시킨 다음, 37°C CO2 incubator에서 24시간 배양하여 disc 주위의 clear zone 생성 유무를 확인하고 그 크기를 측정하였다.
- 본 연구에서는 표고버섯을 acetone, ethyl acetate 및 ethanol 등의 용매로 추출하여 9종의 구강세균에 대한 항균 활성과 생육저해 효과를 조사한 결과는 다음과 같다.
- viscosus 균에 대한 항균 활성을 MIC를 측정하여 추가 확인하였다. 표고버섯 acetone 및 ethyl acetate 추출물의 A. viscosus에 대한 생육 저해율을 24시간 후 측정하였으며, 그 결과를 [Fig. 1]과 [Fig. 2]에 각각 나타내었다. Ethyl acetate 추출물은 25 mg/ml에서 최고 90%, 12.
- viscosus 균의 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 표고버섯 acetone 추출물 및 ethyl acetate 추출물 등을 25.0 mg/ml, 12.5 mg/ml, 6.25 mg/ml, 3.125 mg/ml, 1.56 mg/ml, 0.78 mg/ml, 0.39 mg/ml, 0.19 mg/ml, 0.09 mg/ml, 및 0.048 mg/ml 등의 최종농도로 희석 첨가하여 배양하면서 12시간 동안 흡광도를 측정하였으며, 이를 통해 A. viscosus의 생장저해 효과를 확인하였다. 그 결과를 [Table 3]과 [Table 4]에 각각 나타내었다.
- 05). 표고버섯 ethyl acetate 추출물에서 MIC는 생육 저해율을 통해 24시간 배양 후, 균의 증식이 거의 나타나지 않은 25 mg/ml로 결정하였으며, 생육저해곡선을 통해 이를 확인하였다. Acetone 추출물에서 최소생육저해농도인 MIC는 >25 mg/ml로 조사되었다.
대상 데이터
- S. sobrinus, S. aureus, S. mutans, S. ratti, S. sanguinis 등은 Brain-Heart Infusion(BHI, Difco, Detroit, MI, USA)배지에, A. viscosus, A. naeslundii, S. anginosus, 및 A. actinomycetemcomitans 등은 Trypticase Soy Broth(TSB, BD Co., USA) 배지에 접종하여 24시간 동안 37℃ 혐기성 배양기(5% CO2)에서 배양하였다.
- 동일한 방법으로 ethyl acetate와 ethanol 추출물을 각각 제조하였다. 농축된 추출물은 DMSO(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 녹여 50 mg/ml의 농도로 일정하게 맞추어 시료로 사용하였다.
- 실험에 사용된 식용 표고버섯은 일반 시중에서 구할 수 있는 생 버섯을 자연건조하고 분쇄하여 사용하였다. 분쇄하여 준비한 표고버섯 가루로부터 acetone, ethyl acetate 그리고 ethanol 등 3가지 유기용매로 추출물을 제조하였다. 표고버섯 가루 40 g에 acetone 400 ml을 넣고 150 rpm에서 72시간 동안 교반하여 추출하였으며, 이를 여과하고 rotary evaporator(EYELA A-1000S, Tokyo Rikakikai Co, Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 acetone을 모두 제거하였다.
- 실험에 사용된 균주는 S. sobrinus(KCTC 3308), S. aureus (KCTC1927), S. mutans(KCTC3065), S. ratti(KCTC3655), S. sanguinis(KCTC3284), A. viscosus(KCTC5531), A. naeslundii(KCTC5525), S. anginosus(KCTC3983), 및 A. actinomycetemcomitans(KCTC 3698) 등 구강세균을 대표하는 9종의 균주로서, 모두 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양 받아 사용하였다[Table 1]. S.
- 실험에 사용된 식용 표고버섯은 일반 시중에서 구할 수 있는 생 버섯을 자연건조하고 분쇄하여 사용하였다. 분쇄하여 준비한 표고버섯 가루로부터 acetone, ethyl acetate 그리고 ethanol 등 3가지 유기용매로 추출물을 제조하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복 실험하여 평균표준오차로 표시하였으며, 자료의 통계분석처리는 PASW Statistics 18.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 ANOVA test와 Tukey's multiple comparison 등에서 p<0.05 수준으로 그 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- A. viscosus 균의 생장에 미치는 표고버섯 추출물의 영향을 조사하기 위해 액체배지 희석법(broth dilution method)을 실시하였다. 균배양액을 흡광도가 0.
- A. viscosus에 대한 표고버섯 추출물의 농도별 생육 저해율은 액체배지 희석법으로 측정하였다. 균배양액 100 μl에 추출물을 2-fold 단계 희석한 추출물을 주입하여 37°C CO2 incubator에서 24시간 배양 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하고 생육 저해율을 다음 식으로 확인하였다.
- 표고버섯 추출물의 항균활성은 디스크 확산법(disc diffusion method)으로 측정하였으며22), 균배양액은 흡광도를 0.1로 맞추어 0.5 McFarland 표준 탁도(약 1.0×108 CFU/ml)로 조절한 뒤, 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 1. 디스크 확산법을 통해서 표고버섯의 acetone 추출물에서는 A. viscosus와 A. actinomycetemcomitans 등에서 항균활성을 나타내었고, ethyl acetate 추출물에서는 S. aureus, S. sanguinis, A. viscosus, A. actinomycetemcomitans 등에서 생육저해환을 확인하였으며, A. viscosus와 A. actinomycetemcomitans 등에 대해 상대적으로 다소 높은 항균활성을 보였다.
- 2. 표고버섯의 acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물에서 다소 강한 활성을 나타낸 A. viscosus에 대해 표고버섯 추출물의 시간 경과에 따라 균 증식 억제 효과를 조사한 결과, acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물은 12.5 mg/ml와 25.0 mg/ml 농도에서 대수기에 A. viscosus에 대한 강한 생육저해 작용을 나타내었다.
- 3. 표고버섯 acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물 등에서 각각 77%(12.5 mg/ml), 90%(25 mg/ml)로 높은 생육 저해율을 나타내었다. 생육 저해율을 통해 최소 생육 저해농도(MIC)는 ethyl acetate 추출물에서 25 mg/ml, acetone 추출물에서 >25 mg/ml 등으로 조사되었다.
- mutans에 대한 항균활성을 확인할 수 없었으며, ethanol 추출물은 9종의 구강균에 대해 활성을 보이지 않았다. Acetone 추출물에서 A. actinomycetemcomitans과 A. viscosus에 대해 억제환을 확인하였고 ethyl acetate 추출물에서는 S. aureus, S. sanguinis, A. actinomycetemcomitans, A. viscosus에 대해 항균활성을 나타내었다. 일반적으로 건조방법에 따라 표고버섯의 항산화능이 달라진다는 일부 보고와 같이23), 본 연구의 항균활성 또한 수확시기 및 건조방법 등의 차이로 인해 S.
- 일반적으로 낮은 농도의 추출물에서도 대조군에 비해 균의 생육이 저해되지만, 시간이 경과함에 따라 생육저해 효과보다는 추출물의 기타 성분이 균의 생육을 촉진시킨다는 보고26-28)와 같이, 본 연구에서도 일정 농도 범위에서 균의 생육을 촉진시키는 추출물의 미지 성분이 포함된 것으로 생각된다. Acetone 추출물은 6.25 mg/ml 이상의 농도에서 다소 균의 증식이 관찰되었으나, 12.5 mg/ml와 25.0 mg/ml 농도의 추출물에서 강한 생육저해 효과를 나타내었으며, 특히 25.0 mg/ml 추출물 농도보다 낮은 12.5 mg/ml 농도에서 증식 억제 효과가 다소 높게 나타난 것은 농도가 높은 표고버섯 추출물의 경우, 여러 색을 띠는 성분들이 증가함으로써 흡광도 측정을 방해하여 나타난 결과로 생각된다.
- Ethyl acetate 추출물과 비슷하게 농도가 낮아지면서 생육 저해율이 -105%까지 감소하다가 더 낮은 농도에서는 다시 상승하는 현상을 확인할 수 있었다(p<0.05).
- 7 mm)에 대해 다소 좋은 항균활성을 나타내었다. Ethyl acetate 추출물에서는 항균효과가 크지는 않았지만, S. aureus(7.3 mm), S. sanguinis(7.3 mm), A. actinomycetemcomitans (8.3 mm), A. viscosus(9.0 mm) 순으로 항균활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 표고버섯의 acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물은 A.
- Ethyl acetate 추출물은 25 mg/ml에서 최고 90%, 12.5 mg/ml에서 74%의 생육 저해율을 보였으며, 농도가 점차 낮아짐에 따라 생육 저해율 또한 급격히 감소되어 6.25 mg/ml에서는 -110%까지 감소하다가 더 농도가 낮아지면서 상승하여 0.09 mg/ml 농도에서는 20 %의 저해율을 나타내었다(p<0.05).
- viscosus의 생육억제에 강한 효과가 있음을 알 수 있었다. Ethyl acetate 추출물은 대수기에 균의 증식을 억제하는 효과를 보였으며, 낮은 농도에서는 다소 약한 생육저해 효과를 나타내었으나, 추출물의 농도가 6.25 mg/ml 보다 더 클수록 대조군보다 균의 증식 억제 효과가 크게 증가되었다. 표고버섯 acetone 추출물에서는 낮은 농도에서 균의 증식이 대조군보다 약간 증가하였으며 12.
- 표고버섯의 ethyl acetate 추출물을 첨가하지 않은 대조군에서 균이 완만하게 증식되었다. Ethyl acetate 추출물은 배양 초기에는 균의 증식이 다소 증가하여 균의 생육저해 효과를 보이지 않았으나, 25.0 mg/ml와 12.5 mg/ml 경우에는 배양 후, 2시간부터 50% 이상의 생육억제 효과를 확인할 수 있었으며, 25.0 mg/ml 농도에서는 전체 배양시간인 12시간 동안 균의 증식이 거의 발생되지 않았으므로 표고버섯의 ethyl acetate 추출물이 25.0mg/ml에서 A. viscosus의 생육억제에 강한 효과가 있음을 알 수 있었다. Ethyl acetate 추출물은 대수기에 균의 증식을 억제하는 효과를 보였으며, 낮은 농도에서는 다소 약한 생육저해 효과를 나타내었으나, 추출물의 농도가 6.
- S. mutans에 대한 표고버섯 추출물의 항균활성에 관한 연구는 이미 보고되어 있으나20-21), 결과적으로 본 연구에서 디스크 확산법을 통하여 표고버섯의 acetone 및 ethyl acetate 추출물에서 S. aureus, S. sanguinis, A. viscosus, A. actinomycetemcomitans 및 A. viscosus에 대한 항균활성과 A. viscosus의 생육저해 효과를 추가로 확인하였으며, 이는 표고버섯 추출물이 치아우식증 뿐만 아니라, 치주염을 유발하는 세균에도 항균효과가 있음을 보여주는 의미 있는 결과이다. 따라서 앞으로 표고버섯으로부터 구강세균의 항균효과를 나타내는 물질을 확인하여야 할 것이며, 용매에 따라 추출되는 생리활성 관련 물질을 분리 및 분석하는 연구 등이 수행되어야 할 것이다.
- 결과적으로, 표고버섯의 acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물 등이 S. aureus, S. sanguinis, A. viscosus, A. actinomycetemcomitans, A. viscosus에 대한 생육저해환 및 A. viscosus에 대한 균의 증식 억제 효과(MIC)가 있음을 확인함으로써 표고버섯 acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물이 치아우식증과 치주질환 등에 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 0 mg/ml에서 균의 증식을 크게 억제하였다. 또한 25.0 mg/ml 농도에서 A. viscosus의 증식이 거의 발생되지 않는 것으로 나타나 MIC 결과와 동일한 양상을 보여 주었으며, 표고버섯의 ethyl acetate 추출물이 높은 농도에서 A. viscosus에 대해 강한 생육저해 효과를 확인할 수 있었다.
- mutans에 대하여 항균효과를 나타내지만, ethyl acetate 추출물에서는 항균활성이 없다고 보고하였다. 본 실험에서 확인한 결과, acetone, ethanol, ethyl acetate 추출물 모두에서 S. mutans에 대한 항균활성을 확인할 수 없었으며, ethanol 추출물은 9종의 구강균에 대해 활성을 보이지 않았다. Acetone 추출물에서 A.
- 본 연구에서 시간 경과에 따른 균의 증식을 확인한 결과에 의하면, acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물 모두 낮은 농도에서 시간 경과에 따라 균의 증식이 활성화되었으며, 대조군과 비교하여 생육저해 효과를 보이지 않았다. 일반적으로 낮은 농도의 추출물에서도 대조군에 비해 균의 생육이 저해되지만, 시간이 경과함에 따라 생육저해 효과보다는 추출물의 기타 성분이 균의 생육을 촉진시킨다는 보고26-28)와 같이, 본 연구에서도 일정 농도 범위에서 균의 생육을 촉진시키는 추출물의 미지 성분이 포함된 것으로 생각된다.
- 25 mg/ml 보다 더 클수록 대조군보다 균의 증식 억제 효과가 크게 증가되었다. 표고버섯 acetone 추출물에서는 낮은 농도에서 균의 증식이 대조군보다 약간 증가하였으며 12.5 mg/ml 이상의 농도에서는 대수기에서 대조군과 비교하여 A. viscosus 의 큰 생육억제 효과를 확인하였다.
- 0 mm) 순으로 항균활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 표고버섯의 acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물은 A. viscosus에 대한 생육저해환의 크기가 다른 균에 비해 크게 나타났다.
- Acetone, ethanol 및 ethyl acetate 등의 유기용매로 추출된 표고버섯 추출물의 구강세균에 대한 항균효과를 디스크 확산법을 이용하여 9종의 구강세균에 대하여 조사하였으며, 얻어진 결과를 [Table 2]에 나타내었다. 표고버섯의 ethanol 추출물에서는 모든 실험 균주에 대하여 항균활성이 관찰되지 않았으나, acetone 및 ethyl acetate 추출물에서는 9종의 구강세균 중 S. aureus, S. sanguinis, A. viscosus, 및 A. actinomycetemcomitans 등에서 항균활성을 확인할 수 있었다. Acetone 추출물의 경우 A.
- 표고버섯의 ethyl acetate 추출물은 낮은 농도에서도 균의 생육억제 효과가 나타났고, 3.125 mg/ml∼25.0 mg/ml에서 균의 증식을 크게 억제하였다.
- [Table 3]과 [Table 4]에 보인바와 같이 표고버섯 추출물을 첨가한 각 배양액에서 추출물의 농도에 따라 다양한 생육저해작용을 나타내었다. 표고버섯의 ethyl acetate 추출물을 첨가하지 않은 대조군에서 균이 완만하게 증식되었다. Ethyl acetate 추출물은 배양 초기에는 균의 증식이 다소 증가하여 균의 생육저해 효과를 보이지 않았으나, 25.
후속연구
- viscosus의 생육저해 효과를 추가로 확인하였으며, 이는 표고버섯 추출물이 치아우식증 뿐만 아니라, 치주염을 유발하는 세균에도 항균효과가 있음을 보여주는 의미 있는 결과이다. 따라서 앞으로 표고버섯으로부터 구강세균의 항균효과를 나타내는 물질을 확인하여야 할 것이며, 용매에 따라 추출되는 생리활성 관련 물질을 분리 및 분석하는 연구 등이 수행되어야 할 것이다.
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