고체상 추출법(SPE: Solid Phase Extraction)을 이용한 국내 사과주스 중 Patulin 간편.신속 분석방법 Rapid and Simple Analytical Method for Removing Patulin from Apple Juice Using Solid Phase Extraction원문보기
Patulin은 곰팡이의 이차 대사산물로 주로 썩은 사과의 병반에서 발견된다. 사과주스 중에 포함된 patulin에 대한 실험법은 LLE법을 이용한 방법이 대부분이다. 이를 대체하기 위해 SPE 법을 통한 사과주스 중 patulin 분석법을 본 연구에서 시행하였다. 시료인 사과주스를 다공성 중합체인 고체상 카트리지에 주입한 후 1% sodium bicarbonate 용액 5 mL와 1% acetic acid 5 mL를 차례로 흘려 방해물질 등을 제거해준 다음 정제가 끝난 카트리지를 상온에서 1시간 정도 방치한 후 ethyl acetate/ethyl ether 5 mL를 이용해 추출하였다. 추출된 용액을 질소 농축기를 이용해 완전 농축한 후 1% acetic acid 용액 0.5 mL를 넣고 혼합 후 syringe filter로 여과하여 amber vial에 보관하여 분석에 사용하였다. HPLC 분석에 사용된 이동상은 THF 8 mL를 1 L 정용 플라스크에 넣고 물로 채워 사용하였다. HPLC 분석조건은 이동상을 0.7 mL/min 유속으로 흘려 276 nm에서 흡광도를 측정하였고, 샘플주입은 $20\;{\mu}g/L$로 하였다. LOD는 30 ng/mL 수준이었다. 실험 결과 SPE 법은 기존의 식품공전시험법(LLE)보다 분석시간이 1/3로 줄어들었고, 적은 양의 용매만으로 추출 및 정제가 가능하였으며 실험과정이 간단하여 공전의 방식보다 손쉽게 분석할 수 있었다. 특히, strata-X를 통한 SPE 추출방법은 재연성과 회수율 또한 우수해 저 농도 분석에도 적합하였다. 이와 같이 기존 분석법에 비해 신속하고 간소하며 정확한 정량분석 및 우수한 회수율과 신뢰도를 얻을 수 있어 다량의 분석을 요하는 연구기관 및 단체에 매우 효율적일 것으로 사료된다.
Patulin은 곰팡이의 이차 대사산물로 주로 썩은 사과의 병반에서 발견된다. 사과주스 중에 포함된 patulin에 대한 실험법은 LLE법을 이용한 방법이 대부분이다. 이를 대체하기 위해 SPE 법을 통한 사과주스 중 patulin 분석법을 본 연구에서 시행하였다. 시료인 사과주스를 다공성 중합체인 고체상 카트리지에 주입한 후 1% sodium bicarbonate 용액 5 mL와 1% acetic acid 5 mL를 차례로 흘려 방해물질 등을 제거해준 다음 정제가 끝난 카트리지를 상온에서 1시간 정도 방치한 후 ethyl acetate/ethyl ether 5 mL를 이용해 추출하였다. 추출된 용액을 질소 농축기를 이용해 완전 농축한 후 1% acetic acid 용액 0.5 mL를 넣고 혼합 후 syringe filter로 여과하여 amber vial에 보관하여 분석에 사용하였다. HPLC 분석에 사용된 이동상은 THF 8 mL를 1 L 정용 플라스크에 넣고 물로 채워 사용하였다. HPLC 분석조건은 이동상을 0.7 mL/min 유속으로 흘려 276 nm에서 흡광도를 측정하였고, 샘플주입은 $20\;{\mu}g/L$로 하였다. LOD는 30 ng/mL 수준이었다. 실험 결과 SPE 법은 기존의 식품공전시험법(LLE)보다 분석시간이 1/3로 줄어들었고, 적은 양의 용매만으로 추출 및 정제가 가능하였으며 실험과정이 간단하여 공전의 방식보다 손쉽게 분석할 수 있었다. 특히, strata-X를 통한 SPE 추출방법은 재연성과 회수율 또한 우수해 저 농도 분석에도 적합하였다. 이와 같이 기존 분석법에 비해 신속하고 간소하며 정확한 정량분석 및 우수한 회수율과 신뢰도를 얻을 수 있어 다량의 분석을 요하는 연구기관 및 단체에 매우 효율적일 것으로 사료된다.
Patulin, a secondary metabolite of mold, is commonly found in rotten apples. Many countries regulate patulin at levels ranging from 30 to $50\;{\mu}g/L$. Most analytical methods for removing patulin from apple juice include liquid-liquid extraction (LLE), which is time and labor intensive...
Patulin, a secondary metabolite of mold, is commonly found in rotten apples. Many countries regulate patulin at levels ranging from 30 to $50\;{\mu}g/L$. Most analytical methods for removing patulin from apple juice include liquid-liquid extraction (LLE), which is time and labor intensive. To replace the LLE method, a solid-phase extraction (SPE) method has been developed for apple juice and unfiltered apple juice. A portion of the test sample was applied to a macroporous copolymer cartridge and washed with 5 mL of 1% sodium bicarbonate, followed by 5 mL of 1% acetic acid. Patulin was eluted with 5 mL of 2% acetonitrile in anhydrous ethyl ether. The mobile phase was tetrahydrofuran in water (0.8:99.2) and was detected with a UV detector at 276 nm. Recoveries ranged from 95 to 101% in test samples, and the minimum detectable level was 30 ppb. Because this SPE method is fast, easy, reliable, and inexpensive, it could be applicable for companies or analytical agencies to analyze patulin concentrations in apple juice.
Patulin, a secondary metabolite of mold, is commonly found in rotten apples. Many countries regulate patulin at levels ranging from 30 to $50\;{\mu}g/L$. Most analytical methods for removing patulin from apple juice include liquid-liquid extraction (LLE), which is time and labor intensive. To replace the LLE method, a solid-phase extraction (SPE) method has been developed for apple juice and unfiltered apple juice. A portion of the test sample was applied to a macroporous copolymer cartridge and washed with 5 mL of 1% sodium bicarbonate, followed by 5 mL of 1% acetic acid. Patulin was eluted with 5 mL of 2% acetonitrile in anhydrous ethyl ether. The mobile phase was tetrahydrofuran in water (0.8:99.2) and was detected with a UV detector at 276 nm. Recoveries ranged from 95 to 101% in test samples, and the minimum detectable level was 30 ppb. Because this SPE method is fast, easy, reliable, and inexpensive, it could be applicable for companies or analytical agencies to analyze patulin concentrations in apple juice.
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문제 정의
가장 흔히 사용되고 있는 AOAC 분석법도 ethyl acetate로 patulin을 추출하고 sodium bicarbonate 용액으로 분획하는 LLE 법이다(14). 따라서 본 연구에서는 이미 알려진 LLE 법에 비해 좀 더 효율적인 전처리 조건을 탐색하고자 하였다. 이를 위해 시중에 유통되는 국내 사과주스 3가지를 대상으로 식품공전상의 일반 LLE 법과, 두 가지의 SPE cartridge(Strata/Merck)를 이용한 전처리법 비교 연구를 시행하였다.
제안 방법
6×250 mm, 5 µm) column을 택하여 사용하였다. Mobile phase(THF 8 mL/water 1 L)는 0.7 mL/min 유속으로 흘려 276 nm에서 흡광도를 측정하였고(Table 1), patulin peak의 면적 대 patulin 농도의 표준곡선을 이용하여 patulin 함량을 계산하였다.
Shiseido HPLC Nanospace SI-2와 Shiseido Nanospace 3002 UV Detector를 사용하여 분석하였으며, column은 Shiseido사의 C18(4.6×250 mm, 5 µm) column을 택하여 사용하였다.
이를 대체하기 위해 SPE 법을 통한 사과주스 중 patulin 분석법을 본 연구에서 시행하였다. 시료인 사과주스를 다공성 중합체인 고체상 카트리지에 주입한 후 1% sodium bicarbonate 용액 5 mL와 1% acetic acid 5 mL를 차례로 흘려 방해물질 등을 제거해준 다음 정제가 끝난 카트리지를 상온에서 1시간 정도 방치한 후 ethyl acetate/ethyl ether 5 mL를 이용해 추출하였다. 추출된 용액을 질소 농축기를 이용해 완전 농축한 후 1% acetic acid 용액 0.
따라서 본 연구에서는 이미 알려진 LLE 법에 비해 좀 더 효율적인 전처리 조건을 탐색하고자 하였다. 이를 위해 시중에 유통되는 국내 사과주스 3가지를 대상으로 식품공전상의 일반 LLE 법과, 두 가지의 SPE cartridge(Strata/Merck)를 이용한 전처리법 비교 연구를 시행하였다.
대상 데이터
Louis, MO, USA)에서 구입하였고, ethyl acetate(HPLC grade), water(HPLC grade), acetic acid, acetonitrile, tetrahydrofuran(THF, HPLC grade)은 Burdick & Jackson 사 제품(Muskegon, MI, USA)을 사용하였다. Sodium bicarbonate와 메탄올은 Wako사(Wako, Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.
실험에 사용한 patulin 표준물질은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, ethyl acetate(HPLC grade), water(HPLC grade), acetic acid, acetonitrile, tetrahydrofuran(THF, HPLC grade)은 Burdick & Jackson 사 제품(Muskegon, MI, USA)을 사용하였다.
실험에 사용한 사과 주스는 제품명이 다른 3개 제품으로 모두 과즙함량이 100%인 국내산 제품을 대형 마트에서 구입하여 사용하였으며, 냉장(5℃) 보관하였다.
SPE 방법은 LLE 방법과 비교 시 정제율이 동일하거나 비슷한 수준으로 처리시간이 짧으며, 조작이 간편하다는 이점으로 다량의 시료를 신속하고 정확하게 처리해야 하는 식품 및 환경 분야 등에서 많이 사용되고 있다. 현재 약 200여종의 SPE cartridge가 출시되어 있는데 그 중 Phenomenex사의 Strata-X 시리즈와 Merck 사의 Extrelut NT 20을 사용하여 실험을 진행하였다. Strata-X의 경우 일반 SPE 방법과 동일하게 안정화 및 세척과정을 거쳐 추출 및 정제가 진행되는데 초당 1-2방울의 속도로 추출을 하기 위해선 vacuum pump나 syringe를 cartridge에 연결하여 압력을 가해 주어야 한다(19).
이론/모형
1. HPLC chromatogram of patulin in apple juice using LLE method. (A) standard, (B) apple juice I, (C) apple juice II and (D) apple juice III.
Fig 3. HPLC chromatogram of patulin in apple juice using SPE (Extrelut-NT20) method. (A) standard, (B) apple juice I, (C) apple juice II and (D) apple juice III.
2. HPLC chromatogram of patulin in apple juice using SPE (strata-x) method. (A) standard, (B) apple juice I, (C) apple juice II and (D) apple juice III.
사과주스 중에 포함된 patulin에 대한 실험법은 LLE법을 이용한 방법이 대부분이다. 이를 대체하기 위해 SPE 법을 통한 사과주스 중 patulin 분석법을 본 연구에서 시행하였다. 시료인 사과주스를 다공성 중합체인 고체상 카트리지에 주입한 후 1% sodium bicarbonate 용액 5 mL와 1% acetic acid 5 mL를 차례로 흘려 방해물질 등을 제거해준 다음 정제가 끝난 카트리지를 상온에서 1시간 정도 방치한 후 ethyl acetate/ethyl ether 5 mL를 이용해 추출하였다.
성능/효과
3.0×250 mm C18 column을 사용했을 경우 patulin의 검출시간이 6-7분 수준으로 구경이 큰 4.6×250 mm C18 column과 비교 시 7분 정도 검출시간(RT)이 빠른 것을 확인할 수 있었다.
4.6×250 mm C18 column을 사용하여 분석한 경우 그래프 상에 patulin이 약 13-15분 사이에 나타났으며, HMF와는 1분 정도 검출시간의 차이를 보여 정확한 분석 값을 얻을 수 있었다(Fig. 4).
0 ng/mL 농도로 측정되었다. HPLC를 통한 분석 시 mobile phase의 tetrahydrofuran(THF) 첨가 비율에 따라 검출시간이 차이를 보였는데 조성을 달리하며 실험한 결과 3차 증류수에 THF 8 mL를 용해시켜 1 L로 정용했을 때 가장 이상적인 chromatogram pattern을 보였다.
6×250 mm C18 column을 사용하였다. LLE와 SPE를 이용한 분석법의 상대회수율은 LLE 추출의 경우 92-106%, SPE 추출의 경우 strata-X가 96-101% Extrelut-NT20이 95-101% 수준으로 모두 대상물질 회수율 승인기준(acceptance criteria) 범위를 만족시키는 것으로 나타났다(Table 1). 그리고 SPE를 이용한 분석 값의 표준편차는 strata-X가 1.
Patulin 표준물질에 대한 검량곡선은 정량 범위 내에서 상관계수(R2) 0.9998 이상의 직선성을 보였으며, 검출한계는 30.0 ng/mL 농도로 측정되었다. HPLC를 통한 분석 시 mobile phase의 tetrahydrofuran(THF) 첨가 비율에 따라 검출시간이 차이를 보였는데 조성을 달리하며 실험한 결과 3차 증류수에 THF 8 mL를 용해시켜 1 L로 정용했을 때 가장 이상적인 chromatogram pattern을 보였다.
LLE와 SPE를 이용한 분석법의 상대회수율은 LLE 추출의 경우 92-106%, SPE 추출의 경우 strata-X가 96-101% Extrelut-NT20이 95-101% 수준으로 모두 대상물질 회수율 승인기준(acceptance criteria) 범위를 만족시키는 것으로 나타났다(Table 1). 그리고 SPE를 이용한 분석 값의 표준편차는 strata-X가 1.2-9.7%, Extrelut-NT20이 4.7-12.1% 수준이었다. 정밀도의 경우 strata-X가 1.
본 연구에서도 시험관을 사용한 반복적인 추출조작을 통하여 방해물질을 제거함으로써 정확도와 회수율이 높은 HPLC 분석결과를 얻을 수 있었다. 본 연구에서도 LLE 방법을 이용한 사과주스 중 patulin 분석 시 주스에 첨가한 patulin 표준물질 200 ng/mL 및 500 ng/mL에 대해 92-106%의 회수율을 보였고(Table 2), 실험에 사용한 국내 사과주스(과즙함량 100%)의 분석 결과 또한 patulin이 검출되는 13-15분 사이 방해되는 peak가 검출되지 않아 정제가 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). Patulin이 검출되는 시간에 주스성분과의 분리가 용이하기 위해서 추출 정제 과정이 중요하다고 보고되었다(17).
LLE 방법은 앞서 언급한 바와 같이, 혼합되어 있는 오염물과 원하고자 하는 물질을 분리하는데 유용한 방법으로써 곰팡이 독(mycotoxin), Polycyclic Aromatic Hydrocarbons(PAHs) 및 여러가지 수용성 물질의 실험법으로 널리 이용되고 있다. 본 연구에서도 시험관을 사용한 반복적인 추출조작을 통하여 방해물질을 제거함으로써 정확도와 회수율이 높은 HPLC 분석결과를 얻을 수 있었다. 본 연구에서도 LLE 방법을 이용한 사과주스 중 patulin 분석 시 주스에 첨가한 patulin 표준물질 200 ng/mL 및 500 ng/mL에 대해 92-106%의 회수율을 보였고(Table 2), 실험에 사용한 국내 사과주스(과즙함량 100%)의 분석 결과 또한 patulin이 검출되는 13-15분 사이 방해되는 peak가 검출되지 않아 정제가 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다(Fig.
LOD는 30 ng/mL 수준이었다. 실험결과 SPE 법은 기존의 식품공전시험법(LLE)보다 분석시간이 1/3로 줄어들었고, 적은 양의 용매만으로 추출 및 정제가 가능하였으며 실험과정이 간단하여 공전의 방식보다 손쉽게 분석할 수 있었다. 특히, strata-X를 통한 SPE 추출방법은 재연성과 회수율 또한 우수해 저 농도 분석에도 적합하였다.
Strata-X의 경우 일반 SPE 방법과 동일하게 안정화 및 세척과정을 거쳐 추출 및 정제가 진행되는데 초당 1-2방울의 속도로 추출을 하기 위해선 vacuum pump나 syringe를 cartridge에 연결하여 압력을 가해 주어야 한다(19). 이 실험에서는 vacuum pump를 이용하여 추출 및 정제를 수행하여 신속한 분석이 가능하였다. 국내 사과주스 A, B, C를 분석한 결과 patulin 오염도는 각각 1.
특히, strata-X를 통한 SPE 추출방법은 재연성과 회수율 또한 우수해 저 농도 분석에도 적합하였다. 이와 같이 기존 분석법에 비해 신속하고 간소하며 정확한 정량분석 및 우수한 회수율과 신뢰도를 얻을 수 있어 다량의 분석을 요하는 연구기관 및 단체에 매우 효율적일 것으로 사료된다.
실험결과 SPE 법은 기존의 식품공전시험법(LLE)보다 분석시간이 1/3로 줄어들었고, 적은 양의 용매만으로 추출 및 정제가 가능하였으며 실험과정이 간단하여 공전의 방식보다 손쉽게 분석할 수 있었다. 특히, strata-X를 통한 SPE 추출방법은 재연성과 회수율 또한 우수해 저 농도 분석에도 적합하였다. 이와 같이 기존 분석법에 비해 신속하고 간소하며 정확한 정량분석 및 우수한 회수율과 신뢰도를 얻을 수 있어 다량의 분석을 요하는 연구기관 및 단체에 매우 효율적일 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Patulin 분석을 위한 전처리 방법 중 LLE(liquidliquid extraction) 법의 단점은 무엇인가?
Patulin 분석을 위한 전처리 방법 중 LLE(liquidliquid extraction) 법은 혼합되어 있는 오염물과 원하고자 하는 물질을 분리하는데 유용한 방법으로써 각종 용매에 대한 시료의 용해도 차이를 이용한 방법이다. 하지만 이 방법은 많은 양의 유기용매가 필요해 유기용매의 소모로 인한 경제적인 문제와 환경오염과 관련된 문제가 발생될 수 있으며, 실험자가 유기용매에 노출될 가능성이 클 뿐만 아니라 시간소모가 큰 단점을 갖고 있다(11). SPE(solid-phase extraction)는 liquid 형태의 시료를 solid phase(고체상)에 흘려주어 용질을 흡착시킨 후 원하는 용질만을 선택적으로 탈착시키는 전처리 방법이다.
Patulin이란 무엇인가?
Patulin은 곰팡이의 이차 대사산물로 주로 썩은 사과의 병반에서 발견된다. 사과주스 중에 포함된 patulin에 대한 실험법은 LLE법을 이용한 방법이 대부분이다.
곰팡이에 의한 독소 중 특히 문제가 되고 있는 것은 무엇인가?
현재까지 약 300-400 종류의 곰팡이 독소가 알려져 있지만, 식품이나 사료 등에 존재하며 잠재적으로 인체에 유해한 영향을 줄 수 있는 곰팡이 독소는 10-20 종류가 있다(3). 곰팡이에 의한 독소 중 특히 문제가 되고 있는 것은 aflatoxin, ochratoxin A, sterigmatocystin, patulin, penicillic acid, citrinin, zearalenone, trichothecenes(T-2 toxin) 등을 들 수 있다(4). 이중 patulin(2-Hydroxy-3,7-dioxabicyclo[4.
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